一种裂殖弧菌及利用其生产dha油脂的方法

专利名称：：一种裂殖弧菌及利用其生产dha油脂的方法
技术领域：
：本发明涉及一种海洋真菌裂殖弧菌及利用其高密度发酵生产DHA油脂的方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：二十二碳六烯酸(DHA)是一种重要的omega-3长链多不饱和脂肪酸，具有促进脑细胞发育，降血脂，保护视力，抗癌，提高免疫力等重要生理功能，广泛应用在婴幼儿食品及医药行业。传统的DHA生产原料主要来源于鱼油，但鱼的种类、季节、地理位置等因素的差异造成了油含量和油中不饱和脂肪酸含量的不稳定；鱼油提取获得的DHA胆固醇含量高，且含有大量的EPA(Eicosapetaenoicacid,22:5)及多种矿物质；再加上鱼油来源日渐紧缺，难以实现此种高价值产品在食品和医药行业中的广泛应用。为满足DHA不断增长的市场需求、克服从传统鱼油提取DHA的不足，近年来，科学工作者开展了利用海洋微生物发酵生产DHA的研究。常用的微生物包括隐甲藻、破囊弧菌、裂殖弧菌等，本发明所采用的菌种为裂殖弧菌。裂殖弧菌(Sc//zoc/^n'wm为一种海洋真菌，属于真菌中的Chromophyta界，Heterokonta门，Thraustochytriales目，Thraustochytriaceae禾斗，Schizochytrium属。裂殖弧菌具有较强的积累多不饱和脂肪酸的特性，且不饱和脂肪酸成分集中，主要为DHA和DPA，其他不饱和脂肪酸含量低。该菌使用安全，是DHA生产的优良菌种，引起国内外学者的广泛关注。目前国内对DHA油脂制备的专利主要集中在以下几方面(1)鱼油来源的DHA油脂制备；(2)微生物来源的DHA油脂制备；(3)油脂的提取，纯化及微胶囊化；(4)DHA油脂的应用。其中，有四篇与本发明相关，CN200610125476.3所采用的菌种为隐甲藻，生物量为20-40g/L，胞内含油量为20-50%;CN00135338.1，CN200410075426.X，CN200610028869.2均采用裂殖弧菌为生产菌，工艺和发酵方法较为传统，仅为简单的培养方法和培养条件的优化，没有详细研究直接影响生物量积累的关键因素，导致生物量均不高，最高为42.5g/L，并没有实现真正意义上的高密度发酵。低的生产效率增加了生产成本，致使微生物来源的DHA难以与鱼油来源的DHA油脂形成明显的价格优势。而DHA油脂为胞内产物，生物量是高产的关键。因此，获得DHA的高产菌株，并结业化推广的关键所在。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种自主筛选的、能高产DHA的裂殖弧菌。本发明还要解决的技术问题是提供上述裂殖弧菌高密度发酵生产DHA油脂的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种高产DHA的生产菌是从东海海域收集的腐叶上采用松花粉垂钓法分离得到，编号为HX-308。通过培养、提取油脂并对其脂肪酸成分进行检测(如图3)。从结果中可以看出其主要的长链多不饱和脂肪酸为二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，其中DHA占总脂肪酸的含量在40%左右。饱和脂肪酸占总脂肪酸30%以下，主要为十四垸酸和十六烷酸。因此，该菌脂肪酸组成简单，DHA含量高，具有很好的DHA生产能力。形态学验证在光学显微镜下观察HX-308的形态及结构，菌体为圆球形或椭球形，直径在515微米，胞内有明显的颗粒状物质，细胞主要釆用分裂方式进行繁殖。生长性能判定采用天然海水培养该菌，会出现侧生不等长的双鞭毛，一根细长，呈弯曲状，另一根较短。在营养丰富的自配人工海水培养基培养该菌，采用分裂方式生长，不会出现鞭毛。细胞生长前期分裂旺盛，呈现二分裂、四分裂或八分裂的细胞，呈菊花状，连在一起；中期细胞逐渐分裂开来，有各自的轮廓，但仍粘连在一起；中后期，细胞大量繁殖，细胞数目增多，呈聚集状态(如图l);后期，细胞增长不明显，转向油脂积累，但培养时间过长，细胞部分自溶。固体培养时，在自配ME固体培养基中培养，一般涂布后一天就有小圆粒状的菌落出现，开始很小，乳白色；随后菌落逐渐变大，颜色变深，逐渐变黄，估计后期有油脂的积累。根据上述脂肪酸组分分布情况，鞭毛结构等形态学特征，判定其为破囊弧菌科微生物。据TheBiologyofFree-livingHetertrophiclagellaters,艮道[S.T.Moss,OxfordUniversityPress(1991)]，破囊弧菌科微生物主要包括八个属(Labyrinthuloides,Aplanochytrium,Althornia,Japonochytrium,Ulkenia,Transtochytrium,Schizochytrium,Corallochytrium)，其中Labyrinthuloides细胞为椭圆形；Aplanochytrium采用静态孢子繁殖；Althornia细胞并不呈聚集状态；Japonochytrium细胞在胞外有隆起；Ulkenia从游动孢子囊中释放孢子；Transtochytrium采用孢子繁殖；Corallochytrium不形成孢子，仅有一根鞭毛，以上描述与HX-308特性不符，而Schizochytrium的显著特性是以二分裂方式繁殖，且大量繁殖后多个细胞积聚并形成孢子囊，与本菌HX-308生长特性相似，因此判断该菌为裂殖弧菌属，命名为Sc/^oc/^n'www.HX-308。为进一步对所获得的菌株进行鉴定，借用分子生物学手段对其18sRNA序列进行比对。发现本菌与Sc/z/zoc/^n'ww印.的18SRNA序列存在99%的同源性，因此判定本菌株属于裂殖弧菌，命名为SW^oc&WKm取HX-308。目前该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址武》又市，武汉大学，登记入册的编号是CCTCCNo:M209059，保藏日期是2009年3月26日。以此菌作为生产菌株。利用上述裂殖弧菌生产DHA油脂的方法，以CCTCCNo:M209059菌株为出发菌株，在液体培养基中高密度发酵获得菌体细胞，收集细胞经破碎、萃取、精制获得富含DHA的油脂。其中，所述的高密度发酵方法包括如下步骤(1)将保存在甘油管的菌株接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，在203(TC的摇床中，以150200rpm的转速，培养24~48h，获得一级种子；(2)将一级种子接入装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，接种量210%(v/v)在203(TC的摇床中，以150200rpm的转速，培养2448h，获得二级种子；(3)将二级种子接入装有种子培养基的一级种子罐中，接种量2~10%(v/v)，通气量0.22vvm，搅拌转速100200rpm，罐温2030。C，培养24~48h，得到一级种子液；(4)将步骤(3)得到的一级种子液接入装有种子培养基的二级种子罐中，接禾中量2~10%(v/v)，通气量0.22wm，搅拌转速100~200rpm，罐温2030。C，培养24~48h，得到二级种子液；(5)步骤(4)得到的二级种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量210%(v/v),通气量0.22vvm，搅拌转速100200rpm，罐温203(TC，加入消泡剂，发酵生产DHA油脂。上述种子和发酵培养基中，总渗透压维持在10002000mOsm七"；其中，种子培养基C含量在1030g/L;发酵培养基C含量在2060g/L，N含量2.12.5g/L，S含量23g/L，P含量0.41.5g/L。上述培养基中，C源为葡萄糖、甘油或果糖，优选葡萄糖；N源采用有机氮源禾口无机氮源，优选酵母膏、牛肉膏、玉米衆、硝酸铵、硫酸铵或硝酸钾，P源为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，s源为硫酸镁或硫酸铵。步骤(5)中，所述的消泡剂优选为siliconeSE-2，使用量为0.3g/L。步骤(5)中，发酵生产DHA油脂采用间歇式发酵或补料式发酵方法。其中，所述的破碎、萃取方法，采用如下三种方法之一(I)收集发酵获得的菌体细胞，6(TC烘干，碾碎，用有机溶剂浸提12~18h,得到富含DHA的毛油；(II)收集发酵获得的菌体细胞，采用破壁酶破碎细胞，再用有机溶剂浸提48h，得到富含DHA的毛油；方法II会少量的提取出脂溶性蛋白；(III)收集发酵获得的菌体细胞，碱性环境下(pH10~12)使用均质机机械破碎，破碎的细胞再用有机溶剂浸提4~8h，得到富含DHA的毛油。上述有机溶剂为正己垸、石油醚、乙醇和乙醚中的任意一种或几种的混合。优选正己垸和乙醇的混合液体，体积比为l:0.5~2。方法(II)中，所述的破壁酶为纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶中的一种或几种的组合，添加量为2~8g/L。三种方法均可以有效的提取菌体中的油脂，本发明优选的提取方法为方法(III)。其中，所述的精制方法包括脱胶、碱炼、脱色和脱臭工序中的任意一种或几种的组合，以去除DHA毛油中的胶质物质，色素和腥臭气味，获得DHA的精油。本发明所采取的工艺方法同样适用于其他裂殖弧菌属的其他菌株，包括iSc/H'zocA[^n'wws;.ATCC18915，5t/z/zocA[yfr7'wwaggrega/^wATCC28209，5b/H'zoc/^fr/w/wsp.ATCC20888，5t/n'zoc/;[Kn'wws/.ATCC20889，/Sc/w'zoc/^fr/ww//wac/ww/wSR21,77w^wWoc/23;/riwmATCC28211,Sc/zfeoc/y^7.wwwa"groveiG13,77^aw5foc;/2>^7."mATCC18907，最适的菌种为CCTCCNo:M209059。有益效果本发明从自主筛选的菌株CCTCCNo:M209059出发，在详细研究菌种生长特性基础上，采用渗透压平衡和元素供应角度优化微生物的培养方法，进而提供了一种高密度发酵生产DHA的方法，并适合大规模生产，最终细胞干重达到70g/L，油脂含量达31.5g/L，DHA占总脂肪酸含量高于35%。同时，本发明还提供了一种从海洋微生物中提取微生物油脂和精制的方法，提取收率在90-95%左右，精制收率为75-85%，所获得的DHA精油各项指标符合食品添加剂标准，且含有生物活性物质角鲨烯，且整套工艺简单，操作方便，生物量和DHA含量较高，降低了发酵成本，适合工业化生产。图1为本发明的裂殖弧菌HX-308菌体形态图。图2为油脂中角鲨烯质谱图。图3为油脂中各脂肪酸组分GC分析结果。具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例l:菌株基本生长性能考察。对筛选获得的菌株CCTCCNo:M20卯59进行基本性能考察，包括不同液体培养基培养(见表l)、不同固体培养基培养(见表2)。表1不同液体培养基下裂殖弧菌培养形态及发酵结果培养基l培养基2培养基3培养基4i首养基5大部分细胞呈圆细胞呈不规细胞静止不形，少量细胞变性，则球形，胞内细胞静止不细胞静止不动，细胞分裂1呈不规则的椭圆形态状，胞内颗粒明显，颗粒不明显，动，不规则圆动，细胞聚集旺盛，呈现二出现游动孢形，无游动孢出现大的包分裂、四分出现游动孢子侧生子侧生不等子囊裂、甚至八分不等长的双鞭毛。长双鞭毛。裂状态。生物量12.91g/L14.3g/L17.12g/L16.47g/L23.54g/L备注培养基1-4利用天然海水进行培养，盐浓度分别为(15，30，45，60g/L)，培养基中还包括40g/L葡萄糖，4g/L酵母膏。培养基5为自配的人工海水培养基，其中包括葡萄糖40g/L，酵母膏3g/L、KH2P044g/L、NaCl15g/L、MgS04'7H205g/L、KCl2g/L、MgCl23g/L,FeCl3.6H2O0.1g/L、谷氨酸钠10g/L。总渗透压为1092mOsm'L—、_表2不同固体培养基裂殖弧菌的培养特性__PDAGYP_LB_MLH_^_外基本不少量生菌落粘性较菌落呈白色，颗粒较小菌落呈乳黄色，后期黄观长长大色加深镜-细胞破细胞破烂细胞较小，呈圆形，部细胞呈规则圆形^_§_分变形_备注PDA、GYP、LB、MLH为微生物培养中常用的培养基，其成分略。ME:自配人工海水培养基在培养基5基础上添加1.5-2%的琼脂。有上述试验结果得出，当种子处于静止状态并采用分裂方式繁殖时，活力较高；且采用固体培养时优选MLH或ME培养基。实施例2:裂殖弧菌渗透压耐受性研究。裂殖弧菌为一种海洋真菌，较其他微生物有较强的抗渗透压能力，本实施例在初糖浓度100g/L基础上，改变自配人工海水的浓度，选取渗透压1208.56，1715.46，2729.26，3743.06，4756.86mOsnrL"五个梯度实验。裂殖弧菌在液体培养中主要有两种存在形式，游动的细胞和静止的包囊。前期菌体为了繁殖，鞭毛退化，被包囊包被，细胞在包囊中分裂繁殖；后期包囊破裂，细胞释放，细胞呈现游动或者静止两种状态，游动的细胞有鞭毛产生。在前两个梯度中，裂殖弧菌分裂旺盛，细胞生长较快，在第二个梯度生物量达到最高；随着渗透压的升高，细胞个体变小，呈单个分散状态，细胞生长被抑制，分裂周期延长，细胞密度较低；在第四个梯度中，裂殖弧菌基本呈现单个分散状，大部分细胞处于游动状态，细胞的游动消耗大量的能量，减少了菌体自身物质的合成，对脂肪酸的积累不利；渗透压进一步提高，细胞呈现大包囊状态，厚的包囊壁是细胞很难释放，延缓了细胞的生长，结果如表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例3:氮、磷、硫元素供应对裂殖弧菌生物量及DHA油脂含量的影响。在250ml带凹槽的摇瓶中，保持实施例2中最适渗透压(1715.46mOsm丄")条件下，优化氮、磷、硫等元素的供应，考察其对生物量及油脂含量的影响。氮源选用酵母膏和铵盐，保持酵母膏浓度不变，改变铵盐浓度，选取最终氮浓度为0.8742，1.2985，1.7227，2.1470，2.517g/L五个梯度实验，比较其对生物量和脂肪酸含量的影响，结果见表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>氮源浓度与脂肪酸积累密切相关。充足的氮源能保证细胞生长的快速进行，而脂肪酸积累是在氮源受限制的条件下发生的，因此合适的初始氮浓度决定了裂殖弧菌体内脂肪酸含量。由表4结果可知，随氮源浓度的增加，裂殖弧菌生物量逐渐上升，而脂肪酸占生物量百分比呈上升后下降趋势，在氮源浓度为1.2985g/L时最高为32.88%，而脂肪酸含量在氮源浓度为2.1470g/L条件下最高。可见氮源供应在2.1~2.5g/L之间利于生物以硫酸盐为硫元素的供应源，选取硫元素0.667，1.334，2.001，2.668，3.335g/L五个梯度，比较其对生物量和油含量的影响，结果如表5。表5不同硫元素浓度下生物量和脂肪酸含量比较硫元素梯度油脂含量DHA占总脂肪酸含0.66716.21.234.30%1.33427.24.833.50%2.00152.610.341.43%2.66856.817.136.44%3.33554.215.322.75%硫是细胞组成中不可缺少的的元素之一，其中半胱氨酸、蛋氨酸、同型半胱氨酸和牛磺酸等氨基酸和一些常见的酶均含有硫元素，硫元素是否充足供应直接影响细胞的生长和生物量。由实验结果可知，随着硫元素浓度的增高，生物量和油脂含量均有明显提升，脂肪酸占生物量的比例变化不大。在硫浓度为2.668g/L时，生物量达56.8g/L，油脂含量为17.1g/L，再增加硫元素的供应，生物量和油含量变化不大，因此选用，硫元素的供应浓度为2~3g/L。表6不同磷元素浓度下生物量和脂肪酸含量比较磷元素梯度生物量油脂含量DHA占总脂肪酸0.45652.616.230.79%0.91252.619.236.50%1.36856.612.832.61%1.82459.510.331.31%2.2860.87.228.8线2.73659.86.225.36%以KH2P04为磷元素的供应源，选取2，4，6，8，10，15g/L(相当于磷元素浓度0.456,0.912，1.368，1.824，2.28，2.736g/L)六个梯度，比较其对生物量和脂肪酸含量的影响，结果如表6。磷是微生物生长的限制因子之一，无机磷参与胞内多种初级^f戈i射反应，控制菌体的DNA，RNA和蛋白质的合成，同时也控制糖代谢，细胞呼吸和胞内的ATP水平。由图中数据可知，随着磷浓度的升高，生物量不断增加，在磷浓度为2.28g/L条件下，生物量达到最高为60.8g/L，随即降低，而脂肪酸含量前期上升，在磷含量继续升高条件下，呈现下降趋势。这可能是因为随着无机磷浓度的增加，磷酸戊糖途，5的代谢活性降低，糖酵解途径的活性大幅度提高。糖酵解途径的畅通进行保证菌体的正常生长，而磷酸戊糖途径是提供NADPH的主要途径，NADPH的供应与脂肪酸的^R累密切相关，在磷浓度过高条件下，磷酸戊糖途径的降低抑制了菌体油脂的积累。因lt匕，为保证脂肪酸占总生物量高的比例，选取磷浓度为0.41.5g/L。实施例4:裂殖弧菌的间歇式发酵(1)将保存在甘油管的CCTCCNo:M209059接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，在25。C的摇床中，以180rpm的转速，培养30h，获得一级种子；(2)将一级种子接入装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，接种量5%(v/v)在25'C的摇床中，以180rpm的转速，培养30h，获得二级种子；G)将二级种子接入装有70L种子培养基的100L—级种子罐中，接种量5%(v/v)，通气量lwm，搅拌转速120rpm，罐温25。C，培养25h，得到一级种子液；(4)将步骤(3)得到的一级种子液接入装有1000L种子培养基的1.5mS二级种子罐中，接种量7。/。(v/v)，通气量lvvm，搅拌转速120rpm，罐温25'C，培养30h，得到二级种子液；(5)步骤(4)得到的二级种子液接入装有5mS发酵培养基的7i^发酵罐中，接种量7%(v/v)，通气量lvvm，搅拌转速120rpm，罐温25。C，加入消泡剂siliconeSE-2(使用量为0.3g/L)，发酵生产3天，得DHA油脂。发酵结果见表9。培养基配方见表7、8:表7种子培养基配方物质浓度(g/L)物质浓度(g/L)MgCl23CaCl2.2H201KH2P044酵母膏2谷氨酸钠10KC12(续表7)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例5:流加模式裂殖弧菌的高密度发酵。如实施例4方法(1)-(4)种子培养，将得到的二级种子液接入装有51113发酵培养基的71113发酵罐中，接种量7。/。(v/v)，通气量lvvm，搅拌转速120rpm，罐温30'C，加入消泡剂siliconeSE-2(使用量为0.3g/L)，采用流加发酵模式，在葡萄糖浓度降低至1020g/L左右时，流加500g/L的葡萄糖液，至糖浓度为50~100/L，发酵生产5天，得DHA油脂。发酵结果见表IO。培养基配方同实施例7。表10流加发酵数据表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>可见，后期补糖，油脂含量得到了较大提升。发酵过程可分为菌体生长和油脂积累阶段，前期营养物质丰富，菌体大量合成细胞，生物量获得大的积累，后期氮源被消耗，给微生物创造一个高的碳氮比环境，油脂大量积累，本发酵工艺成功实现了微藻高密度培养和油脂高效积累。表11裂殖弧菌HX-308胞内脂肪酸分布情况脂肪酸成分占总脂肪酸含量(％)C14:05.85C15:00.51C16:024.15C16:l1.83C17:00.87C18:03.31C18:l4.34C22:518.01C22:641.13胞内脂肪酸分布见表ll，可以看出DHA和DPA是裂殖弧菌胞内主要的多不饱和脂肪酸，DHA含量在40%左右，其他不饱和脂肪酸主要为短链的饱和脂肪酸包括十四垸酸、软脂酸、硬脂酸和少量的但不饱和脂肪酸，基本不含EPA。其中十四垸酸含量在5%左右，降低了其对人体健康的负面影响。对胞内其他成分分析，发现除脂肪酸外，还含有较多的角鲨烯(见图2)和类胡萝卜素。其中角鲨烯是一种无毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物质，而类胡萝卜素可以防止不饱和脂肪酸的氧化。这两种物质在其他文献中未见报道，其存在提高了本发明DHA油脂的营养性和特殊性。实施例6:油脂的提取及精制。按照本专利提供的培养方法进行71113罐发酵，收获藻体。将发酵液倒入溶剂罐中，添加50kgCaCl2，使细胞絮凝沉淀，静置后，将上层溶液放出；用离心机将上述获得的菌体离心，实现进一步的固液分离。用NaOH配制pH为12的水溶液，将上步得到的菌体倒入pH12的水溶液中，再送入胶体磨中，将物料磨成小颗粒状，送入均质机中高压破碎，获得破碎的菌体。将其倒入萃取罐，按照水物料正己烷=1:1:6的比例进行萃取，搅拌30min左右，停止搅拌，静置分层。取上层溶液通过减压蒸发器将正己烷蒸出，回收溶剂，获得DHA粗油165kg。DHA毛油加入磷酸脱胶，NaOH碱炼脱酸，中和油脂中游离的脂肪酸，采用活性炭和白土脱色除去油脂中的色素及其他杂质，采用过饱和蒸汽除去油脂中的臭味，获得较高品质的DHA精油144kg。按照上述检测方法分析发酵液生物量、油含量、DHA含量，该实验具体实验数据见表12。表12DHA精油的检测结果7m3罐数据生物量粗油含量精油油含量精制收率355kg165kg144kg87%实施例7:油脂品质测定。根据GB/T5009.76-2003《食品添加剂中砷的测定》、GB/T5009.75-2003《食品添加剂中铅的测定》、ENISO660-1999《动植物油脂酸价和酸度的测定》、GB/T4789.2-2003《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》、GB/T4789.3-2003《食品卫生微生物学检验大肠杆菌群测定》、GB/T4789.4-2003《食品卫生微生物学检验沙门氏菌测定》、GB/T4789.5-2003《食品卫生微生物学检验志贺氏菌测定》所提供的方法对所获得的精油进行品质测定，结果见表13，各项指标均达到技术要求。表13DHA精油的品质测定结果检验项目单位技术要求检验结果砷(以As计)mg/Kg0.02铅(以Pb计)mg/Kg50.50.05酸价(以KOH计)mg/Kg1菌落总数cfU/g一<10大肠杆菌MPN/100g—<30沙门氏菌一—未检出志贺氏菌——未检出权利要求1、一种裂殖弧菌，其分类命名为裂殖弧菌(Schizochytriumsp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CCTCCNoM209059。2、一种利用权利要求1所述的裂殖弧菌生产DHA油脂的方法，其特征在于以CCTCCNo:M209059菌株为出发菌株，在液体培养基中高密度发酵获得菌体细胞，收集细胞经破碎、萃取、精制获得富含DHA的油脂。3、根据权利要求2所述的利用裂殖弧菌生产DHA油脂的方法，其特征在于所述的高密度发酵方法包括如下步骤(1)将保存在甘油管的菌株接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，在203(TC的摇床中，以150~200rpm的转速，培养24~48h，获得一级种子；(2)将一级种子接入装有lOOmL种子培养基的500mL摇瓶中，接种量2~10%(v/v)在2030'C的摇床中，以150-200卬m的转速，培养24~48h，获得二级种子；(3)将二级种子接入装有种子培养基的一级种子罐中，接种量2~10%(v/v)，通气量0.22wm，搅拌转速100200rpm，罐温203(TC，培养24~48h，得到一级种子液；(4)将步骤(3)得到的一级种子液接入装有种子培养基的二级种子罐中，接种量2~10%(v/v)，通气量0.22vvm，搅拌转速100200rpm，罐温2030。C，培养24~48h，得到二级种子液；(5)步骤(4)得到的二级种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量2~10%(v/v)，通气量0.22vvm，搅拌转速100200rpm，罐温2030'C，加入消泡剂，发酵生产DHA油脂。4、根据权利要求3所述的利用裂殖弧菌生产DHA油脂的方法，其特征在于所述的培养基，总渗透压维持在10002000mOsm丄"；其中，种子培养基C含量在10~30g/L;发酵培养基C含量在20~60g/L，N含量2.1~2.5g/L，S含量2~3g/L，P含量0.4~1.5g/L。5、根据权利要求24中任意一项所述的利用裂殖弧菌生产DHA油脂的方法，其特征在于培养基中，C源为葡萄糖、甘油或果糖；N源为酵母膏、牛肉膏、玉米浆、硝酸铵、硫酸铵或硝酸钾，P源为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，S源为硫酸镁或硫酸铵。6、根据权利要求3所述的利用裂殖弧菌生产DHA油脂的方法，其特征在于步骤(5)中，所述的消泡剂为siliconeSE-2，使用量为0.3g/L。7、根据权利要求3所述的利用裂殖弧菌生产DHA油脂的方法，其特征在于步骤(5)中，发酵生产DHA油脂釆用间歇式发酵或补料式发酵方法。8、根据权利要求2所述的利用裂殖弧菌生产DHA油脂的方法，其特征在于所述的破碎、萃取方法，采用如下三种方法之一(I)收集发酵获得的菌体细胞，6(TC烘干，碾碎，用有机溶剂浸提1218h，得到富含DHA的毛油；(II)收集发酵获得的菌体细胞，采用破壁酶破碎细胞，再用有机溶剂浸提48h，得到富含DHA的毛油；(m)收集发酵获得的菌体细胞，碱性环境下使用均质机机械破碎，破碎的细胞再用有机溶剂浸提4~8h，得到富含DHA的毛油。9、根据权利要求8所述的利用裂殖弧菌生产DHA油脂的方法，其特征在于所述的有机溶剂为正己烷、石油醚、乙醇和乙醚中的任意一种或几种的混合。10、根据权利要求8所述的利用裂殖弧菌生产DHA油脂的方法，其特征在于方法(II)中所述的破壁酶为纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶中的一种或几种的组合，添加量为2-8g/L。11、根据权利要求2所述的利用裂殖弧菌生产DHA油脂的方法，其特征在于所述的精制方法包括脱胶、碱炼、脱色和脱臭工序中的任意一种或几种的组合。全文摘要本发明公开了一种裂殖弧菌，其分类命名为裂殖弧菌(Schizochytriumsp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CCTCCNo.M209059。本发明还公开了利用上述裂殖弧菌生产DHA油脂的方法。本发明从渗透压和元素供应角度优化菌株发酵培养基，并结合流加策略，实现微藻的高密度发酵，最终细胞干重达到70g/L，油脂含量达31.5g/L，DHA占总脂肪酸含量高于35％。通过本发明方法所获得的DHA精油各项指标符合食品添加剂标准，且含有生物活性物质角鲨烯，整套工艺简单，操作方便，生物量和DHA含量较高，降低了发酵成本，适合工业化生产。文档编号C12P7/64GK101575584SQ200910033869公开日2009年11月11日申请日期2009年6月18日优先权日2009年6月18日发明者任路静,娟李,肖爱华,金立晶,和黄申请人:南京工业大学