一种酵母上游激活元件在丝状真菌中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种酵母上游激活元件在丝状真菌中的应用。

背景技术：

上游转录激活元件UAS在分子生物学中属于一种顺式作用元件，它是指DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列，即具有特殊功能的转录因子DNA结合位点和其他调控基序。这些元件能够被特异转录因子识别和结合，从而影响基因表达活性。通常只有特定的启动子和顺式作用元件结合后才能发挥相应的转录激活或转录抑制功能，由于不同物种之间转录因子的差异，跨种属的交叉表达一般都会造成顺式作用元件无效。

本发明描述的酵母UAS元件和特异蛋白结合后能隔绝常染色体和异染色体，从而阻断上游异染色体的沉默信号，间接提升下游基因的表达水平。这种UAS元件对于调控异染色体周围的基因表达具有十分重要的作用，从而避免的基因在染色体的位置效应。

酿酒酵母属于盘菌目，而丝状真菌属于曲霉目。在分类学中属于两个不同的种属。酿酒酵母属于单细胞，单倍体或二倍体的真核模式微生物，而丝状真菌通常一个细胞有多个细胞核，细胞和细胞间通常通过隔膜等细胞系紧密相连形成多细胞。目前对于酿酒酵母的功能基因研究已经十分细致，而对于丝状真菌的基因分析尚停留在测序阶段，因此在内源基因序列尚不清楚的情况下，转入外源基因对于宿主的影响更加不可预测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供来源于酿酒酵母的上游激活元件UAS在提高丝状真菌中目的蛋白表达量中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

来源于酿酒酵母的SEQ ID NO.1所示的上游激活元件UAS在提高丝状真菌中目的蛋白表达量中的应用。

所述的上游激活元件UAS优选克隆到启动子的上游，或终止子的下游位置；但不限于这两个位置。

所述的上游激活元件UAS优选距离启动子或终止子的位置为0bp、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、1kb或距离启动子或终止子更远的距离。

所述的上游激活元件UAS优选为单拷贝、两拷贝、三拷贝、四拷贝、五拷贝、六拷贝、七拷贝、八拷贝、九拷贝、十拷贝或更多拷贝的串联重复。

所述的启动子优选常用于真菌的启动子或其突变的、截短的或杂合的启动子。

所述的常用于真菌的启动子进一步优选AOX1、cbh1、gpdA、pki、trpC、NA2、glaA、cbh1、cbhII、Alp、tef或amdS。

所述的目的蛋白优选糖化酶、葡萄糖氧化酶、酸性蛋白酶、酸性淀粉酶、中性蛋白酶、真菌淀粉酶、植酸酶或脂肪酶。

一种提高丝状真菌中目的蛋白表达量的方法，其特征在于构建重组表达载体，将来源于酿酒酵母的SEQ ID NO.1所示的上游激活元件UAS克隆到丝状真菌目的蛋白编码基因的启动子的上游，或终止子的下游位置；重组表达载体转化丝状真菌宿主细胞，培养转化了重组表达载体的丝状真菌表达目的蛋白。

作为本发明所述的方法的优选方式，所述的上游激活元件UAS距离启动子或终止子的位置为0bp、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、1kb或距离启动子或终止子更远的距离；所述的上游激活元件UAS为单拷贝、两拷贝、三拷贝、四拷贝、五拷贝、六拷贝、七拷贝、八拷贝、九拷贝、十拷贝或更多拷贝的串联重复。

作为本发明所述的方法的优选方式，所述的启动子选自常用于真菌的启动子或其突变的、截断的或杂合的启动子；所述的常用于真菌的启动子优选AOX1、cbh1、gpdA、pki、trpC、NA2、glaA、cbh1、cbhII、Alp、tef或amdS；所述的目的蛋白选自糖化酶、葡萄糖氧化酶、酸性蛋白酶、酸性淀粉酶、中性蛋白酶、真菌淀粉酶、植酸酶或脂肪酶。

有益效果：

本发明提供了一种来源于酿酒酵母的上游激活元件，将该元件与启动子融合后可增强其相应的下游编码蛋白序列的转率水平，从而提高目的蛋白的表达产量。

附图说明

图1 NA2-amdS质粒图谱。

图2 UAS-NA2-amdS质粒图谱。

图3 UAS2-NA2-amdS质粒图谱。

图4 UAS3-NA2-amdS质粒图谱。

图5不含UAS、含单拷贝UAS及含双拷贝UAS的黑曲霉表达真菌淀粉酶酶活比较。

图6比较串联拷贝UAS真菌淀粉酶表达量差异。

图7 NA2-UAS-amdS质粒图谱。

图8 NA2-UAS2-amdS质粒图谱。

图9 UAS克隆到终止子末端对表达量的影响

具体实施方式

以下仅以下述元件及基因来说明本发明的技术方案及技术效果，并不能作为限制本发明保护范围的依据。

所述的酵母UAS元件来源于酿酒酵母YJM1389，NCBI sequence ID.CP004656.2

所述的启动子NA2元件，来源于载体pMT1802，NCBI sequence ID.AF214480.1

所述的糖化酶终止子元件，来源于载体pMT1802，NCBI sequence ID.AF214480.1

所述真菌淀粉酶序列，来源于米曲霉，NCBI sequence ID.XM_001821384.2

实施例1

1.基因合成UAS元件

从NCBI上获得UAS元件，分别合成单拷贝，两拷贝及三拷贝UAS元件，序列的5’和3’末端分别添加HindIII和SalI位点，目的序列克隆到pUC57载体。两端含HindIII和SalI位点的单拷贝USA元件序列如SEQ ID NO.1所示，两端含HindIII和SalI位点的双拷贝USA元件序列如SEQ ID NO.2所示，两端含HindIII和SalI位点的三拷贝USA元件序列如SEQ ID NO.3所示。

2.构建表达载体

分别从NCBI上获得NA2启动子(SEQ ID NO.4)，终止子(SEQ ID NO.5)，真菌淀粉酶基因编码序列(SEQ ID NO.6)后以pUC57为出发载体构建表达载体，命名为NA2-amdS(图1)，序列由金斯瑞合成。

上述载体NA2-amdS通过HindIII-SalI酶切，并将上述合成的单拷贝，两拷贝及三拷贝UAS元件用同样内切酶酶切后连入酶切后的表达载体NA2-amdS，含单拷贝UAS元件的表达载体命名为UAS-NA2-amdS(图2)，含两拷贝UAS元件的表达载体命名为UAS2-NA2-amdS(图3)，含三拷贝UAS元件的表达载体命名为UAS3-NA2-amdS(图4)。

3.表达载体转化宿主细胞

表达载体UAS-NA2-amdS，UAS2-NA2-amdS、UAS3-NA2-amdS用HindIII线性化，通过原生质体转化至黑曲霉。

转化方法：

在TZ液体培养基(牛肉膏粉0.8％；酵母浸膏0.2％；蛋白胨0.5％；NaCl0.2％；蔗糖3％；pH5.8)中培养黑曲霉菌丝体(黑曲霉CBS513.88，购自荷兰真菌菌种保藏中心CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre)。通过mira-cloth(Calbiochem公司)从培养液中过滤菌丝体并用0.7M NaCl(pH5.8)洗涤，菌丝体滤干后转移至含纤维素酶1％(Sigma)、蜗牛酶1％(Sigma)和溶壁酶(Sigma)0.2％的酶解液中。30℃，65rpm酶解2.5-3h。然后将含有原生质体的酶解液置于冰上并用四层擦镜纸过滤。得到的滤液3000rpm，4℃离心10min后，弃上清；附着在管壁上的原生质体用STC溶液(1M D-山梨醇、50mM CaCl₂、10mM Tris-HCl，pH7.5)洗涤一次，最后把原生质体重悬于适量的STC溶液中。将30ug质粒EcoRI线性化DNA加入到300ul原生质体悬浮液中，混匀后室温放置25min；然后分三次共加入2.7mL PEG溶液(60％PEG4000、10mM CaCl₂、10mM TrisHCl，pH7.5)，混匀后室温放置25min；3000rpm，常温离心，加入适量STC液体悬浮沉淀后铺板。

4.摇瓶检测真菌淀粉酶表达量

摇瓶配方及方法

上述所得阳性转化子分离两次，使用50mL发酵培养基(13％玉米淀粉，2％葡萄糖，3％豆饼粉,3％玉米浆,0.2％2万U/g的高温淀粉酶)的摇瓶在34℃下，220rpm的摇床中培养六天。按照国标法测试上清液的真菌淀粉酶活性，结果见表1和图5。

表1

实施例2比较串联拷贝UAS表达量差异

UAS2-NA2-amdS，UAS3-NA2-amdS载体转化及酶活鉴定方法如实施例1所述。

各取20个转化子，检测摇瓶样品酶活，结果如图6所示，三个串联UAS的表达量比两个串联UAS高20％左右。

实施例3UAS克隆到终止子末端对表达量的影响。

分别将UAS及两拷贝UAS克隆到NA2-amdS载体的终止子的3’末端，载体分别命名为NA2-UAS-amdS(图7)，NA2-UAS2-amdS(图8)。载体转化及酶活鉴定方法如实施例1所述。

各取20个转化子，检测摇瓶样品酶活，结果如表2及图9所示，结果显示UAS克隆到终止子下游仍能增强目的蛋白真菌淀粉酶的表达。

表2

实施例4UAS距离对增强表达的影响

在UAS-NA2-amdS载体的UAS元件和NA2之间随机插入50bp，构建成载体UAS-random-NA2-amdS，随机插入序列如SEQ ID NO.7所示。

载体转化及酶活鉴定方法如实施例1所述。转化子随机挑取20个检测酶活，并对这些样品进行显著性差异分析。结果表明，两组数据没有显著性差异。

表3

表4

方差分析

F<F crit,且P-value>0.05,两组数据间无显著性差异。