专利名称：一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法，可用于药物的筛选。
背景技术：
乙型脑炎病毒不仅引起人的中枢神经系统疾病，还可引起猪的繁殖障碍性疾病，是一种重要的人畜共患传染病病原。乙型脑炎病毒主要侵入神经系统，包括丘脑，基底神经节，脑干，小脑，大脑皮层和脊髓，导致严重的中枢神经系统疾病，例如脊髓灰质炎样严重瘫痪，无菌性脑膜炎和脑炎，71%的患者都是基底神经节和丘脑损伤，严重出现运动障碍，43%患者脑干损伤，经常出现急性呼吸衰竭症状，甚至死亡。患者的病死率与临床症状高达 10% 50%，而且大约一半乙型脑炎病毒感染幸存者都有严重的神经后遗症。在亚洲每年大约50，000乙脑病例中就有15，000例死亡。2006年7月山西发生日本乙型脑炎流行，共60多人发病，其中19人死亡，造成了较大的社会影响。目前已研制出乙型脑炎病毒的弱毒疫苗和灭活疫苗，具有较好的免疫效果，但仍有免疫失败的报道。同时，日本乙型脑炎发病后在脑中复制，给病人造成不可逆的智力损伤，如果能使用药物对该病起到一定的早期预防和治疗效果，则对于该病的治疗手段的研究具有重大意义。而目前仍未有关于乙型脑炎病毒药物及其筛选方法的报道。乙型脑炎病毒病毒NS3的C端440个氨基酸为解旋酶和NTP酶，它可以利用水解ATP释放的能量，将病毒在复制过程中形成的RNA双链解旋。解旋酶是乙型脑炎病毒的复制所必需，该酶失去活性后病毒增殖停止，因此成为良好的抗病毒靶标。根据解旋酶的酶活性特征，具有多种靶向药物筛选与设计的策略，如a.阻止ATP的结合；b.阻止RNA底物的结合；c.阻止解旋酶的空间变构。Borowski P等(2002)合成了一种环扩大核苷(ring-expanded nucleoside),对于西尼罗病毒解旋酶具有一定的抑制活性(IC50=25-30uM)。Kaczor A等(2010)根据日本乙型脑炎病毒的解旋酶结构，建立了一个基于酶结构的药效团模型，用该模型对116万个化合物进行了虚拟筛选，发现了 15个化合物具有较好的结合活性，并且预测了其可以通过血脑屏障，但未进行酶抑制活性的试验研究。但是，到目前为止针对乙型脑炎病毒解旋酶的药物设计模型仍然没有建立，也未见针对乙型脑炎病毒解旋酶的药物报道。本发明建立了一种针对乙型脑炎病毒解旋酶的药物筛选模型，应用该模型可在蛋白水平进行高通量、低成本的进行乙型脑炎抗病毒药物筛选，为乙型脑炎病毒的药物发现提供了一种手段。
发明内容
本发明的目的是提供了一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法，方法简单，易于操作。解旋酶是乙型脑炎病毒基因组编码的一种功能蛋白，该蛋白负责将病毒复制过程中形成的基因组RNA双链解旋，解旋后的正链RNA参与子代病毒的包装过程，如果抑制解旋酶的活性，乙型脑炎病毒的增殖也将受到抑制。本发明是基于解旋酶活性的机制，采用荧光共振能量转移的方法，在两条底物DNA的两端分别标记荧光和淬灭基团，当两条底物形成双链后，荧光基团的能量被淬灭基团吸收，因此体系中不发出荧光。当解旋酶将双链解开后，两个基团在空间上距离变大，荧光基团则发出荧光，荧光强度越高则说明酶活性越高。基于该酶活性的评价体系，进一步建立了抑制剂筛选方法，并进行了初步应用。
为了达到上述目的，本发明采取如下技术措施
一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法，其制备步骤如下
(I)解旋酶蛋白的表达与纯化人工合成乙型脑炎病毒NS3基因(Genbank登录号U47032)，用Nco I和Xho I分别酶切解旋酶片段与大肠杆菌原核表达载体pET30a， T4 DNALigase (TakaRa,大连宝生物工程有限公司)16 °C过夜连接，得到重组质粒 pET30a_helicase,构建好的重组质粒pET30a_helicase转化到大肠杆菌BL21 (DE3)plysS 中进行表达，得到一种解旋酶蛋白，其序列为SEQ ID NO.1所示。收集表达蛋白上清用Ni2+ 亲和纯化，纯化的解旋酶蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定后加甘油至终浓度20%(v/ V)，用BCA法测定浓度，_80°C冻存备用。
用大肠杆菌大量表达解旋酶蛋白，在表达蛋白上带有6 X His标签，收集表达蛋白的上清，用Ni2+亲和层析法纯化解旋酶蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。
(2)解旋酶DNA底物的设计人工合成3条DNA链，分别命名为F、Q、C，序列分别为
F: (Cy5-)TAGTACCGCCACCCTCAGAACCTTTTTTTTTTTTTT ；
Q:GGTTCTGAGGGTGGCGGTACTA-(BHQ2)；
C:TAGTACCGCCACCCTCAGAACC。
其中F和Q、C和Q互补，F带有一段polyT的末端突出，以利于解旋酶的结合并起始反应。
(3)在黑色96孔或384孔板中加入解旋酶蛋白3uM、待筛化合物以及反应缓冲液 (溶解蛋白的缓冲液，即20mM的Tris-base，150mM的Nacl，5%的甘油)，混合孵育5分钟后， 加入F链200nM与Q链240nM，再孵育5分钟，加入C链2. 4uM、15mM Mg2VlOmM的Mn2+和ATP 2mM，置37°C反应90分钟后，在荧光检测仪(TECAN infinite F200多功能酶标仪)中检测体系中的荧光强度。同时设置不加入待筛化合物的对照组(C组)以及不加入底物的对照组 (Cl 组)。
(4)计算化合物抑制率抑制率=1-(实验组荧光平均值-Cl组荧光平均值)+ (C 组荧光平均值-Cl组荧光平均值)。选择抑制率最高的化合物进行抗病毒的研究。
发明人对40种化合物进行了蛋白水平上的筛选，共初步筛得四种能够抑制解旋酶活性的化合物。其分别为
2-[4-(氨基磺酰基)苯胺基]-4-{4-硝基苯基}-N-苯基_1，3_噻唑_5_甲酰胺；
4-( {4-硝基-1H-吡唑-1-基}甲基)-N_ [6_(甲基磺酰基)_1，3_苯并噻唑_2_基] 苯甲酰胺；
3- [5-( {3- [2-( 4-乙氧基)_甲基_2_氧代乙基]_2，4_ 二氧代_1，3_噻唑烷_5_亚基}甲基)-2_呋喃基]苯甲酸；N-[6- ({[ (2-噻吩基羰基)氨基]硫代甲酰基}氨基)-1, 3-苯并噻唑_2_基]丁酰胺；对解旋活性的抑制率分别为30. 52%、56. 29%、39. 83%、55. 63%。与现有技术相比，本发明具有以下优点1.传统解旋酶的检测，主要采用放射性同位素标记，该技术需要放射性防护，产生很多放射性废物，对实验室要求比较高。而且，标记的探针只能使用两周左右，因此该技术已渐渐被淘汰。本发明纯化出的可溶性的活性高的解旋酶蛋白，并在蛋白水平上利用荧光共振能量转移的方法，对最佳酶浓度、最佳底物浓度、最佳二价金属离子浓度、最佳捕获链浓度、最佳ATP浓度、最佳反应反应温度进行了试验，确定了酶活检测的最佳反应体系，该方法简单易行，在普通实验条件即可进行，灵敏度高，成本相对较低，所需样品少，而且可以 对解旋酶反应的过程进行监测。2.本发明中建立的解旋酶抑制剂筛选方法，在细胞外进行，不受细胞状态及细胞中杂蛋白的影响，反应稳定、重复性好，避免了化合物或DMSO对细胞的毒性而造成的试验误差。3.本发明中建立的解旋酶抑制剂筛选方法，使用的解旋酶蛋白为原核表达的可溶性蛋白，使用的底物为合成的短DNA链，筛选的成本非常低廉，同时该筛选体系可在96孔板甚至384孔板中进行微量操作，进一步降低了筛选的成本，可轻易完成高通量的操作。
图1为一种纯化的解旋酶蛋白SDS-PAGE效果示意图经Ni2+亲和纯化后，得到了较高纯度的蛋白图2为一种酶蛋白解旋反应曲线示意中说明反应体系在解旋酶蛋白存时,解旋反应在90min仍保持增长的趋势,反应速度基本保持不变图3为一种不同浓度下解旋酶的解旋活性示意中说明解旋酶蛋白浓度在3uM时检测到的荧光值最高，反应速率最快。图4为一种不同底物浓度下解旋酶的反应曲线示意中说明在荧光底物浓度在200nM，淬灭底物浓度在240nM时解旋反应速率最快。图5为一种反应体系中不同浓度的Mg2+及Mn2+下反应速度示意中说明在15mM的Mg2+或IOmM的Mn2+时解旋酶活性最好，而且相同浓度的离子存在下，Mn2+比Mg2+对解旋酶活性的促进作用更明显。图6为一种反应体系中不同浓度的ATP存在时检测到的荧光值示意中说明在ATP浓度达到2mM时解旋反应速率最快，2mM以后随着ATP浓度的升高，解旋反应速率反而降低。图7为一种反应体系在不同温度下检测到的荧光值示意中说明在37°C的温度下，解旋酶活性最好，解旋反应速率最快。图8为一种反应体系中不同浓度捕获链存在时检测到的突光值不意中说明捕获链在1. 2uM时反应已达到平衡，为保证反应的充分进行，以后的实验中均使用2. 4uM的浓度。图9为一种解旋酶抑制剂筛选的初步应用示意图应用本发明建立的解旋酶抑制剂筛选体系，对40种化合物进行了初步筛选，并得到了 4种具有酶抑制活性的化合物。
具体实施例方式本发明中的实验方法如未特别说明，均为常规实验方法。实施例1:一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型检测条件优化( I)解旋酶蛋白的制备
人工合成乙型脑炎病毒NS3基因(Genbank登录号U47032)，用Nco I和Xho I分别酶切解旋酶片段与大肠杆菌原核表达载体pET30a，T4 DNA Ligase (TakaRa,大连宝生物工程有限公司)16 °C过夜连接，得到重组质粒pET30a_heI icase，构建好的重组质粒pET30a-helicase转化到大肠杆菌BL21 (DE3) PlysS中进行表达。收集表达蛋白上清用Ni2+亲和纯化，纯化的解旋酶蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定后加甘油至终浓度20%(v/v)，用BCA法测定浓度，_80°C冻存备用。(2)底物的设计、合成与制备人工合成3条DNA链，分别为 F:(Cy5-)TAGTACCGCCACCCTCAGAACCTTTTTTTTTTTTTTQ:GGTTCTGAGGGTGGCGGTACTA-(BHQ2)C (捕获链)TAGTACCGCCACCCTCAGAACC。在使用时将带有荧光基团Cy5的DNA底物F与带有淬灭基团BHQ-2的DNA底物Q按照1:1. 2 (摩尔比)比例进行混合，室温放置lOmin，以保证两条链退火完全。(3)Ni2+亲和层析纯化的解旋酶蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定大小正确且纯度较高(图1)。(4)解旋反应在酶蛋白存在下的时间依赖性反应过程设置加入解旋酶实验组和无蛋白的对照组，并依次加入200nM的F链、240nM的Q链、3. 6uM的捕获链(C链)、IOmM的Mn2+，加入2mM ATP起始反应，37°C下检测荧光值，每隔5min检测一次。37°C检测120min，实验结果显示，荧光值在此时间段内仍呈增长趋势(图2)。(5)解旋酶反应最佳蛋白和底物浓度的研究最佳蛋白浓度研究BCA法检测蛋白浓度后，使50uL体系中分别含有0、50、200、500、800、1200、2000、3000nM, 8个不同浓度的蛋白，每个浓度做三个平行。并依次加入200nM的F链，240nM的Q链，3. 6uM的C链，IOmM Mn2+，然后加入2mM ATP起始反应，37°C温箱放置90min后，检测荧光值。实验结果显示，在蛋白浓度达到3uM时，检测到的荧光值最高，反应速率最快，故确定最佳蛋白浓度为3uM (图3)。底物浓度的研究501^体系中分别含有0、20、50、100、200、2501^，6个不同浓度的荧光底物F，每个浓度作三个平行。蛋白浓度为3uM，C链浓度为3. 6uM，加入2mM ATP起始反应，IOmM Mn2+，37°C温箱放置90min后，检测荧光值。实验结果显示200nM时反应速率曲线渐趋于平缓，故最终确定最佳荧光底物(F链)浓度200nM，则淬灭底物(Q链)浓度240nM(图 4)。
(6)解旋酶反应最佳Mg2+或者Mn2+浓度的研究
本次研究共做两组，一组含有Mg2+，另一组含有Mn2+。50uL体系中Mg2+ (或Mn2+) 浓度分别为0，2. 5，5，7. 5，10，15，20，25，每个浓度作三个平行。体系中蛋白浓度为3uM， 200nM的F链，240nM的Q链，3. 6uM的C链，加入2mM ATP起始反应，37°C温箱放置90min 后，检测突光值。最终确定最佳Mg2+浓度为15mM,最佳Mn2+浓度为IOmM,而且相同浓度下， Mn2+比Mg2+对解旋酶的活性促进作用更明显，在以后的实施例中，若无特别说明，二价金属离子均使用IOmM的Mn2+ (图5)。
(6)解旋酶反应最佳ATP浓度的研究
50uL 体系中 ATP 浓度分别为0. 5、1. 0,2. 0,5. 0,10. 0,15. 0、20mM，每个浓度作三个平行。并依次加入3uM的蛋白，200nM的F链，240nM的Q链，3. 6uM的C链，IOmM的Mn2+， 加入不同浓度的ATP起始反应，37°C温箱放置90min后，检测荧光值。结果显示，在ATP浓度达到2mM时，检测到的荧光值最高，在2mM以后，随着ATP浓度的升高荧光值反而降低，故确定了 ATP的最佳浓度为2mM (图6)。
(7)解旋酶反应最佳温度的研究
50uL反应体系中，3uM的解旋酶蛋白，200nM的F链，240nM的Q链，3600nM的C链， IOmM Mn2+，2mM的ATP。将上述反应体系分别置于55°C、37°C、27°C、16°C、4°C，同时每个温度设置不加解旋酶蛋白的对照组，每个组作三个平行。90min后检测荧光值，实验结果显示在 55°C时蛋白出现沉淀，而且不加蛋白的对照组由于温度过高双链变性，检测到很高的荧光值。其余相同的体系在37°C条件下荧光值最高，故确定了解 旋反应的最佳反应温度为37°C (图 7)。
(8)解旋酶反应最佳捕获链浓度的研究
以Q链240nM为标准，50uL体系中C链浓度分别为其0、2、5、10、15、20倍，每个浓度作三个平行，加入2mM ATP起始反应，37°C 90min后检测荧光值。结果表明，捕获链并不是解旋反应起始所必需的，但是其存在能促进解旋反应进行的程度。为了最大程度的促进解旋反应进行的程度，最终确定了捕获链的最佳反应浓度为Q链的10倍，即2. 4uM (图8)。
确定了 50uL的反应体系3uM的解旋酶蛋白，200nM的F链，240nM的Q链，2. 4uM 的 C 链，IOmM Mn2+/15mM Mg2+，2mM 的 ATP，pH 8. O, 37°C 的最佳反应体系。
实施例2 :—种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的应用，其步骤如下
(I)在黑色96孔或384孔板中分别加入实施例1中制得的解旋酶蛋白3uM、待筛化合物以及反应缓冲液(溶解蛋白的缓冲液，即20mM的Tris-base，150mM的Nacl，5%的甘油)，混合孵育5分钟后，加入F链200nM与Q链240nM，再孵育5分钟，加入C链2. 4uM和 ATP 2mM，置37°C反应90分钟，加入反应终止液，在荧光检测仪中检测体系中的荧光强度。 同时设置不加入待筛化合物的对照组(C组)以及不加入底物的对照组(Cl组)。
(2)计算化合物抑制率抑制率=1-(实验组荧光平均值-Cl组荧光平均值)+ (C 组荧光平均值-Cl组荧光平均值)。
对40 (1-40)种化合物进行了蛋白水平上的筛选，这40种化合物分别为
1:2_[4-(氨基磺酰基)苯胺基]-4-{4-硝基苯基}N_苯基_1，3_噻唑_5_甲酰胺；2_[4_(aminosulfonyl)anilino]~4~{4-nitrophenyl}-N-phenyl-1, 3-thiazole-5_carboxamide2 1- (3-羧基丙酰基)-5- (1，3-二苯基-1H-吡唑-4-基)-3- (4_甲氧基苯基)_4，5- 二氢-1H-批唑；1-(3-carboxypropanoyl) -5-(1, 3-diphenyl-lH-pyrazol-4-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-4, 5-dihydro-lH-pyrazole ；3 2-( {5-[(1，3-苯并噻唑-2-基磺酰基)甲基]-4-苯基-4H-1，2，4-三唑-3-基}横酉先基)_N_ (2-呋喃基甲基)乙酉先胺；2~ ({5-[ (I, 3-benzothiazol-2-y lsulf any I) methyl]-4-phenyl-4H-l, 2，4-triazol-3-yl}sulfanyl)-N- (2-furylmethyl)acetamide;4 N-{l-[(苄基硫基)甲基]-2_[2- (2_羟基亚苄基)肼基]_2_氧代乙基}_4_硝基苯甲酉先胺；N-{l-[ (benzylsulfanyl)m ethyl]-2-[2-(2-hydroxybenzylidene)hydrazino]-2-oxoethyl}-4-nitrobenzamide;5:N’-{2- (二异丁胺)-5-硝基亚苄基}-2- (4-甲氧基苯胺)乙酰肼；N’-{2_(diisobutylamino) -5-nitrobenzylidene}~2~(4-methoxyaniIino)acetohydrazide;6 :6-[2-(l，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-4-羟基-3-4-甲基苯甲酰基)_5_氧代-2-4, 5- 二氢-1H-批略-1-基]己酸；6_[2_(1，3-benzodioxol-5-yl) -4-hydroxy-3-(4-methylbenzoyl)-5-oxo-2, 5-dihydro-lH-pyrrol-l-yIJhexanoic acid ；7 2, 7_ 双-(4-吗琳基)_1，8_ 二苯基-1，8_ 辛二丽；2，7-bis (4-morpholinylmethyl)-1,8-diphenyl-l, 8-octanedione ；8 4-{[7- (3，4-二羧基苯氧基)-2-萘基]氧基}邻苯二甲酸；4_{[7_(3，4-dicarboxyphenoxy)-2-naphthyl]oxy}phthalic acid;9 N- (4-{[ (4-甲基-2-嘧啶基)氨基]磺酰基}苯基)[1，I’ -联苯]-4-甲酉先胺；N-(4_ {[ (4-methyl_2-pyrimidinyl)amino]sulfonyl}phenyl)[1， Γ -biphenyl]-4-carboxamide10 :4-{[3-(4-溴苯基)-3-氧代-1-丙烯基]氨基}_N_(3-甲氧_2_吡嗪基)苯磺酉先胺；4_ {[3- (4-bromophenyl) -3-oxo-l-propenyl] amino} -N- (3-methoxy-2-pyrazinyl)benzenesulfonamide;11 :N I'N’ 6 双(IH-苯并咪唑-2-甲基)己烷二酰肼；N’ I'N’ 6 -bis (lH_benzimidazol-2-ylmethylene)hexanedihydrazide;12:4-苯甲酰基-N- (4-{[ (4_甲基嘧啶_2_基)氨基]磺酰基}苯基)苯甲酰胺；4-benzoyl-N- (4_{[(4-methylpyrimidin-2-yl)amino]sulfonyl}phenyl) benzamide ；13 2-{5-[ (5-{4-硝基苯基}-2-呋喃基)亚甲基]-4-氧代_2_硫代-1，3_噻唑焼-3-基}己二酸；2~ {5- [ (5- {4-nitrophenyl} -2-furyl) methylene] -4-oxo-2-thioxo-l，3-thiazolidin-3-yl}hexanedioic acid;142-[(4-甲氧基苯甲酰基)氨基]-N-{3-[2-(4-甲氧基苯甲酰基)肼基]_3_氧代丙基}苯甲酉先 1 ；2-[(4-methoxybenzoyl)amino]-N-{3-[2-(4-methoxybenzoyl)hydrazino]-3-oxopropyl}benzamide;15 :N-[4-(氨基磺酰基)苯基]-2-[(4，5-二苯基-1，3-恶唑-2-基)硫基]乙酰胺；N-[4- (aminosulfonyl)phenyl]-2-[(4，5-diphenyl-l，3-oxazol-2-yl) thio]acetamide;16 2-[ (4-乙基-5-苯基-4H-1，2，4-三唑-3-基)硫基]-N-{4-[ (2_ 吡啶基氨基)横酸基]苯基}乙酉先胺;2_[ (4-ethyl-5-phenyl-4H_l，2，4-triazol_3-yl) sulfanyl]-N- {4-[ (2-pyridinylamino)sulfonyl]phenyl}acetamide;
17 :3-(4-氟苯基)-N-{4-[(2-喹喔啉基氨基)磺酰基]苯基}_丙烯酰胺；3_(4_f IuorophenyI) -N-{4_[(2-quinoxalinylamino)sulfonyl]phenyl}aerylamide ；
18 2, 4- 二氯-N-{4-[ (2_喹喔啉基氨基)磺酰基]苯基}苯甲酰胺；2，4-dichl oro-N-{4-[(2-quinoxalinylamino)sulfonyl]phenyl}benzamide;
19:N’-[ (1，3-苯并噻唑-2-基硫基)乙酰基]-2-[ (6_乙氧基-1，3_苯并噻唑-2-基)硫基]乙酉先月井;N，-[(1，3-benzothiazol-2-ylsulfanyl) acetyl] -2- [ (6-ethoxy -1，3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetohydrazide;
20 2- (3，4-二甲氧基苯基)-N- (6_{[ (3，4_ 二甲氧基苯基)乙酰基]氨基} -2-卩比 P定基)乙酉先胺；2~ (3, 4-dimethoxyphenyl) N- (6- {[ (3, 4-dimethoxyphenyl) acetyl]amino}-2-pyridinyl)acetamide;
21 3-[ (2-氯苯氧基)甲基]-N-{4_[ (2_嘧啶基氨基)磺酰基]苯基}苯甲酉先胺；3-[(2-chlorophenoxy)methyl]-N-{4_[(2-pyrimidinylamino)sulfonyl]phenyl} benzamide;
22 4- ( {4-硝基-1H-吡唑-1-基}甲基)N_[6_ (甲基磺酰基)_1，3_苯并噻唑-2-基]苯甲酉先胺;4_ ({4-nitro-lH-pyrazol-l-yI jmethyl) -N-[6- (methylsulfonyl)-1，3-benzothiazol-2-yIJbenzamide;
23 3- (1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N- (4_{[ (2，6_ 二甲基_4_嘧啶基) 氨基]磺酰基}苯基) 丙烯酰胺；3-(1，3-benzodioxol_5-yl)N-(4-{[(2，6-dimethyl_4-py rimidinyl)amino]sulfonyl}phenyl)acrylamide;
24 :乙基4_ ( {3_{3_硝基苯基}_2_[ (4_甲氧基苯甲酉先基)氛基]丙酉先基}氛基) 苯甲酸甲酯；ethyl 4- ({3- {3-nitrophenyl} ~2~[ (4-methoxybenzoyl) amino] acryloyl} amino)benzoate;
25 6- ( {2-[ (3_溴苯甲酰基)氨基]_3_苯基丙烯酰基}氨基)己酸； 6-({2-[ (3-bromobenzoyl)amino]-3-phenylacryloyl}amino)hexanoic acid;
26 2~ {[3-氛基-6_ (3，4-—甲氧基苯基)卩比卩定~2~基]硫基}-N-[5_ (丙基硫基)-1，3，4-噻二 唑-2-基]乙酸胺；2-{[3-cyano_6-(3，4-dimethoxyphenyl) pyridin-2-yl] sulfanyl} N-[5_(propylsulfanyl)_1，3，4-thiadiazol-2-yl]acetamide;
27 :4-[( {[(4-甲氧基苯基)乙酰基]氨基}硫代甲酰基)氨基]_N_(2_苯乙基)苯磺酉先胺；4_[ ({[ (4-methoxyphenyl) acetyl] amino} carbothioyl) amino] -N- (2-phenylethyl) benzenesulfonamide;
28 N-{4-[ (6-氯-3-吡啶基)甲氧基]_3_甲氧基苄基}-N_{2_[ (7_氯_4_喹啉基)氨基]乙基}胺；N- {4- [ (6-chloro-3-pyridinyl) methoxy] -3-methoxybenzyl} -N- { 2-[(7-chloro-4-quinolinyl)amino]ethyl}amine;
29 4-[5- ({[2- (3，4_ 二甲氧基苯基)乙基]氨基}甲基)_2_呋喃基]苯甲酸； 4-[5-({[2-(3，4-dimethoxyphenyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyIJbenzoic acid;
30 3-[5- ({3-[2- (4_ 乙氧基)-甲基 _2_ 氧代乙基]-2，4_ 二氧代-1，3_ 噻唑焼-5-亚基}甲基)-2-呋喃基]苯甲酸；3-[5-({3-[2-(4-ethoxyaniIino)-2-oxoethyl] -2，4-dioxo-l, 3-thiazolidin-5-ylidene}methyl)-2-furyIJbenzoic acid ；
31 :3-( {5-[5-溴-2-(羧基甲氧基)亚苄基]-3-甲基-4-氧代-1,3-噻唑烷-2-亚基}氨基)苯甲酸；3-({5-[5-bromo-2-(carboxymethoxy)benzylidene]-3-methyl-4-oxo-1,3-thiazolidin-2-ylidene}amino)benzoic acid ；32 :乙基[2- ( {[ (5-甲基-5H-[1, 2，4]均三嗪并[5，6_B]吲哚 _3_ 基)硫基]乙酰基}氨基)-1，3_ 噻唑-4-基]乙酸甲酯；ethyl[2-({[(5-methyl-5H-[l，2，4]triazino[5, 6_b]indol-3-yl)sulfanyl]acetyl}amino)-1, 3-thiazol-4-yl]acetate;33 N-[3- (5-{[2- (4_ 甲氧基)_2_ 氧代乙基]硫基}_4_ 甲基-4H-1，2，4_ 三唑-3-基)苯基]-2-甲基苯甲酸；N-[3- (5- {[2- (4-methoxyani I ino) -2-oxoethyl] sulfanyI}-4-methy1-4H-1, 2, 4-triazol-3-yl)phenyl]-2-methylbenzamide; 34:2-(4-{2_[3-氰基-4-(甲氧基甲基)-6-甲基_2_吡啶基]糖基}_2_甲氧基苯氧基)-N_(3,4_ 二甲基苯基)乙酸胺；2_ (4- {2-[3-cyano_4- (methoxymethyl) -6-methyl-
2-pyridyl]carbohydrazone}-2-methoxyphenoxy)-N-(3,4-dimethylphenyI)acetamide ；35 :3-{[2-氯-5-(苯磺酰基)苯甲酰基]氨基}苯甲酸；
3-{[2-chloro_5-(phenylsulfonyl)benzoyl]amino}benzoicacid;36 N-[6- ( {[ (2-噻吩基羰基)氨基]硫代甲酰基}氨基)_1，3_苯并噻唑-2-基]丁酸胺；N-[6-({[ (2-thienylcarbonyl) amino] carbothioyl}amino)-1, 3-benzothiazol-2-yl]butanamide;37 :3-(稀丙氧基)_4，5，6-二 (节氧基)-1，2-环己_-醇；3-(allyloxy)-4，5，6-tris (benzyloxy)-1, 2-cyclohexanediol;38 :N-(，3，4-二氯苯基)-4-( {[(3-甲氧基苯基)磺酰基]氨基}甲基)苯甲酰胺；N-(3, 4-dichlorophenyl)~4~({[(3-methoxyphenyl)sulfonyl]amino}methyl)benzamide;39 :2-甲基-N-{3-[4-甲基-5- ( {2_[ (4_甲基苄基)氨基]_2_氧代乙基}硫基)-4H-1，2，4-三唑-3-基基]苯基}苯甲酰胺；2-methyl-N- {3- [4-methyl_5- ({2-[(4-methylbenzyI)amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)-4H-1, 2, 4-triazol-3-yl]phenyl}benzamide;40:伊维菌素。确定了四种能够抑制解旋酶活性的化合物(图9)。其分别为I 2-[4-(氨基磺酰基)苯胺基]-4-{4-硝基苯基}N-苯基-1,3-噻唑-5-甲酰22:4- ( {4-硝基-1H-吡唑-1-基}甲基)N-[6-(甲基磺酰基)-1，3_苯并噻唑-2-基]苯甲酰胺；30 3-[5- ( {3-[2- (4_ 乙氧基)-甲基 _2_ 氧代乙基]_2，4_ 二氧代-1，3_ 噻唑烷-5-亚基}甲基)-2-呋喃基]苯甲酸；36 N-[6-( {[(2-噻吩基羰基)氨基]硫代甲酰基}氨基)_1，3_苯并噻唑_2_基]丁酰胺；对解旋活性的抑制率分别为30. 52%,56. 29%,39. 83%,55. 63%。
权利要求
1. 一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法，其制备步骤如下 (1)解旋酶蛋白的表达与纯化人工合成乙型脑炎病毒NS3基因，用NcoI和Xho I分别酶切解旋酶片段与大肠杆菌原核表达载体pET30a，T4 DNA Ligase 16°C过夜连接，得到重组质粒pET30a_helicase,构建好的重组质粒pET30a_helicase转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中进行表达，得到一种解旋酶蛋白，其序列为SEQ ID NO.1所示，收集表达蛋白上清用Ni2+亲和纯化，纯化的解旋酶蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定后加甘油至终浓度20% v/v，用BCA法测定浓度，_80°C冻存备用；用大肠杆菌大量表达解旋酶蛋白，在表达蛋白上带有6XHis标签，收集表达蛋白的上清，用Ni2+亲和层析法纯化解旋酶蛋白，用BCA法测定蛋白浓度； (2)解旋酶DNA底物的设计人工合成3条DNA链，分别命名为F、Q、C，序列分别为F: (Cy5-)TAGTACCGCCACCCTCAGAACCTTTTTTTTTTTTTT ；Q:GGTTCTGAGGGTGGCGGTACTA-(BHQ2)；C:TAGTACCGCCACCCTCAGAACC ； (3)在黑色96孔或384孔板中加入解旋酶蛋白3uM、待筛化合物以及反应缓冲液，混合孵育5分钟后，加入F链200nM与Q链240nM，再孵育5分钟，加入C链2. 4uM、15mM Mg2VlOmM的Mn2+和ATP 2mM，置37°C反应90分钟后，在荧光检测仪中检测体系中的荧光强度，同时设置不加入待筛化合物的对照组以及不加入底物的对照组； (4)计算化合物抑制率抑制率=1-(实验组荧光平均值-Cl组荧光平均值)+(C组荧光平均值-Cl组荧光平均值)，选择抑制率最高的化合物进行抗病毒的研究。
全文摘要
本发明公开了一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法，步骤1、解旋酶蛋白的表达与纯化人工合成乙型脑炎病毒NS3基因，用NcoI和XhoI分别酶切解旋酶片段与大肠杆菌原核表达载体过夜连接，得一种解旋酶蛋白，其序列为SEQIDNO.1所示，收集表达蛋白的上清，用Ni2+亲和层析法纯化解旋酶蛋白，用BCA法测定蛋白浓度；2、解旋酶DNA底物的设计；3、在黑色96孔中加入解旋酶蛋白3uM、待筛化合物以及反应缓冲液，混合孵育，在荧光检测仪中检测体系中的荧光强度，不加入底物的对照组；4、计算化合物抑制率。方法简单易行，灵敏度高，成本低，样品少，对解旋酶反应的过程进行监测，对今后的乙型脑炎病毒药物的开发具有极大意义。
文档编号G01N21/64GK102994611SQ201210497118
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者宋云峰, 方金娥, 曹胜波, 陈焕春 申请人:华中农业大学