专利名称：疟疾疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于抗原的疟疾疫苗，其含有衍生自与恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)富谷氨酸蛋白质(GLUPR)遗传偶联的至少一种其他恶性疟原虫来源的蛋白质(例如裂殖子表面蛋白3(MSP3))的融合蛋白；或者涉及含有编码该融合蛋白的DNA的疫苗和这种疫苗的生产。
背景技术：
疟疾侵袭世界人口的40％，估计每年有1.5-2.7百万例死亡(57)。这给人类造成了巨大的苦难和负担，阻碍受侵袭的地方社会的发展。疟疾现在几乎局限于非洲、亚洲和拉丁美洲最穷的热带地区，但是以前已经根除疟疾的地区正被再次传播。疟疾是世界上最严重的公共健康问题之一。
越来越多的杀虫剂抗性载体和药物抗性寄生虫的出现要求在新的和更好的控制工具方面进行投资。疟疾疫苗具有极大地减轻疟疾负担的潜力。然而，由于我们对潜在的保护性免疫机制理解得还不完全，因此，仍然需要定义特定保护标记物。
有效的疟疾疫苗需要诱导适当的体液和细胞免疫应答，以对抗在寄生虫生命周期的不同阶段表达的一些关键寄生虫抗原。生命周期中的每一阶段均为疫苗提供了机会。
两条路线的证据表明可以得到疟疾疫苗首先，已经非常明确地观察到反复暴露于疟疾寄生虫可导致形成坚固的临床免疫(clinical immunity)——寄生虫和保护性抗体共存的一种传染病免疫状态。临床免疫个体通常具有较低的寄生虫密度并且该免疫在降低死亡率方面十分有效。
其次，在人类和动物模型中的实验已经确定免疫可诱导针对随后的寄生虫攻击的免疫力，提示接种可成为控制疟疾的一种现实的工具。
在现在的经典实验中，Cohen和同事阐明从临床免疫个体中纯化的抗体的被动转移可以在患有威胁生命的恶性疟原虫感染的非洲儿童中改善急性疟疾发作(10)。Druilhe和同事证实了Cohen的结果(42)。他们证明来自临床疟疾免疫的西非人的IgG能够以独立于株系的方式实质性地降低患有药物抗性恶性疟原虫疟疾的无症状泰国儿童的寄生虫负荷。
这些突破性的被动转移实验已经证明抗体在减少/消除无性阶段寄生虫负荷中是关键的。
然而，使用相同的“保护性”IgG制剂的体外研究(42)阐明抗体自身不抑制寄生虫生长，而是与血液单核细胞协同作用以控制寄生虫繁殖(5)。该含有寄生虫的机制被称为抗体依赖的细胞抑制(ADCI)(5，26，31)。最近的研究进一步阐明嗜细胞抗体(如IgG1和IgG3)经由血液单核细胞的FcγIIa受体与血液单核细胞的结合引发杀伤因子(如肿瘤坏死因子-α)的释放(6)。
免疫-流行病学研究通过证明临床免疫力的获得与IgG1和IgG3抗体(它们良好地结合单核细胞FcγRIIa受体)水平之间的相关性，而支持单核细胞依赖的、抗体介导机制的体内关联性(1，41)。还发现FcγRIIa的等位基因多态性与对恶性疟原虫疟疾的差别易感性有关，这也支持所推定的该受体参与临床疟疾免疫性的形成(45)。据报导，FcγRIIa-Arg131等位基因纯合的肯尼亚婴儿与具有杂合Arg/His131基因型的儿童相比高密度感染恶性疟原虫的危险较小(45)。由于FcγRIIa-Arg131基因型(而不是FcγRIIa-His131基因型)强烈结合IgG1和IgG3，所以该发现支持如下观点单核细胞介导的恶性疟原虫杀伤是体内遏制寄生虫的重要机制。此外，Aucan等人(2)发现特定IgG2抗体——而不是IgG3和IgG1——的水平与Bukina Faso群体中的临床疟疾保护有关。随后对FcγRIIa的测序揭示70％的研究受试者有FcγRIIa-H131等位基因。该等位基因强烈结合IgG2(56)，表明IgG2在该群体中作为嗜细胞亚类起作用(2)。总之，这些观察提示FcγRIIa基因型是产生临床疟疾免疫力的重要因子并对体外ADCI模型的有效性提供支持。
由于药物抗性疾病发生率的不断增加，疟疾疫苗的开发已经日益被认为是世界范围内首选的控制疟疾的努力。因此需要新工具以便于候选疫苗的临床评估，尤其是确证由接种提供的保护的体外关联性。ADCI可提供一种这样的工具(13)。当前最突出的血液阶段疫苗候选者MSP1、MSP2、AMA1和RESA由于在临床前动物模型中诱导生长抑制性抗体的能力而已经被初步选择用于临床试验中(9，16，30，55)。然而，尽管最初有希望，但是它们已被证明通常在人类志愿者中具有差的免疫原性(18，25，29，43)并且所诱导的抗体不能抑制恶性疟原虫的体外生长。因此，体外侵袭抑制试验还不能作为免疫性的替代标记物。
由于人类保护中缺乏反映裂殖子侵袭抑制的适宜关联物，从而已经促进了反映临床免疫个体中可能的杀伤机理的其他体外模型的开发。Druilhe和同事推测抗体与人血液单核细胞协同作用以控制体内寄生虫生长并且由此开发了该杀伤机理的体外关联物——ADCI试验。我们到目前为止已经鉴定了两种抗原——GLURP和MSP3，它们是ADCI有效的人抗体的靶标。
恶性疟原虫富谷氨酸蛋白质(GLURP)和裂殖子表面蛋白3(MSP3)都是人IgG抗体的靶标，IgG抗体可以以依赖单核细胞的方式体外抑制寄生虫生长(36，52)和在人源化SCID小鼠模型中体内抑制寄生虫生长(3)。一些免疫-流行病学研究也揭示了针对这些抗原的人抗体的类似效果，这些研究说明GLURP和MSP3特异性嗜细胞抗体(IgG1和IgG3)的水平与疟疾发作的危险性降低显著相关(11，38，50)。
GLURP和MSP3的发现基础是对利用纯化的非洲人免疫球蛋白G进行的免疫性被动转移的体外分析(5，6，14，42)。这些研究已经导致对恶性疟原虫疟疾的防御中假定的效应子机理的阐释(12)，和对有关的寄生虫分子的随后鉴定。这些人类IgG抗体识别的主要B-细胞表位已经被分别定位于GLURP27-489和MSP3212-257区中的保守序列(36，50，51)。这些研究导致GLURP的N端区(GLURP27-489)(52)和MSP3的C-端区(MSP3210-380)(36)被鉴定为生物学活性抗体的靶标。
以前已经在大肠杆菌中产生了融合各种亲和标签的这些抗原的不同区域(35，53，54)。尽管这些附加的序列对于纯化有利，但是它们造成了潜在问题，因为针对这些序列的宿主免疫应答可以使得它们不能用于反复应用。
免疫流行病学研究证实了抗GLURP和抗MSP3抗体与获得性保护的相关性对于GLURP，在Dielmo、Senegal(38)，Dodowa、Ghana(11，50)和OoDo、Myanmar(Soe Soe，未发表)中进行的三个独立研究已经阐明GLURP特异的IgG3和/或IgG1抗体水平与抗疟疾发作的保护作用之间存在统计学上显著的相关性。即使在控制了由年龄相关的恶性疟原虫暴露造成的混淆性效果后，该相关性也是高度显著的。这些结果证实了以前的研究，这些以前的研究发现天然发生的针对GLURP的IgG抗体与冈比亚儿童中的疾病对抗保护相关(15)并且与利比亚(21)和布基纳法索(4)的儿童中对抗高水平的寄生虫血症的保护作用相关。
对于MSP3，嗜细胞抗体与非嗜细胞抗体(IgG1+IgG3/IgG2+IgG4+IgM)的高比值(＞2)使得可以区分没有疟疾发作记录的个体与有疟疾发作的个体。在来自Dielmo的约200个村民的每个年龄组中都发现该现象，这些村民已经处于长达8年以上的每日临床监测中(37)。在个体水平，与针对相同分子的其他同种型抗体或者针对5种其他抗原的任一同种型抗体相反，抗MSP3 IgG3抗体的出现与保护作用强烈相关(37)。
对于任何其他疟疾疫苗候选者(如MSP1——迄今主要的针对恶性疟原虫疟疾的疫苗候选者)，血清流行病学数据中类似的一致性并不常见。
这些人IgG抗体识别的主要B细胞表位已被分别定位于GLURP27-489和MSP3212-257区的保守序列上(36，50，51)。这些研究导致GLURP的N末端区(GLURP27-489)(52)和MSP3的C端区(MSP3210-380)(36)被鉴定为生物学活性抗体的靶标。
对来自44个恶性疟原虫野外分离株和实验室株系的GLURP27-489和MSP3210-380区域的序列分析显示，被ADCI有效人类抗体靶定的GLURP(P1、P3和P4)(48)和MSP3(b肽)(34)中的确定表位几乎完全保守，表明它们功能性地受到限制并且不发生氨基酸水平上的变异选择。在GLURP27-489区的不同表位中，P3可能是最重要的，因为亲和纯化的抗P3肽人抗体体外介导最强的ADCI效应(51)。GLURP和MSP3中主要B细胞表位的保守性可被下面的观察进一步支持这些主要B细胞表位在恶性疟原虫和最紧密相关的寄生虫——里氏疟原虫(Plasmodiumreichenowi)(黑猩猩的一种天然寄生虫)之间几乎是一致的(39，53)，并且来自临床疟疾免疫的71个成年利比亚人的血浆IgG抗体对代表来自两个物种的GLURP27-500区的重组蛋白表现出相同的结合模式(53)。
总之，这些发现表明被生物学有效的人抗体识别的GLURP和MSP3B细胞表位在地理上遥远的恶性疟原虫分离株之间是保守的并且功能性地受到限制，由此提示基于GLURP和MSP3的疫苗可以提供对抗世界范围内广谱寄生虫株系的保护作用。
体外实验表明亲和纯化的天然抗GLURP(52)和MSP3(36)人抗体可以以单核细胞依赖的方式抑制寄生虫生长，而基于其他7种疟疾疫苗候选者的亲和纯化的对照抗体不能发挥类似作用(47)。
使用针对重组蛋白(GLURP27-489，和GLURP705-1178)(52)和来自GLURP R0区的合成肽，即P3(GLURP93-207)、S3(GLURP407-434)或LR67(GLURP85-312)(50，51)的天然发生的亲和纯化的IgG抗体得到相同的抑制效果。
体内实验中，将亲和纯化的MSP3b特异的人抗体被动转移到恶性疟原虫感染的Hu-RBC BXN小鼠中，该体内实验表明寄生虫清除与氯奎诱导的寄生虫清除一样快，并且快于总的非洲人IgG诱导的清除(3)。后一观察表明用选择的抗原进行免疫可以导致比完整寄生虫诱导的免疫性更强的免疫性(3)。
体内实验中，用弗氏完全佐剂中的重组MSP3免疫的夜猴(Aotusmonkey)被完全保护而免受实验性恶性疟原虫攻击(20)。对松树猴(Saimiri sciureus)的免疫表明吸附到Al(OH)3上的GLURP27-500是无毒的、具有免疫原性并且引起高效价抗GLURP抗体，该抗体通过IFA识别恶性疟原虫(8)。在随后用恶性疟原虫感染的红细胞进行的攻击中，三只猴子中的两只被部分保护，该效果与灵长类动物应答免疫原所产生的抗体的效价和表位专一性直接相关(8)。
这些发现强烈支持如下观点引起ADCI有效抗体的、针对GLURP和MSP3B细胞表位的免疫应答控制体内寄生虫繁殖。
以前已经在大肠杆菌中产生了融合各种亲和标签的这些抗原的不同区域(35，53，54)。尽管这些附加序列对于纯化有利，但是它们造成了潜在问题，因为针对这些序列的宿主免疫应答可以使得它们不能用于反复应用。因此需要开发表达系统，其目的是产生没有载体编码的亲和标签的重组蛋白。
已经选择了有限数目的基于MSP3和GLURP的制剂用于进一步疫苗开发，并已经首先在小鼠(49，54)然后在恶性疟原虫攻击的非人灵长类动物(8)中进行了临床前水平研究。GLURP的N-端区和MSP3的C-端区在临床前模型中被证明具有强免疫原性。现在已经使用新的、基于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的pH和生长期调节性启动子P170的高效表达系统分别生产这些区域(23，33)。
我们到目前为止鉴定了两种抗原——GLURP和MSP3，它们是ADCI-有效的人抗体的靶标，并且最近用各抗原分别完成两个I期临床试验。两种疫苗都在志愿者中诱导强细胞应答，而IgG抗体应答是中等的。GLURP试验的所有志愿者都产生了针对P3B细胞表位的抗体，该表位在临床免疫个体中是ADCI有效抗体的最突出的靶标。疫苗诱导的抗体的相对低水平可能与GLURP合成肽上B细胞表位的数目有限有关。
因此，需要开发基于重组蛋白的疫苗，其包括GLURP和MSP3(优选地具有含有额外的B细胞和T细胞表位的相邻序列)或者来自恶性疟原虫的其他抗原(如CS-抗原)。还需要使用产生没有载体编码的亲和标签的重组蛋白的表达系统，如乳酸乳球菌。
发明概述本发明公开了针对疟疾的疫苗，其改善了疫苗诱导的抗体表达。该疫苗含有融合蛋白或者含有编码所述融合蛋白的相应核苷酸序列，其中所述融合蛋白衍生自与恶性疟原虫富谷氨酸蛋白质(GLUPR)遗传偶联的至少一种其他恶性疟原虫来源的蛋白质(例如裂殖子表面蛋白3(MSP3))。
发明详述本发明公开了基于抗原的疟疾疫苗，其含有融合蛋白或者其同系物，其中所述融合蛋白衍生自与恶性疟原虫富谷氨酸蛋白质(GLURP)遗传偶联的至少一种其他恶性疟原虫来源的蛋白质。
本发明的一个优选实施方案是疫苗，其中遗传偶联到GLURP的蛋白质来自恶性疟原虫的裂殖子表面蛋白3(MSP3)，所述融合蛋白优选具有SEQ ID NO 1中显示的氨基酸序列。
在另一实施方案中，该疫苗含有SEQ ID NO 1和其它来自恶性疟原虫的蛋白质的免疫原性表位。
本发明还公开了具有SEQ ID NO 1中所示氨基酸序列的融合蛋白，并提示了还含有来自恶性疟原虫的一种或多种蛋白质的一个或多个免疫原性表位的融合蛋白，其中所述蛋白为例如CS、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、MSP6、AMA1、Pf155/RESA、RAP1、EBA-175、pfEMP1、EXP1、LSA1、LSA3、Pf25、Pf45/48、Pf230、Pf27、Pf16、或Pf28。
本发明还涉及从重组细菌(例如乳球菌)制备上面提到的融合蛋白。
另一方面，本发明涉及编码上述融合蛋白的核酸和所述核酸在制备疫苗中的用途。用于疫苗的核酸的一个优选实施方案是如SEQ ID NO 2中所示的序列。
还在另一个实施方案中，该疫苗包含含有编码上述融合蛋白的核酸序列的重组BCG。
因为基于GLURP和MSP3的疫苗诱导相同类型的免疫应答(即高水平嗜细胞抗体)并且可能彼此互补作为免疫系统的靶标，所以在新型基因表达系统中将相应的GLURP25-500和MSP3212-382区作为重组杂合物一起导入乳酸乳球菌中，该基因表达系统基于pH和生长期调节性启动子——来自乳酸乳球菌的P170(7，23，33，56)。该基因表达系统提供了一种简单的发酵方法，其被开发专门用于P170启动子。乳酸乳球菌被选做表达宿主是因为i)其是一种被良好表征的、工业上普遍认可的安全(GRAS)微生物，其最令人熟知的用途是用于生产发酵的奶制品，ii)其可以生长在已知成分的合成培养基中；iii)重组蛋白质可被分泌到培养基上清液中，可以从上清液容易地纯化重组蛋白质，iv)其不产生毒性物质。
现在已经使用乳酸乳球菌在嵌合的融合蛋白中以杂合蛋白形式生产GLURP的N-端区和MSP3的C-端区。
已经使用Montanide(Seppic)作为佐剂在小鼠中研究了杂合蛋白的免疫原性。Montanide与分别来自GLURP和MSP3的长合成肽用于最近的临床试验中。使用杂合蛋白免疫总是比两种分子的混合物产生更强的针对各GLURP和MSP3域的抗体应答。
对于MSP3-特异抗体应答，该差异最显著，表明位于GLURPR0-区中的T细胞表位为MSP3区中的B细胞表位提供了帮助。这是GLURP抗原的令人惊奇的能力，该抗原也可与其他疟疾抗原一起使用。
相反，当用GLURP和MSP3的混合物注射动物时，小鼠个体倾向于产生针对分子之一的主要抗体应答。在一些动物中，GLURP是免疫优势的，而在其他动物中MSP3是优势免疫原。
在临床免疫的成年非洲人中，杂合抗原比单独抗原更有效地被天然发生的IgG抗体识别。
因此，与单独的GLURP和MSP3分子相比，GLURP-MSP3杂合蛋白有4个主要优点i)其比单独分子的任何组合都更具免疫原性，ii)其产生针对GLURP和MSP3两者的强烈免疫应答，iii)其允许在单一临床试验中测试GLURP和MSP3两者，
iv)预期其和单独的分子一样安全，因为在小鼠和非人灵长类动物中的临床前试验已经表明在GLURP和MSP3之间的融合连接处不含有新表位。
其他鉴定的适宜作为GLURP抗原的融合配偶体的恶性疟原虫抗原是CS、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、MSP6、AMA1、Pf155/RESA、RAP1、EBA175、pfEMP1、EXP1、LSA1、LSA3、Pf25、Pf45/48、Pf230、Pf27、Pf16、或Pf28。
定义融合蛋白重组融合蛋白由如下核苷酸序列编码，所述核苷酸序列是通过遗传连接来自一个基因的不同区域的核苷酸序列和/或连接来自两个或多个分开的基因的核苷酸序列而得到的。这些核苷酸序列可来自恶性疟原虫，但是它们也可以来自其他生物、用于克隆步骤的质粒或者来自其他核苷酸序列。
免疫原性片段或表位免疫原性片段或表位被定义为可以在当前或者以前被如疟疾之类的微生物感染的生物样品或者个体中诱导免疫应答的蛋白质的一部分。
可以通过下面方法之一监视免疫应答·通过取自当前或者以前被疟疾感染的动物或人的淋巴细胞的相关细胞因子(如IFN-γ)释放，或者通过对这些T-细胞的增殖的检测来测定体外细胞应答。通过将多肽或者免疫原性部分加入每孔含有1×105个细胞到3×105个细胞的悬浮液中实施诱导。细胞分离自血液、脾脏、肝脏或者肺，多肽或者免疫原性部分的加入导致浓度不超过20μg/ml悬浮液并且实施刺激2到5天。为了监视细胞增殖，用放射性标记的胸苷脉冲细胞。在孵育16-22小时后，通过液体闪烁计数检测增殖。阳性应答为大于背景加两个标准差的应答。可通过ELISA方法测定IFN-γ的释放，该ELISA方法是本领域中技术人员熟知的。阳性应答为大于背景加两个标准差的应答。当监视对多肽的免疫应答时，除IFN-γ外的其它细胞因子(如IL-12、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10、IL-6、TGF-β)可能是恰当的。确定细胞因子(例如，IFN-γ)的存在的另一种更灵敏的方法是ELISPOT方法，其中从血液、脾脏、肝脏或者肺分离的细胞被稀释到优选1到4×106个细胞/ml的浓度并在不超过20μg/ml浓度的多肽或者免疫原性部分的存在下孵育18-22小时。此后，将细胞悬浮液稀释到1到2×106/ml并转移到用抗-IFN-γ包被的Maxisorp板并优选孵育4到16小时。可以使用标记的第二抗-IFN-γ抗体和产生点的相关底物确定产生IFN-γ的细胞，所产生的点可以使用解剖显微镜计数。还可以使用PCR技术确定编码相关细胞因子的mRNA的存在。通常，将使用如PCR、ELISPOT或者ELISA测量一种或多种细胞因子。本领域技术人员将明白被特定多肽诱导的这些细胞因子中任一种的量的显著增加或减少都可以用于评价多肽的免疫学活性。
·也可以使用来自免疫个体或者疟疾感染者的T细胞系测定体外细胞应答，其中该T细胞系已经被活恶性疟原虫、该寄生虫的提取物或者培养物滤液在加入IL-2的情况下驱动10到20天。通过将不超过20μg多肽/ml的悬液加入每孔含有1×105个细胞到3×105个细胞的T细胞系从而实施诱导，并孵育2到6天。通过ELISA检测IFN-γ的诱导或者另一种相关细胞因子的释放。也可以如上描述用放射性标记的胸苷检测细胞增殖来监视对T细胞的刺激。对于两种测定法，阳性应答是大于背景加两个标准差的应答。
·在对临床或者亚临床感染恶性疟原虫的个体皮内注射或者作为贴剂局部应用最多100μg多肽或者免疫原性部分后，可以以阳性DTH应答形式确定体内细胞应答，在注射或应用后72-96小时阳性应答具有至少5mm直径。
·通过免疫或者受感染的个体中特异的抗体应答测定体外体液应答。可通过ELISA技术或者蛋白质印迹确定抗体的存在，其中多肽或者免疫原性部分被吸附到硝酸纤维素膜或者聚苯乙烯表面。优选以1∶10到1∶100将血清稀释于PBS中，并加到所吸附的多肽中并孵育1到12小时。通过使用标记的第二抗体，可通过测量OD(例如通过ELISA，其中阳性应答是大于背景加两个标准差的应答)或替代性地通过蛋白质印迹中的可见应答确定特异抗体的存在。
·另一个相关参数是在用佐剂中的多肽接种或者DNA接种后测量动物模型中诱导的保护作用。适宜的动物模型包括灵长类动物、豚鼠或小鼠，它们被感染攻击。所诱导的保护作用的读出可以是与未接种动物相比的寄生虫密度降低、与未接种的动物相比延长的存活时间和与未接种动物相比减小的重量损失。
同系物蛋白同系物被定义为本发明的融合蛋白的类似物或变体。该融合蛋白的特征在于特定的氨基酸并且被特定的核酸序列编码。应理解这些序列包括通过重组或合成方法产生的类似物和变体，其中这些多肽序列已经通过在重组多肽中置换、插入、加入或缺失一个或多个氨基酸残基而被修饰，但是在此处描述的任一种生物学测定法中仍然具有免疫原性。置换优选为“保守的”。置换优选为密码子用法中的沉默置换，其不导致氨基酸序列的任何变化，但是可被导入以增强蛋白质的表达。这些根据下表定义。第二列中相同方框中的氨基酸和优选地第三列中相同行中的氨基酸可以相互置换。第三列中的氨基酸以单字母码表示。
疫苗，蛋白质本发明涉及含有根据本发明的融合蛋白的疫苗组合物。为了确保这种疫苗组合物的最佳性能，优选该疫苗组合物含有免疫学和药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
与未接种的动物相比，有效疫苗(其中本发明的蛋白质被动物识别)在动物模型中能够在疟疾寄生虫攻击后减少血液和靶器官中的寄生虫负荷，延长存活时间和/或减少体重损失。
此外，本发明的融合蛋白可以偶联到糖或者脂质部分(例如、载体)，或者以其他方法修饰，例如，被乙酰化。
当在微生物中生产时，如果不采取特殊措施，本发明的融合蛋白将通常不被乙酰化。因为乙酰化的多肽在细胞、血液或身体和组织液中可能更稳定，所以乙酰化可能是有利的。此外，乙酰化可赋予多肽能够模拟天然恶性疟原虫抗原的结构和构象的结构和构象。
适宜的载体选自通过疏水非共价相互作用结合多肽的聚合物，如塑料(例如聚苯乙烯)，或者共价结合多肽的聚合物，如多糖，或多肽(如牛血清白蛋白、卵清蛋白或者匙孔槭血蓝蛋白)。适宜的赋形剂选自稀释剂和悬浮剂。佐剂优选选自溴化二甲基双十八烷基铵(DDA)、Quil A、poly IC、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、IFN-γ、IL-2、IL-12、单磷酰基脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、海藻糖二山嵛酸酯和胞壁酰基二肽(MDP)。
含有作为活性成分的肽序列的疫苗的制备是本领域中熟知的，如美国专利4,608,251、4,601,903、4,599,231和4,599,230所例证的，所有这些专利在此处被并入作为参考。
实现用于疫苗的佐剂效果的其他方法包括使用试剂如氢氧化铝或者磷酸铝(alum)、糖的合成聚合物(Carbopol)，通过热处理使疫苗中的蛋白质聚集，通过与胃蛋白酶处理的针对白蛋白的(Fab)抗体反应聚集，与细菌细胞(如C.parvum)或革兰氏阴性细菌的内毒素或者脂多糖组分混合，在生理学上可接受的油性赋形剂如一油酸二缩甘露醇酯(Aracel A)中乳化或者也可以使用用作block substitute的20％全氟化碳(Fluosol-DA)溶液进行乳化。其他可能方案包括联合上述佐剂使用免疫调节物质如细胞因子或者合成的IFN-γ诱导剂(如poly IC)。
另一种实现佐剂效果的有意义的可能方案是使用Gosselin等人，1992(19)中描述的技术。简言之，相关抗原(如本发明的抗原)可以被缀合到针对单核细胞/巨噬细胞上Fcγ受体的抗体(或者结合抗原的抗体片段)上。
疫苗以与剂量配制相容的方式施用，并且所施用的量是治疗有效的和免疫原性的。所施用的量依赖于所治疗的受试者，包括如个体的免疫系统发动免疫应答的能力，和所希望的保护程度。适宜的剂量范围约为每次接种几百微克活性成分，优选的范围为约0.1μg到1000μg，如约1μg到300μg的范围，特别约10μg到50μg的范围。最初施用和强化接种的适宜方案也是可变的但是通常为最初施用后接着随后接种或其他施用。
应用的方式可以变化很大。可以应用任何施用疫苗的常规方法。这些方法被认为包括在固态生理学上可接受的基质上或在生理学上可接受的分散体中口服应用，和通过注射等的肠胃外应用。疫苗的剂量将依赖于施用途径并根据所要接种的人的年龄而变化和较小程度地根据所接种的人的尺寸而变化。
通常通过注射，例如皮下或者肌内注射，肠胃外施用疫苗。适于其他施用模式的其它制剂包括栓剂和，在某些情况中，口服制剂。对于栓剂，常规结合剂和载体可包括如聚烷烯二醇或甘油三酯；可以从含有0.5％到10％(优选1-2％)活性成分的混合物形成这些栓剂。口服制剂包括这些通常使用的赋形剂，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液剂、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或者粉剂的形式并且优选含有10-95％的活性成分，优选25-70％的活性成分。
在许多情况中，必须多次施用疫苗。特别地，可以施用疫苗以预防疟疾感染和/或治疗已确立的疟疾感染。当施用疫苗预防感染时，在感染的确定临床病征或者症状出现之前，预防性地施用该疫苗。
由于基因变异，不同个体对于相同蛋白质的免疫应答可能具有不同的强度。因此，根据本发明的疫苗可以含有一些不同的蛋白质以便增强免疫应答。疫苗可以含有两种或多种多肽或免疫原性部分，其中所有蛋白质如上面定义，或者这些肽中的一些(但不是所有)可以来自恶性疟原虫或者其他微生物。在后一实例中，不一定满足上面为多肽提出的标准的多肽可以由于它们的自身免疫原性而起作用或者仅仅作为佐剂起作用。
疫苗可以含有1-20(如2-20或者甚至3-20种)不同的蛋白质者融合蛋白，如3-10种不同的蛋白质或融合蛋白。
本发明还涉及免疫动物(包括人)以抵抗例如由恶性疟原虫导致的疟疾的方法，该方法包括对动物施用本发明的融合蛋白，或如上描述的本发明疫苗组合物，或下述活疫苗。
本发明还涉及生产根据本发明的免疫组合物的方法，该方法包括制备、合成或分离根据本发明的融合蛋白，并将该融合蛋白溶解或分散在用于疫苗的介质中，并任选加入其他抗原和/或载体、赋形剂和/或佐剂物质。
本发明的另一方面是在重组微生物中产生本发明杂合蛋白，该重组微生物除了表达编码本发明杂合蛋白的DNA序列之外，还表达对不同于疟疾的另一种疾病(例如结核病)具有治疗或保护效果的一种或多种抗原。这些其他抗原可以作为分开的抗原表达或者与本发明杂合蛋白相融合而表达。对Tb有效的其他抗原的实例是ESAT6、CFP7、CFP10、CFP29、ORF2c、TB13、MPT59、α-crystalline、Rv0285和它们的杂合物，但是该概念不仅限于TB或者针对TB的抗原。
疫苗DNA本发明的核酸片段可用于实现抗原的体内表达，即核酸片段可用于所谓的DNA疫苗中(如Ulmer等人，1993所综述的，其被并入为参考文献)。
因此，本发明还涉及含有根据本发明的核酸片段的疫苗，该疫苗实现了该疫苗所施用的动物(包括人)对抗原的体内表达，所表达的抗原的量可有效赋予动物(包括人)对恶性疟原虫导致的感染具有显著增加的抗性。
通过将编码表达产物的基因与编码能够调节免疫应答的多肽的DNA片段一同施用，可能可以增加这种DNA疫苗的效力。
活重组疫苗可以通过在非病原性微生物或者病毒中表达疫苗的相关抗原，有效地活化针对疫苗的细胞免疫应答。这种微生物的熟知的实例是牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG、沙门氏菌(Salmonella)和假单胞菌(Pseudomona)，病毒的实例是痘苗病毒和腺病毒。
因此，本发明的另一重要的方面是当前可获得的活BCG疫苗的额外品质，其中编码如上面定义的一种或多种融合蛋白的DNA序列的一份或多份拷贝已经以允许微生物表达并分泌该蛋白质的方式掺入到该微生物的基因组中。可以考虑掺入本发明多核苷酸序列的一份以上的拷贝以增强免疫应答。
本发明的另一方面是非病原性微生物，如乳酸乳球菌或者BCG，该微生物表达编码如上定义的一种或多种融合蛋白的DNA序列并额外表达一种或多种其它抗原，所述其它抗原对不同于疟疾的疾病(例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)导致的结核病)具有治疗或保护作用。这些其他抗原可作为分开的抗原表达或者与本发明杂合蛋白融合而表达。对Tb有效的其他抗原的实例(通过它们的Sanger数据库登录号鉴别)是Rv3875(ESAT6)、Rv1886c(Ag85B)、Rv0288(CFP7)、Rv3874(CFP10)、Rv0798c(CFP29)、Rv2031c(α-crystalline)和Rv0285或者它们的片段或杂合物，最优选ESAT6-Ag85B杂合物，但是该概念不仅限于TB或针对TB的抗原。
通过将编码表达产物的基因与编码能够调节免疫应答的多肽的DNA片段一起施用可能可以增强这种DNA疫苗的效果。例如，可以将编码淋巴因子前体或者淋巴因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-12)的基因与编码免疫原性融合蛋白的基因一起施用，可通过施用两种分开的DNA片段或者通过施用包含在同一载体中的两种DNA片段实现该施用。
另一可能性是将编码根据本发明的多肽的DNA整合在减毒病毒(如痘苗病毒或腺病毒)中(40)。重组痘苗病毒能够在受感染的宿主细胞的细胞质中复制并且目的蛋白可因此诱导免疫应答，预期该免疫应答诱导对抗疟疾的保护作用。
治疗性疫苗本发明还涉及本发明融合蛋白或核酸用作如D.Lowry(Lowry等人1999)在文献中描述的治疗性疫苗的用途。可根据当作为疫苗施用时，实验动物中降低疟疾感染的严重性或者防止以前的感染再活化的能力来鉴定具有治疗性质的抗原。可以根据如上关于疫苗的描述来制备用作治疗性疫苗的组合物。
附图简述
图1.pPSM1013和pAMJ328和用于乳酸乳球菌的表达构建体的示意图。指出了文中提到的载体编码的限制位点的位置、启动子P170、Shine-Dalgarno序列(SD)和310mut2信号肽。预期信号肽酶在32和33号氨基酸之间切割，从而在成熟重组蛋白的N-末端留下Ala-Glu残基。glurp和MSP3的核苷酸编号分别相对于M59706和L07944的ATG密码子中的A。
图2.(A)纯化的乳酸乳球菌MG1363中产生的GLURP-MSP3融合蛋白(泳道1)、GLURP25-514(泳道2)，和MSP3212-380(泳道3)的12.5％聚丙烯酰胺凝胶的考马斯蓝染色。(B)C4柱上分别对GLURP-MSP3杂合蛋白和GLURP25-514的HPLC分析。指出了分子量标准参照物的大小(千道尔顿)。(C)GLURP-MSP3杂合蛋白和GLURP25-514的推导的氨基酸序列和肽作图。GLURP-MSP3杂合蛋白的头四个氨基酸(Ala-Glu-Arg-Ser)来自克隆载体pSM1013。从考马斯染色的SDS-PAGE凝胶切出用于肽质量作图的样品。基本如所描述的(44)，将条带的一半(约1μg蛋白质)洗涤、干燥、还原并用碘乙酰胺烷基化，之后用修饰的胰蛋白酶(Promega，USA)过夜消化。将消化物的上清液应用于填装Poros 20 R2反相柱材料(PerSeptive，USA)的GELoader tips(Eppendorff，德国)并用0.8μlα-氰基羟基肉桂酸(于70％乙腈/30％水中20μg/μl)直接洗脱到MALDI靶上(28)。在以反射镜模式运行的PerSeptive Voyager STR(PerSeptive，USA)上实施分析并在GPMAW ver.5.02(Lighthouse data，丹麦)中分析结果。MALDI-TOF谱中肽所覆盖的序列加有下划线并指出总的测序覆盖百分比。
图3.来自临床疟疾免疫的成年利比亚人的71个血浆样品中对GLURP和MSP3衍生抗原对的IgG抗体应答模式。在每图中提供了相关系数和P值。
图4.小鼠中的抗体应答。用杂合物(gr7)、一个注射器中的GLURP和MSP3的混合物(gr8)，或处于分开的注射器中于不同部位注射的GLURP和MSP3(gr9)对每组10只小鼠免疫。(A)在用GRURP25-514或者MSP3212-380包被的ELISA板上测试第35天的血浆样品的抗体反应性。箱图显示了中位数、第25和第75百分位数，须状线(whisker)显示了数据的范围。(B)小鼠血清对代表GLURP B细胞表位的8种肽的累积应答。(C)结果示于A图的小鼠的同种型应答。每个垂直棒代表GLURP和MSP3特异性ELISA中的平均吸收(±SEM)。
图5.杂合物仅含有GLURP和MSP3来源的B细胞表位。将来自用杂合物免疫的小鼠的血浆池与指明浓度的GLURP、MSP3、GLURP和MSP3的混合物或者杂合物预孵育，之后加入用该杂合物包被的ELISA。与GLURP和MSP3的混合物或者杂合物预孵育完全抑制Ig抗体与杂合物的结合。
图6.恶性疟原虫NF54的免疫印迹分析。在7.5％聚丙烯酰胺凝胶上分离完整细胞提取物并用血浆进行免疫印迹，这些血浆来自用GLURP25-514(泳道1)、MSP3212-380(泳道2)和GLURP-MSP3杂合物(泳道3)免疫的小鼠。图中指出了分子量标准参照物的大小(千道尔顿)。
实施例实施例1材料和方法细菌菌株、质粒和生长条件。含有指明的质粒的大肠杆菌DH10B(K-12，F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔm15ΔlacX74deoRrecA1 endA1 araD139Δ(ara，leu)7697galUgalKλ-rpsL nupG)(LifeTechnologies)生长于补加红霉素(200μg/ml)的Luria肉汤(LB)中。含有指明的质粒的乳酸乳球菌MG1363(17)生长于补加1μg/ml红霉素的增强的合成氨基酸(SA)培养基(该培养基被命名为3×SAIV培养基(24))或含有0.5％(wt/vol)葡萄糖的M17肉汤(Difco Ltd.)中。固体化的LB或M17培养基分别补加200和1μg/ml红霉素。载体pPSM1013(图1)是一种基于pAMβ1复制子(46)的高拷贝数表达质粒，其含有独特限制性位点，允许构建具有优化的分泌信号肽序列(SP310mut2)的框内融合物(Ravn，P.，Arnau，J.，Madsen，S.M.，Vrang，A.，和Israelsen，H.未出版)。该肽的mRNA从质粒编码的翻译起始位点翻译并且从pH和生长期可诱导的乳酸乳球菌启动子P170转录(7，23，33)。pH值为7或者更高时，基本上没有从P170启动子的转录。然而，在pH低于6.5时，在向稳定期的过渡中转录被诱导。通过使质粒pPSM1013缺失所有lacZ调节序列以避免从lac启动子转录，并通过产生没有信号肽的新克隆区，从pPSM1013衍生出质粒pAMJ328(32)。
在乳酸乳球菌中表达GLURP和MSP3的质粒的构建。所有质粒都在大肠杆菌DH10B中构建并通过如所描述的电穿孔(22)转化到乳酸乳球菌MG1363中。通过DNA测序验证所有的质粒构建。
pMST73.用引物5′-CCC AGA TCTACA AGT GAG AAT AGA AATAAA C[核苷酸79到100](从M59706的ATG起始密码子中的A起始计数)和5′-CCC AGA TCTTGC TTC ATG CTC GCT TTT TT CCG AT[核苷酸1475到1500]扩增FVO glurp的非重复区；用BglII消化，并将所得DNA片段克隆到BgHI消化的pPSM1013中。
pKBR5.用BamHI和SalI消化pMST73质粒，并将所得的含有glurp插入片段的DNA片段克隆到BamHI-SalI消化的pAMJ328中。
pKBR7.用引物5′-AAG TAG ATC TAC TAA TAC AAG TGA GAATAG AAA TAA AC[核苷酸73到100]和5′-GTT CAG ATC TTT ATT CATGAT GGC CTT CTA GC[核苷酸1519到1542]扩增F32glurp的非重复区；将所得DNA片段用BglII消化并克隆到BglII消化的pPSM1013中。
pKBR8.用BamHI和SalI消化质粒pKBR7，并将glurp插入片段克隆到BamHI-SalI消化的pAMJ328中。
pKBR9.用引物5′-CCCAGA TCTAAA GCA AAA GAA GCT TCTAGT TAT[核苷酸628到651]和5′-ATTAGA TCTCAT TTA ATG ATTTTT AAA ATA TTT GGATA[核苷酸1118到1140](从L07944的ATG起始密码子中的A起始计数)扩增F32 MSP3的C-端区；将所得DNA片段用BglII消化并克隆到BglII消化的pPSM1013中。除了MSP3中可变位置的下列残基735(T→C)和948(A→G)外，该MSP3区和FC27等位基因(登录号L07944)的相同。
pKBR10.用BamHI和SalI消化质粒pKBR9，并将MSP3插入片段克隆到BamHI-SalI消化的pAMJ328中。
pKBR11.将pKBR9的BglII片段克隆到用BglII部分消化的pKBR5中，产生glurp79-1500和MSP3628-1140之间的框内融合。除了在GLURP中可变位置上的下列残基Leu-50、Asn-53、Glu-65、Asp-129、Glu-224、Pro-500外，该杂合分子相应于F32等位基因。
发酵.于30℃在2L发酵罐中发酵含有质粒pKBR8(GLURP)、pKBR10(MSP3)或pKBR11(GLURP-MSP3杂合物)的乳酸乳球菌MG1363，发酵培养基为补加红霉素(1μg/ml)、酵母提取物(0.5％)和葡萄糖(1.5％)的1L3×SAIV-培养基。将培养基的起始pH调节到7.4。由于乳酸乳球菌MG1363在生长期间产生乳酸，所以随着细胞密度增加，pH降低。生长约3小时后，pH降低到6，通过对2M KOH进行pH控制的加入，将该pH水平再保持8小时，直到细胞密度接近OD600＝8。将50％葡萄糖溶液与该碱平行加入，因为这倾向于增加细菌产率。通过用Pellicon 2 Durapore滤器(PVDF，0.22μm，0.1m2)(Millipore)超滤，从培养基上清液(含有输出的蛋白质)中除去细菌细胞。培养基上清液被立即使用或者保存在-20℃。
重组蛋白的纯化.为重组GLURP、MSP3和杂合分子开发了纯化策略。将无细胞的培养基上清液在安装Pellicon XL Biomax 8滤器(聚丙烯膜，50000Da，50cm2)的Millipore LabscaleTMTFF系统上浓缩，并在Sephadex G-25柱(C26/40，170ml)上将浓缩物的缓冲液换成20mMBis-Tris(pH6.4)。重组蛋白首先在5ml HiTrap Q Sepharose HighPerformance(Phamacia Biotech)柱上纯化，具体为应用柱缓冲液中的0到1M NaCl梯度，流速为1ml/min。合并含有目的重组蛋白的级分(2ml)并对20mM Bis-Tris(pH6.4)透析，并应用于5ml HiTrap SP SepharoseHigh Performance(Phamacia Biotech)柱上。通过柱缓冲液中的0到1MNaCl的梯度洗脱重组蛋白。GLURP和MSP3洗脱在单峰中而杂合物洗脱在两个峰中。合并含有目的峰的级分(2ml)并调节到1M(NH4)2SO4，并在5ml苯基Sepharose High Performance(Phamacia Biotech)上进一步纯化，纯化具体为应用20mM Bis-Tris(pH6.4)中的1到0M(NH4)2SO4梯度，流速为1ml/min。通过SDS-PAGE实施所有级分的分析。通过BCATM蛋白质测定法(Pierce，Rockford，Illinois，USA)测量蛋白质浓度。
小鼠IgG的免疫和纯化.将30只BALBc/CFl BALBc/CFl小鼠(27)雌性小鼠(7到10周龄)随机分成3组。通过在尾基部的皮下注射，用20μg GLURP25-500-MSP3212-380杂合物(gr7)或者15μg GLURP25-512与5μg MSP3212-380的混合物(gr8)分别免疫两组小鼠，第三组(gr9)在尾基部接受15μg GLURP25-512注射和在肩部接受5μg MSP3212-380注射。所有免疫原都在Montanide中乳化并且每只小鼠以两周为间隔接受3次注射，并在第0、14、28和35天取血。通过(NH4)2SO4沉淀并随后在DEAE-柱上纯化，从合并的第35天采自组gr7、8和9动物的血清样品和合并的第0天样品纯化总IgG。
ELISA和血清样品.如以前详细描述的(54)实施酶联免疫吸附测定法(ELISA)。GLURP25-512、MSP3212-380、和GLURP27-500-MSP3212-380的包被浓度分别为0.5、1.0和0.5μg/ml。在用任一抗原包被的ELISA板上测试来自临床疟疾免疫的成年利比亚人、从未暴露于疟疾的丹麦供体(51)和小鼠的血浆连续稀释液，并以吸收值对血浆稀释液作图。为了比较不同血浆样品中抗-杂合物抗体应答与相应的抗-GLURP及抗-MSP3抗体应答，以在曲线的平行部分中给出A492＝1000吸收值的血浆稀释度定义抗体效价。
竞争性ELISA测定法.将重组GLURP25-518和MSP3212-380和这两种抗原的混合物以各种浓度(3.2×10-5μg/ml到100μg/ml)加到来自用GLURP-MSP3杂合物免疫的小鼠的血浆池中，所述血浆稀释于含1.25％(w/v)奶粉的PBS中。调节所用血浆稀释液以得到约2500的吸收值(A492)。在4℃过夜孵育抗原-抗体混合物并随后确定与用GLURP-MSP3杂合物包被的ELISA板的反应性。
间接免疫荧光抗体(IFA)测试.如以前的报导(5)实施IFA。简言之，在湿室中，37℃下，将主要含有裂殖体阶段的恶性疟原虫NF54的RBCs的薄膜与纯化的小鼠IgG在磷酸缓冲盐溶液(PBS pH7.4)中的连续稀释液孵育30分钟。用PBS洗涤后，用以1∶300在PBS中稀释的缀合Alexa荧光色素的山羊抗-小鼠IgG(Molecular probe，USA)显示小鼠抗体。将载玻片洗涤后在紫外光下检查。终点效价是产生可见的特异免疫荧光的抗体最高稀释度。
GLURP和GLURP-MSP3的RP-HPLC分析.使用蛋白质C4柱(VYDAC_，214TP54，USA)，在HPLC系统(Phamacia，瑞典)上分析样品。在乙腈∶H2O∶TFA缓冲体系中实施分析。纯化的样品以1∶2在A-缓冲液(H2O+0.1％(w/v)TFA)中稀释并应用于柱上，用0-80％ B-缓冲液(80％乙腈+0.1％(w/v)TFA)的线性梯度经20个柱体积进行洗脱。通过214nm处紫外吸收(UV-Abs)监视洗脱。收集峰并在HetoVac(Heto，丹麦)上真空干燥并保持在4℃备用。
Maldi-Tof MS和ES-MS.从考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上切取用于肽质量作图的样品。基本如所描述的(44)，将条带的一半(约1μg蛋白质)洗涤、干燥、还原并用碘乙酰胺烷基化，之后通过修饰的胰蛋白酶(Promega，USA)过夜消化。将消化物的上清液应用于填装Poros 20 R2反相柱材料(PerSeptive，USA)的GELoader tips(Eppendorff，德国)上并用0.8μlα-氰基羟基肉桂酸(于70％乙腈/30％水中20μg/μl)直接洗脱到MALDI靶上(28)。在以反射镜模式运行的PerSeptive Voyager STR(PerSeptive，USA)上实施分析，并在GPMAW ver.5.02(Lighthouse data，丹麦)中分析结果。
对来自RP-HPLC的级分(约20μg蛋白质)实施完整蛋白的电喷射质谱。将样品干燥并重新溶解在5％甲酸中至20pmol/μl浓度，之后用钠喷雾源在Micromass QTOF(Micromass，UK)上分析。
实施例2乳酸乳球菌中glurp和MSP3的表达并排地克隆编码glurp79-1500和MSP3628-1140区的PCR片段，从而产生载体编码的信号肽和GLURP25-500-MSP3212-380融合蛋白之间的框内融合(pKBR11，图1)。该杂合物含有由连接这些glurp和MSP3片段而产生的两个额外的氨基酸残基。为了比较，也克隆单独的glurp73-1542和MSP3628-1140片段(pKBR8和pKBR10，图1)。如在“材料和方法”中描述的，将质粒转化到乳酸乳球菌MG1363中并将所得菌株在发酵罐中生长。生长培养基的pH保持为6以实现从P170启动子的最佳转录(33)。所有三种重组蛋白都被分泌到培养上清液中，通过依次进行HiTrap Q和SPSepharose柱上的离子交换，然后苯基Sepharose上的疏水相互作用层析，从上清液纯化这些重组蛋白。随后的SDS-PAGE表明质粒pKBR11(泳道1)、pKBR8(泳道2)、和pKBR10(泳道3)分别产生136、100和36kDa的主要产物(图2A)。在纯化的GLURP和MSP3制剂中观察到额外的低分子量带。当通过免疫印迹分析时，泳道2和3中的较小产物如同全长产物一样，分别被针对GLURP和MSP3的抗体特异识别，表明它们可能来自mRNA的不完全翻译和/或主要蛋白质产物的蛋白酶切割。泳道2中SDS-PAGE纯化的条带的MALDI MS胰蛋白酶肽图证实该分子量较小的蛋白质来自GLURP25-514(数据未显示)。如“材料和方法”中描述的通过HPLC评估GLURP27-500-MSP3212-380和GLURP25-514制剂的纯度。GLURP27-500-MSP3212-380和GLURP25-514给出单一主峰(图2B)。GLURP27-500-MSP3212-380和GLURP25-514的分子量分别为74950和56518Da(±20Da)，它们是通过ES MS确定的。假定两种重组蛋白每种都含有连接到它们的N-末端的载体编码的氨基酸残基A-E-R-S(图1)，那么这些分子量可分别良好地吻合于所预测的值74939和56518。因此，GLURP27-500-MSP3212-380和GLURP25-514重组蛋白都是完整的并且含有所预测的氨基酸残基。
实施例3乳酸乳球菌中产生的GLURP和MSP3的抗原性针对来自临床疟疾免疫的71名成年利比亚人的血浆评估重组蛋白的抗原性(图3)。在用每种重组蛋白包被的单独板上测试所有血浆样品的连续稀释液并将抗原-特异效价确定为给出1000的吸收值的稀释度。如所预期的，不同血浆含有不同量的GLURP和MSP3-特异的IgG抗体(图3A)。通常，杂合物-特异的抗体效价超过用单独的GLURP25-514和MSP3抗原记录的效价(图3B和C)，从而表明杂合分子分别对GLURP和MSP3抗原决定簇提供了充分呈递。
实施例4重组GLURP和MSP3产物的免疫原性为了确定GLURP-MSP3杂合分子与单独的GLURP25-514和MSP3212-380分子的混合物相比是否是优越的免疫原，将BALBc/CF1小鼠组各用Montanide中的杂合物分子皮下免疫或者用在一个注射器中组合的GLURP25-514和MSP3212-380皮下免疫或者将GLURP25-514和MSP3212-380在不同部位分开注射进行皮下免疫。第三次注射后，测试第35天血清分别对GLURP和MSP3的IgG抗体反应性。尽管杂合物组中的平均GLURP-ELISA效价仅略高于其他两组中的平均GLURP-ELISA效价，但是与在两个不同部位接受MSP3212-380和GLURP25-514的组相比，接受杂合物的组的平均MSP3-ELISA效价高4.3倍(Kruskal Wallis检验，P＜0.004)(图4A中比较gr7和gr9)。在个体水平，用杂合物免疫的小鼠与GLURP和MSP3结构域都强烈反应，而用两种分子的组合免疫的小鼠倾向于发动主要针对GLURP或MSP3的抗体应答。抗-杂合物IgG抗体主要针对含有用于人抗体的公知表位的P3、P4、P11和S3肽(51)；然而也识别到不含有这些表位的肽P5和P9(图4B)。尽管对于所有疫苗制剂，GLURP和MSP3-特异的IgG亚类谱都是相似的(图4C)，但是GLURP-特异的IgG抗体倾向于使用κ轻链，而MSP3-特异的IgG抗体倾向于使用入轻链。不管是针对杂合物或者单独分子的混合物而引起的GLURP或MSP3-特异性抗体都发现了轻链中的这种差异。
还通过竞争性ELISA分析了针对该杂合物的小鼠抗体的特异性(图5)。似乎针对该杂合物的抗体是纯粹GLURP和MSP3特异的，因为可溶的GLURP25-514和MSP3212-380的混合物可完全抑制抗-杂合物抗体与固定化GLURP25-500-MSP3212-380的结合。因此，GLURP-MSP3杂合分子的构建没有在重叠区产生新的B-细胞表位。
实施例5小鼠抗-GLURP和抗-MSP3血清与天然GLURP和MSP3的反应性还通过寄生虫来源的蛋白质与用三种重组蛋白——杂合物、GLURP25-514和MSP3212-380——分别免疫小鼠后得到的血清的免疫印迹，研究了重组GLURP和MSP3的免疫原性。如图6中所表明的，来自用GLURP25-514、MSP3212-380和杂合物免疫的小鼠的血浆分别识别约220,000Da(泳道1)、48,000Da(泳道2)的多肽和两者(泳道3)。
实施例6作为长合成肽产生的GLURP和MSP3之间的抗原竞争免疫原以长合成肽形式产生所用的MSP3和GLURP区MSP3(LR55)181-RKTKEYAEKA KNAYEKAKNA YQKANQAVLK AKEASSYDYILGWEFGGGVP EHKKEENMLS HLYVSSKDKE NISKENDDVL DEKEEEAEET EEEELE276andGLURP(LR67)85NVPSGL DIDDIPKESI FIQEDQEGQT HSELNPETSE HSKDLNNNGSKNESSDIISE NNKSNKVQNH FESLSDLELL ENSSQDNLDK DTISTEPFPNQKHKDLQQDL NDEPLEPFPT QIHKDYKEKN LIN-213免疫将20只BALBc雌性小鼠(7到10周龄)随机分成4组并用MSP3和GLURP的不同组合皮下注射免疫1.用5μg LR55免疫组110，2.用5μg LR67免疫组111，3.通过尾基部皮下注射5μg LR55+5μg LR67的混合物免疫组112，4.组113在尾基部接受5μg LR55注射并在肩部接受5μg LR67注射。
所有免疫原在Montanide ISA720中乳化并且每只小鼠以2周间隔接受3次注射，并在第0、14、28和35天取血。
ELISA在分别以0.5μg/ml LR55或LR67包被的ELISA板上测试第35天血浆样品的连续稀释液，并对血浆稀释液作吸收值图。抗体效价定义为在曲线的平行部分中给出A492＝1.00的吸收值的血浆稀释度。
结果为了确定是否可以得到针对产生的长合成肽MSP3和GLURP的混合物的平衡免疫应答，四组BALBc小鼠各用1)LR55(gr110)、2)LR67(gr111)、3)在一个注射器中组合的LR55和LR67(gr112)或4)在不同部位分开注射的LR55和LR67(gr113)皮下免疫。测试第一次注射后35天收集的血清分别对GLURP和MSP3的IgG抗体反应性。仅用LR55或LR67免疫的小鼠分别与LR55或LR67强烈反应(图7(a)和7(b))。同样的，用两种分子在不同部位注射免疫的小鼠与GLURP和MSP3结构域都强烈反应(图7(d))，而用在一个注射器中施用的两种分子的组合进行免疫的小鼠仅针对LR55反应(图7(c))。
该结果强烈支持如下观点单独的GLURP和MSP3产物的混合物不可能在单一疫苗制剂中施用而不出现GLURP和MSP3之间的抗原竞争。
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Val Pro Ser Pro Lys His Ser Asn His Glu Thr Phe Glu Glu Glu Thr405 410 415Ser Glu Ser Glu His Glu Glu Ala Val Ser Glu Lys Asn Ala His Glu420 425 430Thr Val Glu His Glu Glu Thr Val Ser Gln Glu Ser Asn Pro Glu Lys435 440 445Ala Asp Asn Asp Gly Asn Val Ser Gln Asn Ser Asn Asn Glu Leu Asn450 455 460Glu Asn Glu Phe Val Glu Ser Glu Lys Ser Glu His Glu Ala Arg Ser465 470 475 480Lys Ala Lys Glu Ala Ser Ser Tyr Asp Tyr Ile Leu Gly Trp Glu Phe485 490 495Gly Gly Gly Val Pro Glu His Lys Lys Glu Glu Asn Met Leu Ser His500 505 510Leu Tyr Val Ser Ser Lys Asp Lys Glu Asn Ile Ser Lys Glu Asn Asp515 520 525Asp Val Leu Asp Glu Lys Glu Glu Glu Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu530 535 540Glu Leu Glu Glu Lys Asn Glu Glu Glu Thr Glu Ser Glu Ile Ser Glu545 550 555 560Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu Asn Glu Lys565 570 575Lys Lys Glu Gln Glu Lys Glu Gln Ser Asn Glu Asn Asn Asp Gln Lys580 585 590Lys Asp Met Glu Ala Gln Asn Leu Ile Ser Lys Asn Gln Asn Asn Asn595 600 605Glu Lys Asn Val Lys Glu Ala Ala Glu Ser Ile Met Lys Thr Leu Ala610 615 620Gly Leu Ile Lys Gly Asn Asn Gln Ile Asp Ser Thr Leu Lys Asp Leu
625 630 635 640Val Glu Glu Leu Ser Lys Tyr Phe Lys Asn His645 650<210>2<211>1953<212>DNA<213>恶性疟原虫<400>2gccgaaagat ctacaagtga gaatagaaat aaacgaatcg ggggtcctaa attaaggggt 60aatgttacaa gtaatataaa gctgccatca aataacaaag gtaaaattat aagaggttcg 120aatgatgaac ttaataaaaa ctctgaagat gttttagaac aaagcgaaaa atcgcttgtt 180tcagaaaatg ttcctagtgg attagatata gatgatatcc ctaaagaatc tatttttatt 240caagaagatc aagaaggtca aactcattct gaattaaatc ctgaaacatc agaacatagt 300aaagatttaa ataataatga ttcaaaaaat gaatctagtg atattatttc agaaaataat 360aaatcaaata aagtacaaaa tcattttgaa tcattatcag atttagaatt acttgaaaat 420tcctcacaag ataatttaga caaagataca atttcaacag aaccttttcc taatcaaaaa 480cataaagact tacaacaaga tttaaatgat gaacctttag aaccctttcc tacacaaata 540cataaagatt ataaagaaaa aaatttaata aatgaagaag attcagaacc atttcccaga 600caagagcata aaaaggtaga caatcataat gaagaaaaaa acgtatttca tgaaaatggt 660tctgcaaatg gtaatcaagg aagtttgaaa cttaaatcat tcgatgaaca tttaaaagat 720gaaaaaatag aaaatgaacc acttgttcat gaaaatttat ccataccaaa tgatccaata 780gaacaaatat taaatcaacc tgaacaagaa acaaatatcc aggaacaatt gtataatgaa 840aaacaaaatg ttgaagaaaa acaaaattct caaatacctt cgttagattt aaaagaacca 900acaaatgaag atattttacc aaatcataat ccattagaaa atataaaaca aagtgaatca 960gaaataaatc atgtacaaga tcatgcgcta ccaaaagaga atataataga caaacttgat1020aatcaaaaag aacacatcga tcaatcacaa cataatataa atgtattaca agaaaataac1080ataaacaatc accaattaga acctcaagag aaacctaata ttgaatcgtt tgaacctaaa1140aatatagatt cagaaattat tcttcctgaa aatgttgaaa cagaagaaat aatagatgat1200gtgccttccc ctaaacattc taaccatgaa acatttgaag aagaaacaag tgaatctgaa1260catgaagaag ccgtatctga aaaaaatgcc cacgaaactg tcgaacatga agaaactgtg1320tctcaagaaa gcaatcctga aaaagctgat aatgatggaa atgtatctca aaacagcaac1380
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1.基于抗原的疟疾疫苗，该疫苗含有融合蛋白或者所述融合蛋白的同系物，其中所述融合蛋白衍生自与至少一种其它恶性疟原虫来源的蛋白质遗传偶联的恶性疟原虫富谷氨酸蛋白质(GLUPR)。
2.根据权利要求1的基于抗原的疟疾疫苗，其中遗传偶联到GLURP上的蛋白质来自恶性疟原虫的裂殖子表面蛋白质3(MSP3)。
3.根据权利要求2的疫苗，其含有SEQ ID NO 1。
4.根据权利要求2或3的疫苗，其还含有来自恶性疟原虫的蛋白质的免疫原性片段。
5.含有SEQ ID NO.1的融合蛋白或者其同系物。
6.根据权利要求5的融合蛋白，其还含有来自恶性疟原虫的一种或多种蛋白质的一种或多种免疫原性片段。
7.根据权利要求6的融合蛋白，其中免疫原性片段选自CS、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、MSP6、AMA1、Pf155/RESA、RAP1、EBA-175、pfEMP1、EXP1、LSA1、LSA3、Pf25、Pf45/48、Pf230、Pf27、Pf16、或Pf28。
8.从重组乳球菌属种中制备根据权利要求5-7的融合蛋白。
9.含有SEQ ID NO.2的核酸或者其同系物。
10.编码根据权利要求6或7的融合蛋白的核酸。
11.根据权利要求9或10的核酸在制备疫苗中的用途。
12.含有表达根据权利要求9或10的核酸序列的重组BCG的疫苗。
全文摘要
衍生自遗传偶联到恶性疟原虫裂殖子表面蛋白3(MSP3)上的恶性疟原虫富谷氨酸蛋白质(GLURP)的融合蛋白，以分泌的重组GLURP－MSP3杂合蛋白形式在乳酸乳球菌中产生，实验表明杂合物的GLURP－部分增加了总体的抗体应答。用杂合蛋白免疫一贯地比在一个部位注射两种重组分子的混和物或在两个不同部位同时注射单独的重组分子产生更强的针对单独的GLURP和MSP3域的抗体应答。该差异在MSP3－特异的抗体应答中最明显，表明位于GLURP RO－区中的T细胞表位为MSP3区中的B－细胞表位提供了帮助。此外，当用GLURP和MSP3的混合物注射动物时，小鼠个体倾向于产生针对分子之一的优势抗体应答在一些动物中，GLURP是免疫优势的，而在其他动物中MSP3是优势免疫原。此外，杂合物也比各单独的重组蛋白更具抗原性，因为在临床免疫的非洲成年人中针对杂合蛋白的天然IgG抗体的ELISA效价高于针对各单独的重组蛋白的效价。还证明该杂合蛋白是潜在的保护性抗原，因为小鼠抗－GLURP－MSP3 IgG抗体能够以单核细胞依赖的方式体外抑制寄生虫生长。
文档编号A61P33/00GK1741815SQ200380103154
公开日2006年3月1日 申请日期2003年11月6日 优先权日2002年11月12日
发明者M·泰森, S·耶普森 申请人:国立血清研究院