含有酶和抑制剂的水溶性膜的制作方法
【专利说明】含有酶和抑制剂的水溶性膜
[000。 发明背景 发明领域
[0002] 本发明设及包括蛋白酶抑制剂的酶水溶性膜及其在洗涂剂中的用途。
[000引背景
[0004] 水溶性膜包装用于递送单位剂量的洗涂剂产品（用于例如衣物洗涂和自动餐具 洗涂）的用途是众所周知的（参见例如W0 2009/098660或W0 2010/141301)。颗粒和液 体洗涂剂处于运种形式已经在市场上若干年了。在衣物洗涂剂中使用酶也众所周知几十年 了。越来越多不同类型的酶被用在洗涂剂中，并且运些酶的剂量也在增加，尤其归因于来自 运些酶的益处和使用生物活性物而不是像大部分表面活性剂的例如基于油的化学品的环 境益处。
[0005] 当在洗涂剂中使用酶时，一个潜在问题是酶的储存稳定性。酶是大生物分子，可经 受各种形式的降解。为了克服运个问题，众多解决方案已被提出并获得专利，设及设计更稳 健的酶和制备对运些酶更少苛刻的洗涂剂配制品两者。对于单位剂量系统像洗涂剂袋或片 来说，将运些酶在不同的隔室或层中与更苛刻的化学品（例如漂白剂）分开通常是有用的。 然而，运使制造过程复杂化，并增加了成本。先前建议将运些酶渗入水溶性膜围绕洗涂剂袋 (例如US4, 115, 292)。
[0006] 即使当酶受到保护不受洗涂剂组合物中的化学品影响时，膜内的其它酶（特别是 蛋白酶）也可能影响运些酶在储存期间的稳定性。储存稳定性不是唯一的问题。在膜的生 产过程中，运些酶在用于制备（诱铸）该膜的液体中具有活性，而且由蛋白酶展示出的蛋白 水解活性将负面影响最终膜产品中的所有酶的残余活性。当处理来自切割步骤的膜边料W 用于在诱铸新膜中再利用时，运是特别重要的。
[0007] 本发明提供了一种既用于增加水溶性膜中的酶的储存稳定性又用于增加水溶性 膜中的酶的残余活性的解决方案。
[000引发明概述
[0009] 在第一方面中，本发明提供了一种包括蛋白酶和蛋白酶抑制剂的水溶性膜。
[0010] 在详细说明、实例和权利要求中各个其他方面和实施例是明显的。
[0011] 发明的详细说明
[0012] 本发明的诸位发明人已经出人意料地发现，渗入一种水溶性膜中的酶的储存稳定 性可W通过在该膜中包括一种蛋白酶抑制剂来改善，该水溶性膜包含至少一种蛋白酶。即 使该膜中的水活度非常低，并且因此酶活性也非常低，蛋白酶活性也影响该膜中的蛋白酶 和其他酶两者的储存稳定性。运是一个出人意料的发现，因为蛋白酶（W及其他水解酶） 需要水来展示蛋白水解（水解）活性。
[0013] 在该水溶性膜中纳入一种蛋白酶抑制剂将进一步保护蛋白酶敏感组分，作为洗涂 剂组合物中的基于蛋白或肤的材料，对抗在膜与洗涂剂组合物之间的界面处展示出的蛋白 酶活性。
[0014] 另外，诸位发明人已经发现通过在一种水溶性膜中包括一种蛋白酶抑制剂，该水 溶性膜包含至少一种蛋白酶，在该膜的生产过程中可W减少酶活性的损失。在生产过程中， 该膜制备自一种液体组合物，其中该蛋白酶针对其他蛋白酶（自我蛋白水解）并且针其他 其他酶和蛋白展示出蛋白水解活性。因此，本发明提供了生产后水溶性膜中的酶的更高残 余活性。
[0015]酶
[0016] 在本发明的含有酶和抑制剂的水溶性膜中包括的运种或运些酶包括至少一种蛋 白酶，W及任选地一种或多种（其他）酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、碳水化合物 分解酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、过水解酶、氧 化酶，例如漆酶、过氧化物酶和/或面代过氧化物酶。
[0017]軍白酶：用于在本发巧中值用的軍白酶可W是丝氨酸軍白酶，例如枯草杆荫軍白 酶和/或膜蛋白酶样蛋白酶；或金属蛋白酶。优选地，蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。
[0018] 丝氨酸蛋白酶可W例如是S1家族（如膜蛋白酶）或S8家族（如枯草杆菌蛋白 酶）。金属蛋白酶可W例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来 自M5、M7或M8家族的那些。
[0019] 丝氨酸蛋白酶是催化肤键水解并且在活性位点处存在一个必需丝氨酸残基的酶 (怀特（White)、汉德勒（Handler)和史密斯（Smith)，1973，"生物化学原理（Principlesof Biochemistry)"，第五版，麦格劳-希尔图书公司（McGraw-HillBookCompany),纽约，第 271-272页）。枯草杆菌蛋白酶包括I-S1和I-S2亚组，优选地由其构成，正如西仁（Siezen) 等人，蛋白质工程（ProteinE：ngng.) 4 (1991) 719-737;和西仁等人，蛋白质科学（Protein Science)6(1997)501-523所定义。由于丝氨酸蛋白酶的活性位点的结构高度保守，根据本 发明的枯草杆菌蛋白酶可W在功能上相当于由西仁（Siezen)等人（同上）提出的指定亚 组的枯草杆菌酶（subtilase)。
[0020] 枯草杆菌蛋白酶可W是动物、植物或微生物来源的，包括化学或基因修饰的突变 体（蛋白质工程变体），优选为碱性微生物枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶的实例是源 自芽胞杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋 白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147W及枯草杆菌蛋白酶168 (描述于W0 89/06279 中）W及蛋白酶PD138(W0 93/18140)。实例描述于W0 98/020115、W0 01/44452、 WO01/58275、WO01/58276、WO03/006602W及WO04/099401 中。膜蛋白酶样蛋白酶的 实例是膜蛋白酶（例如，猪或牛来源的）W及在W0 89/06270和W0 94/25583中描述的镶 抱属蛋白酶。其他实例为在W0 92/19729、W0 88/08028、W0 98/20115、W0 98/20116、W0 98/34946、W0 2000/037599、W0 2011/036263中描述的变体，尤其是在一个或多个W下位 置中具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、 224、235W及 274。
[0021] 可商购的蛋白酶（其中大部分为枯草杆菌蛋白酶）的实例包括Kannase?、 Everlase?、Relase?、Esperase?、Alcalase?、Durazym?、Savinase?、Ovozyme?、 Liquanase?、Coronase?、Polarzyme?、Pyrase?、NeutraseTM、PancreaticTrypsin NOVO(PTN)、Bio-Feed?Pro、Clear-Lens?ProW及Blaze(所有都可从丹麦己格斯瓦尔 德的诺维信公司（NovozymesA/巧获得）。其他可商购的蛋白酶包括Ronozyme?Pro、 M曰X曰t曰se?、M曰X曰c曰1?、M曰X曰pem?、Opticle曰n?、Proper曰se?、Pur曰f曰st?、Pur曰feet?、 化rafectOx?、化rafactPrime?、Excellase?、FN2?、FN3?和FN4 ?(可从杰能科国际 公司（GenencorInternationalInc.)、杜邦公司（DuF*ont)、吉斯特?布罗卡德斯公司 (Gist-Brocades)、BASF公司或DSM公司获得）。其他实例是Primase?和Duralase?。可 从汉高公司Ofenkel)获得的BlapR、BlapS和BlapX也是实例。
[0022] 迂進盡座:适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或 蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽抱杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、 镶抱属、梭抱壳属、枝顶抱霉属的纤维素酶，例如，从在US4, 435, 307、US5, 648, 263、US 5, 691，178、US5, 776, 757W及W0 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镶抱产 生的真菌纤维素酶。
[0023] 尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤 维素酶的实例是描述于EP0 495 257、EP0 531 372、W0 96/11262、W0 96/29397、W0 98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在W0 94/07998、EP0531315、 US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、W0 95/2447UW0 98/12307W及PCT/DK 98/00299中描述的那些。
[0024] 可商购的纤维素酶包括Celluzyme?、Carezyme?和Celluclean?产品（诺维信公 司）；Clazinase?和化radaxHA?(杰能科国际公司）、W及KAC-50(KB)?(花王株式会社 (KaoCorporation))。
[00巧]脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶巧巧细荫或真荫夹源的那塔。包括化 学修饰的或蛋白质工程化的突变体。实例包括来自嗜热真菌属（Thermomyces)的脂肪酶， 例如来自如在EP258 068和EP305 216中描述的疏棉状嗜热丝抱菌灯.lanuginosus) (之前命名为柔毛腐质霉）；来自腐质霉属的角质酶，例如在WO96/13580中描述的特异 腐质霉；一种假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌化alcaligenes)或类产碱假单 胞菌化pseudoalcaligenesHEP218 272)、洋葱假单胞菌（P.C巧acia)(EP331 376)、 斯氏假单胞菌化stutzeriHGB1,372, 034)、蛋光假单胞菌（P.fluorescens)、假单胞菌 属菌株SD705 (W0 95/06720 和W0 96/27002)、威斯康星假单胞菌（P.wisconsinensis) (WO96/12012); -种芽抱杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽抱杆菌（达托斯值artois)等人， 1993,生物化学与生物物理学学报度iochemicaetBio地ysicaActa) ,1131:253-360)、嗜 热脂肪芽杆菌（JP64/744992)或短小芽抱杆菌（WO91/16422)。
[0026]其他实例是脂肪酶变体，例如W0 92/05249、W0 94/01541、EP407 225、EP260 105、W0 95/3538UW0 96/00292、W0 95/30744、W0 94/25578、W0 95/14783、W0 95/22615、 WO97/04079、W0 97/07202、W0 00/060063、W02007/087508W及WO2009/109500 中描述的 那些。
[0027]优选的可商购的脂肪酶包括Lipolase?、Lipolase叫tra?、Lipex?、Lipex Evity?、Calipso?、Lecitase?、Lipolex?、Lipoclean?、Lipoprime? (诺维信公司）。其他 可商购的脂肪酶包括Lumafast(杰能科国际公司）；Lipomax(吉斯特?布罗卡德斯公司/ 杰能科国际公司）和来自苏威（Solvay)的芽抱杆菌属脂肪酶。
[0028]淀粉酶：适合的淀粉酶(a和/或P)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修 饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽抱杆菌属获得的a-淀粉酶，例如，在 GB1，296, 839中更详细描述的地衣芽抱杆菌的特定菌株。
[0029]有用的淀粉酶的实例是在W0 94/02597、W0 94/18314、W0 96/23873W及W0 97/43424中描述的变体，尤其是在一个或多个W下位置上具有取代的变体：15、23、105、 106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408 及 444。
[0030]可商购的淀粉酶是Duramyl?、Termamyl?、Stainzyme?、StainzymePlus?、 Resiliance?、Everest?、化talase?、F'ungamylTMW及BAN?(诺维信公司）；Rapidase?和 化rastar?(来自杰能科国际公司）。
[0031]氧化酶/过氧化物酶：适合的氧化酶和过氧化物酶(或氧化还原酶）包括各种糖 氧化酶、漆酶、过氧化氨酶W及面代过氧化物酶。
[0032] 合适的过氧化物酶包括那些由国际生物化学与分子生物学联合会（IUBMB)命名 委员会陈述的酶分类EC1. 11. 1. 7包括的过氧化物酶，或源自其中的展示出过氧化物酶活 性的任何片段。
[0033] 适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白 质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞 杞^116'6曰）的过氧化物酶巧？ 179,486)，及其变体，如在胖0 93/24618、胖0 95/10602 ^及 W0 98/15257中描述的那些。
[0034] 用于在本发明中使用的过氧化物酶还包括面代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、 漠过氧化物酶W及展示出氯过氧化物酶或漠过氧化物酶活性的化合物。根据其对面素离子 的特异性将面代过氧化物酶加W分类。氯过氧化物酶化C. 1. 11. 1. 10)催化从氯根离子形 成次氯酸盐。
[0035] 在一个实施例中，该面代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地，该面代过氧化物酶 是饥面代过氧化物酶，即含饥酸盐的面代过氧化物酶。在本发明的一个优选方法中，将含饥 酸盐的面代过氧化物酶与氯根离子来源组合。
[0036] 已经从许多不同真菌，特别是从暗色丝抱菌（dematiaceoushyphomycete) 真菌组中分离出了面代过氧化物酶，比如卡尔黑霉属（化Idariomyces)(例如煤卡尔 黑霉（C.fumago))、链格抱属、弯抱属（例如痛枝弯抱（C.verruculosa)和不等弯抱 (C.inaequalis))、内厮蠕抱属、细基格抱属W及葡萄抱属。
[0037] 还已经从细菌，如假单胞菌属（例如，化咯假单胞菌（P.pyrrocinia))和链霉菌属 (例如，金色链霉菌（S.aureofaciens))中分离出了面代过氧化物酶。
[0038] 在一个优选实施例中，该面代过氧化物酶可源自弯