一株丝孢酵母菌及其在金纳米颗粒合成中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株丝孢酵母菌及其在金纳米颗粒合成中的应用，属于生物技术领域。
技术背景
[0002]金纳米颗粒(AuNPs)由于其抗氧化性、生物相容性和稳定性，在微生物学、医学、环境传感及电子学中应用广泛。已有的AuNPs合成法均具有一定的局限性。物理合成法中可以通过优化激光脉冲时间及作用温度，合成颗粒尺寸小(直径〈10 nm)、尺寸分布均一的AuNPso但是这些方法需要高温高压条件和复杂的仪器装置。而在化学还原合成方法中常使用的难降解非极性有机物会对环境产生负面影响。溶胶凝胶法比起其他物理化学方法，能够获得尺寸和形状分布范围更小的AuNPs。然而，溶胶凝胶合成法需要使用有毒封端剂来防止纳米颗粒的聚合。相比较以上方法，微生物优势明显，其合成过程简单可控且环境友好。微生物可以通过金属的生物还原过程，合成金属纳米粒子，从周围的环境中移除可溶性金属，从而减少可溶性金属的毒性。
[0003]真菌是一类重要的微生物资源，相比较细菌而言，可以分泌大量合成纳米颗粒相关的胞外酶、多肽类物质及次级代谢产物等，合成的纳米颗粒产量高、易与真菌分离，可用于纳米颗粒的大规模生产。真菌合成法具有两个主要的优点:环境影响小，生产成本低。这是因为，微生物以可再生的方式生产，生产过程中只需要生物还原和限制、稳定剂，不需要外源化学物质。此外由于生物分子模板和无机材料的特异性相互反应，可以产生所需形状和大小的AuNPs以满足特定的应用要求。
[0004]目前已有真菌及其代谢产物还原Au3+Au+合成金纳米颗粒的相关报道。Du等人于2011年报道了利用200个真菌菌属用于金属纳米颗粒合成的系统研宄，研宄表明只有Verticillium sp.和/7.<0^5770/??两个物种能够产生金属纳米颗粒。其中真菌Verticillium sp.在细胞表面形成外形尺寸均一、单分散性良好的AuNPs。Agnihotri等人于2009年报道利用热带海洋酵母菌Yarrowia lipolytica NCIM 3589在不同pH下形成AuNPs尺寸不同，其中在pH 2条件下形成规则的三角形和五边形结构。在快速合成AuNPs方面，Du等人报道了以sp.1-208的细胞滤液中实现了快速生物合成，其中定量生物还原与AuNPs的合成不到5 min。Priyadarshini等人于2014年报道了 AspergillusterreiAs也可在几分钟内即可还原产生AuNPs。本专利涉及的丝孢酵母菌{ Trichosporod)是一种广泛存在的真菌，其中部分种与污水处理相关，还有若干种可以产生生物表面活性剂及产微生物柴油，而关于丝孢酵母菌合成AuNPs的研宄至今还未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一株丝孢酵母菌以及采用该菌株催化HAuCl4合成金纳米颗粒的方法，该菌株在生物合成纳米材料领域中具有应用价值。
[0006]本发明涉及一株丝孢酵母菌(拉丁文分类命名为:Trichosporonmontevideense)，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其登记入册编号为CGMCC N0.10368，保藏日期为2015年I月19日；菌株的26S rRNA基因序列在GenBank数据库中的登记号为KP676895。
[0007]该菌株分离自本实验室反应器污泥，该菌株生长采用的培养基为改良马丁固体培养基或液体培养基，所述液体培养基组成为:葡萄糖10 g/L，(NH4)2SO4 I g/L,MgSO4 0.5 g/L，K2HP04 I g/L, pH 7;并加入四环素50 mg/L ;土霉素50 mg/L，所用的固体培养基为对应的液体培养基中加入2 wt%琼脂，固体培养基或液体培养基均在115°C湿热灭菌20 min后使用。
[0008]该菌株具有合成金纳米颗粒的能力:将2 mL的菌液中加入1.0 mmol/L HAuCl4溶液，在30°C，150 rpm条件下孵育10 min即可达到产生金纳米颗粒的最大值，金纳米颗粒呈球形、五边形等不同形态。
[0009]本发明的有益效果是:该菌株分离自本溪钢铁焦化厂的活性污泥，在含有四环素和土霉素的改良马丁液体培养基或固体培养基中生长的最适温度为30°C，最适pH为6，该菌株可催化HAuCl4^成不同形态的金纳米颗粒。该菌株为金纳米材料的快速生物制备提供一种新的微生物资源，在生物合成纳米材料领域中具有应用价值。
【附图说明】
[0010]图1丝孢酵母菌WIN的系统发育树。
[0011 ]图2丝孢酵母菌WIN的在改良马丁培养基中的生长曲线。
[0012]图3丝孢酵母菌WIN扫描电镜图片。
[0013]图4不同pH对丝孢酵母菌WIN生长的影响。
[0014]图5不同温度对丝孢酵母菌WIN生长的影响。
[0015]图6丝孢酵母菌WIN合成金纳米颗粒紫外-可见光全波长扫描。
[0016]图7丝孢酵母菌WIN合成金纳米颗粒的透射电镜表征。
[0017]图8丝孢酵母菌WIN合成金纳米颗粒的元素分析。
【具体实施方式】
[0018]实施例1:菌株的获得
本申请中的丝孢酵母菌分离自本溪钢铁焦化厂的活性污泥。前期先将所取泥样置于微生物反应器中驯化培养，60天后取2 mL反应器泥水混合物，采用平板稀释涂布法，将泥水混合物稀释涂布在含四环素和土霉素的固体改良马丁液体培养基(葡萄糖10 g/L,(NH4)2SO4 I g/L，MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 I g/L，四环素 0.05 g/L ;土霉素 0.05 g/L, pH 7，琼脂2 wt%)上，于30°C下培养5天。培养皿长出菌落后，挑取少量菌落于含有25 mL液体改良马丁培养基的50 mL锥形瓶中，于30°C，150 rpm下振荡培养，待菌株生长至对数增长期，吸取少量菌液稀释进行平板涂布。重复上述操作，直至得到纯化的菌株。
[0019]该菌株于2015年I月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研宄所，100101)，登记入册编号为 CGMCC N0.10368。
[0020]实施例2:菌株的26S rRNA分子鉴定提取丝孢酵母菌WIN的基因组DNA，通过PCR扩增26S rRNA基因序列并测序，利用BLAST程序对序列进行同源对比，得到与其最相近的菌种为丝孢酵母菌，二者26S rRNA基因序列相似性为100%，因此判定WIN为丝孢酵母菌。图1为菌株WIN基因的系统发育树。其26S rRNA序列已登录GenBank数据库，入藏号为KP676895。菌株WIN的26Sr RNA基因序列如下。
[0021]>WIN 26S rRNA gene sequenceCTCAAATTTGAAATCTGGCTGTCTTCGATAGTCCGAGTTGTAATCTATAGAAGCGTTTTCCGTGCTGAACT
GTGTCTAAGTCCCTTGGAACAGGGTATCAAAGAGGGTGATAATCCCGTACTTGACAC