专利名称：一株丝孢酵母及其在降解苯酚中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，涉及一株苯酚降解菌及其在环境污染控制中的应用。
背景技术：
苯酚是有机合成的常用原料，酚类化合物广泛存在于炼焦、制药、造纸、染料、酚醛树脂合成以及石油化工等行业废水中，苯酚是含酚废水的主要污染物，据国家环保局统计2003年我国酚类物质排放量约为3000吨。苯酚属于原生质毒物，对生物具有毒害作用，对人类神经系统的危害尤其严重(Paula M et al.， Isolation and characterization of phenol-degradingdenitrifying bacteria [J]. Appl. Environ. Microbiol., 1998， 64(7): 2432-2438.)，水中酚类化合物含量达到O. 005 mg/L时就不能饮用，含酚量> 100mg/L的灌溉水将导致农作物减产和枯死(李淑彬等.蜡状芽孢杆菌菌株Jp-A的分离鉴定及其降解苯酚特性[J]，应用生态学报，2006, 15(2):920-924.)，因此苯酚被列为国家环保局1989年通过的"水中优先控制污染物黑名单"。
当苯酚浓度>1000 mg/L时，苯酚的回收成为首选方法，苯酚的回收方法有吸附法(T.Viraraghavan & Flor de Maria Alfaro, Adsorption of phenol from wastewater by peat, fly ash andbentonite[J], J. Hazard. Mater. 57 (1998) 59—70)、溶剂萃取(Hong Jiang et al.， Studies on theextraction of phenol in wastewater [J], J. Hazard. Mater. B 101 (2003) 179—l卯)以及液膜分离(Jinyi Luan & A. Plaisier, Study on treatment of wastewater containing nitrophenol compounds byliquid membrane process[J], J. Membr. Sci. 229 (2004) 235—239)等方法，苯酚的回收率可达90%以上。苯酚污水的处理有物理、化学氧化及生物降解方法等(张锦等，含酚废水的危害及处理方法的应用特点[J].环境工程,2001， 83(2): 36-37),对于难于回收的含苯酚废水，生物降解具有温和、效率高、应用范围广、处理能力大、设备简单、和不产生二次污染等特性。文献报道已筛选到可降解苯酚的微生物多种，其中多数为不动杆菌C4d"柳^c加sp.)(陈明，张维，醋酸钙不动杆菌PHEA—2对苯酚的降解特性研究[J].中国环境科学,2001， 21(3): 226-229)、假单胞菌(Psew(iowcwa51 sp.) (Arinjay Kumar et al., Biodegradation kinetics of phenol and catecholusing i^wfitowoww /7W"'cto MTCC1194[J]. Biochem. Eng. J., 2004, 22: 151-159)、红球菌(i^ocfococc^sp.)(沈锡辉等，苯酚降解菌红球菌PNAN5菌株的分离鉴定、降解特性及其开环双加氧酶性质研究[J].环境科学学报，2004， 24: 482—486)、微球菌(M/crococc^ sp.)(潘利华等，苯酚降解菌的筛选及其降解特性的初步研究[J].微生物学通报，2003， 30(5): 78-81)、
3皮状丝孢酉孝母(7WcAcw/ ora" c由we訓)(Andras Gaal & Halina Y. Neujahr， Metabolism of phenoland resorcinol in TWc/zosjpoto" c由"e調[J]， J. Bacteriol., 1979， 137(1): 12-31)、假丝酵母(Cawd油sp.) (Jiang Yan et al., The biodegradation of phenol at high initial concentration by theyeast C朋&Wa &op/cafe[J]， Biochem. Eng. J.， 2005， 24: 243-247)以及丝状真菌(Santos V L &Linardi V R, Biodegradation of phenol by a filamentous fungi isolated from industrialeffluents-identification and degradation potential[J], Process Biochem. 2004， 39: 1001—1006)等，其中假丝酵母耐苯酚浓度可达2000mg/L，投加于活性污泥中可成为处理含酚废水的优势菌群，苯酚降解率可达95%以上，未投加菌种的活性污泥其对照苯酚降解率低60%(朱永光等，活性污泥系统处理苯酚废水的生物强化效果[J]，应用与环境生物学报,2006， 12(4): 559-561)，皮状丝孢酵母(7>7'c/za^oraw cw/朋eww)的耐酚浓度亦可达2000mg/L(Andras Gaal & Halina Y.Neujahr, Metabolism of phenol and resorcinol in 7>/c/w5/ oto cwtowe訓[J]， J. Bacteriol" 1979，137(1): 12-31)。
作为一种石油化工衍生产物和化工主要原料之一，苯酚以废物形式存在于环境之中时对环境构成威胁，而活性污泥法处理苯酚废水具有一些限制因素，因为苯酚具有原生质毒性，多数菌种难以耐受高于500mg/L苯酚毒性；其次苯酚废水如炼焦废水中往往含有一定浓度的重金属离子，重金属浓度高于一定的范围将对苯酚的生物降解产生抑制作用。所以寻求开发具有自主知识产权的耐受高浓度苯酚以及重金属毒性的生物降解菌株具有重要的经济和科学意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株可降解高浓度苯酚的菌株及其应用。
该菌株为丝孢酵母属菌株(7Hc/zo^orawwo"fewWee"w) ， 2009年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCCNo.3144。
该菌株属于真菌酵母类；在苯酚选择性固体培养基上生长有大量菌丝，菌落中间突起，边缘有树枝状辐射菌丝，无皱褶，乳白色，于3(TC左右生长。细胞椭球状、棒状，有出芽生殖，有棒状节孢子。
本发明的另一个目的是提供该菌株的应用方法降解含苯酚污水，该方法具有显著耐受高浓度苯酚以及耐受重金属毒性、降解速度快的优势。
为了实现上述目的，本发明人进行了大量深入细致的研究，结果发现，从中国华北油田石油污染土样中筛选得到的7Wc/zo;ypor(m mcmtev/cfee附e PHE1菌株，与国外报道的可耐受2000mg/L的皮状丝孢酵母(7Wc/ o^ora" 同属丝孢酵母属，在实验室规模下可耐
受2500mg/L的苯酚浓度，对1200mg/L的苯酚的降解率24h内达99X以上，该菌株降解苯酚后的残留浓度可低于0.5mg/L，达标排放。重金属锰、铅、隔、铜、锌离子浓度2.5mmol/L时，降解率仍可高达98%以上。
本发明的另外一个方面提供了一种苯酚废水的处理方法，该方法包括将7Hc/wwww7mo"fewVfewwPHEl菌株接种种子培养基，过夜培养后接种苯酚废水，通气进行降解。
本发明通过利用高效苯酚降解菌7Wc/za^orow wo"fev/cfee"w PHE1，可高效、快速降解含苯酚废水，并能耐受一定的重金属浓度。
通过下面的附图和详细描述，本发明这些方面的特征和优点将更为清楚。
图1是7Hc/2asporaw wcw&v/^e似e PHE1的平板培养菌落图片。图2是2Wc/zo5^oroM mo"teWcfeewse PHE1的菌丝形态的显微图片。图3是对不同浓度苯酚的降解情况。图4是重金属浓度分别为2.5 mmol/L时对苯酚的降解情况。
本发明中，除非特别指明，术语"苯酚降解菌"是指可以苯酚为唯一碳源和能源进行生长的微生物菌株，即菌株在增殖或代谢过程中可将苯酚降解为二氧化碳和水而去除。
本发明中，除非特别指明，术语"含酚废水"或者"苯酚废水"是指工业过程中产生的以苯酚为主要有机污染物组成的污水。
本发明中，除非特别指明，术语"碳源"是指微生物可利用的含碳物质，微生物利用该含碳物质合成自身细胞的含碳物质。术语"能源"是微生物细胞可氧化其产生电子，在电子传递过程中产生ATP供细胞利用的物质。
具体实施例方式
(1)培养基
斜面培养基胰蛋白胨20g/L、酵母膏10g/L、氯化钠20g/L、琼脂粉2.0%。种子培养基胰蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L、葡萄糖10g/L。人工含酚废水培养基磷酸氢二钠6g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钠0.5g/L、氯化铵10g/L、 硫酸镁0.24g/L、无水氯化钙0.011g/L、苯酚50-3000 mg/L根据情况调整，固体培养基中加入 琼脂粉2.0%。
培养基在12rC高压蒸汽灭菌器中灭菌15min备用。
(2) 菌株的筛选与分离纯化 称取一定质量的华北油田石油严重污染土样加入生理盐水活化一定时间后取20ml接入
苯酚浓度50mg/L的人工废水培养基，置于3(TC， 180r/min的摇床中进行振荡培养2-3天后转接 至苯酚浓度100mg/L的人工废水，继续培养2-3天后转接苯酚浓度200mg/L的人工废水培养基， 如此逐渐增加苯酚浓度至500mg/L培养2-3天后采用稀释涂布法涂布于苯酚浓度500mg/L的平 板，30'C培养箱培养2-3天后挑取较大的菌落进行划线分离、纯化，最后将纯菌株接种在斜面 培养基上，培养后于4'C冰箱冷藏。
(3) 菌株的形态观察与分子生物学鉴定
菌丝采用光学显微镜观察(如图2)。 IO倍镜下可观察到树枝状菌丝呈辐射状生长，40倍 下可清晰观察到节孢子和出芽生殖细胞，IOO倍下观察到呈椭球状芽殖细胞和棒状裂殖节孢 子。
菌株鉴定采用28SrDNA进行，正向引物5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3',反 向引物5'-GGTCCGTGTTT CAAGACGG-3'， PCR (ABI 9700)条件94。C预变性2min， 94。C变性10s， 55'C退火5s， 72'C延伸10s, 35个循环，72X:延伸2min，测序使用ABI 3730 DNA 测序仪。序列如SEQ ID N0.1所示。NCBI BLAST 26S rRNA序列搜索结果与7h'c/zo5pora" woWeWJee"se菌株同源性99。/。，命名为rn'c/w少onw moWevfcfee"" PHE1 ，于2009年6月26日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCCNo. 3144。
(4) 苯酚的降解实验
菌种接种种子培养基，置于3(TC， 180r/min的摇床中进行振荡培养24hhrs。取一定体积 种子培养液，离心(4000rpm，下同)，菌体采用生理盐水洗涤离心后转移至上述人工苯酚 废水中，置于30'C， 180r/min的摇床中进行振荡培养一定时间后取培养液5ml进行离心，取 上层清液检测苯酚浓度。
(5) 苯酚浓度测试使用4-氨基安替比林直接光度法(国家环保局《水和废水监测分 析方法》编委会，《水和废水监测分析方法》[M].北京中国环境科学出版社，1997,408-410)。
(6) 细胞干重:培养液5ml进行离心,下层菌体使用去离子水洗涤三次后放置烘箱中8(TC烘干至恒重测细胞干重。
(7)苯酚降解率计算
苯酚降解率(％) =:￡lZ￡lx100% co指的是初始苯酚浓度，"指的是降解结束时测试苯酚浓度。
本专利采用可高效降解苯酚7Hc/2cw;ww7 woWev/ifemse PHE1菌株降解苯酚，具有耐受高 浓度苯酚、降解速度快以及耐受重金属毒性等优势。
实施例l菌株种子培养基中过夜培养后取10ml菌液离心后水洗接入20ml不同浓度的人 工苯酚废水中，3(TC通气培养，24hrs后降解结果如图3所示。
其耐苯酚浓度达2500mg/L (如图3)所示，对1200 mg/L的苯酚的降解率24h内达99X以 上，该菌株降解苯酚后的残留浓度可低于0.5mg/L，达标排放。
实施例2菌株种子培养基中过夜培养后取10ml离心后水洗接入20ml含2.5mmol/L的不同 重金属的人工废水中，3(TC通气培养，24hrs后降解结果如图4所示。
重金属锰、铅、隔、铜、锌离子浓度2.5mmol/L时，降解率仍可高达98%以上，对该菌株 的苯酚降解影响不大。<110>南京师范大学
<120> —株丝孢酵母及其在降解苯酚中的应用
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<160> 1
< 170> Patentln version 3.3
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<211> 611
<212> DNA
<213> Trichosporon montevideense
<400> 1
tacaggcatt cccctagtac ggcgagtgaa ccgggaaaag ctcaaatttg aaatctggct 60
gtcttcgata gtccgagttg taatctatag aagcgttttc cgtgctgaac tgtgtctaag 120
tcccttggaa cagggtatca aagagggtga taatcccgta cttgacacaa ccatcagtgc 180
tctgtgatac gttctctacg agtcgagttg tttgggaatg cagctcaaaa tgggtggtaa 240
attccatcta aagctaaata ttggcgagag accgatagcg aacaagtacc gtgagggaaa 300
gatgaaaagc actttggaaa gagagttaaa cagtacgtga aattgttgaa agggaaaega 360
ttgaagtcag tcgtgttcat tggattcagc tagttcttct agtctacttc ctttgaacgg 420
gtcaacatca gttttgtccg gtggataaag gatttaggaa tgtgactecc tcgggagtgt 480
tatagcctag gttcacatac actgggtgag actgaggact gcagctcgcc ttttggccgg 540
ggttcgccca cgttcgagct taggatgttg acataatggc tttaaacgac ccgtcttgaa 600
acacggaeca a 61权利要求
1、一株丝孢酵母菌株(Trichosporon montevideense)，其保藏号为CGMCC No.3144。
2、 如根据权利要求l所述的丝孢酵母CGMCCNo.3144，其特征是，它的26S rDNA序列如SEQ ID NO.l所示。
3、 权利要求l所述的丝孢酵母CGMCCNo. 3144菌株在降解苯酚中的应用。
4、 如权利要求3所述的应用，具体是将丝孢酵母CGMCC No. 3144菌株接种种子培养基，过 夜培养后接种苯酚废水，通气进行降解。
全文摘要
本发明公开了一株可以高效降解苯酚的丝孢酵母菌株。本发明的目的是提供一种苯酚降解菌及利用该苯酚降解菌进行苯酚降解的应用。本发明提供的苯酚降解菌为丝孢酵母Trichosporon montevideense CGMCC No.3144。本发明提供的方法是利用Trichosporon montevideense CGMCC No.3144进行生物降解苯酚污水。过程包括经斜面种子培养以及至少二级种子培养，或者以Trichosporon montevideense保藏号CGMCC No.3144为优势菌种的活性污泥，转接污水进行苯酚降解。本发明技术具有可耐受高浓度苯酚、重金属毒性以及高效快速消除苯酚污染等优势。
文档编号C12N1/16GK101659927SQ20091018201
公开日2010年3月3日 申请日期2009年7月29日 优先权日2009年7月29日
发明者惠 刘 申请人:南京师范大学