专利名称：杀菌剂百菌清水解脱氯酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及杀菌剂百菌清水解脱氯酶基因，属于应用环境微生物领域，用于农作物、 土壤、水体中杀菌剂百菌清残留的去除，保护环境。
二背景技术：
农药的使用虽然提高了农业的生产效率及作物产量，但同时带来严重的环境问题， 造成生态失衡农产品品质下降，并直接影响人民的身体健康。百菌清是四氯代苯腈杀菌 剂，在农业和家庭防腐方面使用了 30多年，是美国第二大类杀菌剂，每年使用量在5 千万顿以上。中国年产百菌清杀菌剂8000顿。百菌清对鱼类，鸟类和水生无脊椎动物 高毒，在美国是被人为的潜在致癌物。随着近些年来环境保护的呼声越来越高，农药使 用带来的环境问题日益引起人们的重视。百菌清在土壤中半衰期约6个月，是中等持久 性污染物。由于百菌清杀菌剂的大量使用，在蔬菜、地下水和土壤中残留非常广泛，造 成了严重的环境污染问题。随着人类环保意识的增强，百菌清污染的修复引起了人们的 广泛关注。微生物修复农药污染的方法一种简单、高效、廉价和无二次污染的方法，比 化学方法、物理方法修复农药污染具有很多优势。微生物在农药残留的生物学解决途径 中有着独特的作用。微生物降解修复农药的本质是微生物产生的酶对农药的降解作用， 从微生物中提取的降解酶系来消除农药残留在国外己有成功的先例，降解酶的来源可以 通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。百菌清降解 基因的获得在百菌清污染的修复领域有巨大的应用潜力。同时可通过基因改造扩大脱氯 酶的作用底物范围，广泛应用于环境中含氯芳香烃类污染物的脱氯降解去毒，保护环境。
三、
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供杀菌剂百菌清水解脱氯酶基因，属于应用环境微生物领域，用 于农作物、土壤、水体中百菌清残留的去除，保护环境。
技术方案
百菌清水解脱氯酶基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.l。该基因全长(从起始密码 子到终止密码子)为1029 bp， G+C含量为58.60/。，编码342个氨基酸，其氨基酸序列 为SEQIDN0.2。
水解脱氯酶基因片段与酶切好的pET-29a(+)进行酶连获得含百菌清水解脱氯酶基 因的PET-29a(+)重组质粒。
酶连好的含百菌清水解脱氯酶基因的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌 BL21(DE3)获得重组微生物BL21(DE3)。
上述百菌清水解脱氯酶基因可以在农作物、土壤、水体的百菌清残留去除方面得到 应用。其所涉及的百菌清水解脱氯酶可以在农作物、土壤、水体的百菌清残留去除方面
3应用。 有益效果
1. 用鸟枪法成功的从假单胞菌CTN-3 (尸w"ifomo"a;y sp. CTN-3，从百菌清污染土壤中 分离筛选获得的百菌清降解菌株，其16SrDNA序列的genbank登录号为FJ598329)中
克隆出百菌清水解脱氯酶基因。
2. 该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1029 bp, G+C含量为58.6M，编码 342个氨基酸。
3. 通过PCR技术扩增末端含Mfel和J^oI酶切位点的完整的百菌清水解脱氯酶基因片 段，将它连接到大肠杆菌高表达载体pET-29a(+)(购自Novegen公司)的iVAI和J^01 酶切位点上，转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自invitrogen公司)，进行IPTG诱导表达。
4. 本发明对百菌清水解脱氯酶基因表达的产物，做了酶活性测定，能高效的降解百菌 清，对20mg/L的百菌清在36h内能完全降解。
5. 利用该基因构建的工程菌株能高效表达百菌清水解脱氯酶(活性水解脱氯酶蛋白的 含量占细胞总蛋白含量的28%)，生产的酶制剂可用于土壤、水体和农作物残留的百菌 清的去除。
四
图1百菌清水解脱氯酶基因克隆的策略图
图2百菌清水解脱氯酶基因在BL21 (pET-29a(+))中高效表达实验方案图
五具体实施例方式
1.百菌清水解脱氯酶基因的克隆
1.1细菌基因组总DNA的提取
假单胞菌CTN-3 (尸WMJomowfl;ysp.CTN-3，从百菌清污染土壤中分离筛选获得的百 菌清降解菌株，其16S rDNA序列的genbank登录号为FJ598329)大量培养后，采用 CTAB法提取高纯度、大片段的假单胞菌CTN-3的基因组总DNA，溶于TE (pH8.0)中， 置于-2(TC保藏，具体方法参考F，奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。
L2pUC118(BflmHI)购买于宝生物工程(大连)有限公司。
1.3总DNA的酶切
假单胞菌尸WMcfo附omw sp. CTN-3总DNA采用Sa"3AI部分酶切。
1.4 DNA的回收
酶切后的总DNA通过电泳(TAE缓冲液)进行纯化，采用axygen biosciences(China) 回收试剂盒进行回收，回收的DNA溶于10 mmol/L的Tris，Cl (pH8.0)中，置于-2(TC保藏。 1.5酶连
建立如下反应体系
pUC118(5a附HI) 0.1吗总DNA片段 0.1 pg
10x连接酶缓冲液 1 pi
T4DNA连接酶 0.5 pl
加双蒸水至 10 pi 16'C温育12小时。
1.6制备大肠杆菌DH5a高效感受态细胞
具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P22-23。 1.7转化
取10 pl酶连产物转化200 pl感受态细胞，具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分 子生物学实验指南》P23。涂布含有100mg/kg的百菌清农药(丙酮溶解成的5，000mg/L 的母液)，100mg/kg氨苄青霉素的LB平板，培养24h候挑取有透明水解圈的菌落， 即是含百菌清水解脱氯酶基因的阳性克隆。 1.8基因核苷酸序列测定
上海英骏生物技术有限公司有限公司进行序列测定，百菌清水解脱氯酶基因的核苷 酸序列为SEQIDNO.l，根据百菌清水解脱氯酶基因核苷酸序列所推到的342个氨基酸 序列为SEQIDN0.2。
2.百菌清水解脱氯酶基因在BL21(pET-29a(+))中的高效表达 2.1百菌清水解脱氯酶基因的PCR扩增
以正向引物5，-GACATATGCCGCCTGGATGTTCCGG-3，和反向引物 5'-ATCTCGAGAGGCCTGGCTGCGAGAT -3，为引物，用PCR从假单胞菌iVwcfowoww sp. CTN-3中扩增出百菌清水解脱氯酶基因片段。
扩增体系
尸n'膨r加r酶(5U/ja1) 0.5 (xl
5 x PCR Buffer II (Mg2+Plus) 10 ^
dNTP Mixture(各2.5mM) 5 pl
模板DNA 10ng
引物1 (20pM) 1^1
引物2 (20pM) 1^1 灭菌蒸馏水 至 50nl PCR扩增程序 a.95°C变性3min
b. 95。C变性1.5min， 53。C退火0.5 min， 72。C延伸1.5 min，进行25个循环
c. 72。C延伸10min，冷却到室温。 2.2 PCR产物用MM和^ol双酶切。
酶切体系
5廳I 1 pi
勘I 1 pi
DNA 51吗
灭菌的蒸熘水加至 20^1 在37。C水浴中，反应3h以上。 酶切产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。 2.3 pET-29a(+)用M/d和屈ol双酶切(参考2.2)。 2.4转化和表达
2.2中的回收片段和2.3中酶切好的pET-29a(+)进行酶连(参考1.5)。酶连好的含百 菌清水解脱氯酶基因的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)获得重组微 生物BL21(DE3)。涂布含有100mg/kg百菌清、50 mg/kg卡那霉素和24 mg/kg IPTG的 平板，挑取有透明水解圈的阳性转化子。 2.5验证阳性转化子表达的酶对百菌清的降解功能
阳性转化子在LB培养基中培养至OD,0.6-0.8之间，加IPTG至浓度1 mM， 30°C 培养6h。在100 ml基础盐培养基(1.5 g K2HP04, 0.5 g KH2P04， 0.2 g MgS04.7H20， 1.0 g NaCl， 1.0 g(NH4)2SO4，1.0g每L)中加入20mg/L百菌清，1%接种量接入阳性转化子培养液，30°C 振荡培养36h。
用6ml二氯甲烷分两次全量提取4ml的培养液，用气相色谱检测降解效果，检测 条件如下ECD检测器，OV-225 (30mx250pmx0.25^im);进样口温度，210° C;柱温， 190°C; 检测器温度，250° C;气体流速，N2 40mL/min。对20 mg/L百菌清能完全降 解。序列表
南京农业大学
杀菌剂百菌清水解脱氯酶基因 说明书 4
Patentln version 3.1 1
1029 DNA
Pseudomonas sp. CTN-3
百菌清水解脱氯酶基因 (l)..(腳)
<120> <130> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223>
<400> 1
atgccgcctg gatgttccgg gctttgtagc tttgtaggat tgacgatgcc actcaagttt 60
tcgggcgtgc tctgcgccag cctcctgacc atcacccttt cggtagccgc gcatgcaacc 120
gaactcatct tggacttcaa caaggtgcag atgcgcagcc aacaactcgc acctggggtg 180
tacgcgcatc taccggcaga ctccgccgag ctgaatgcaa aaggcggtgt agcaggcacc 240
agcggtggct tgatcgtcgg gacacgtggc gcgatgctga tcgagaccat gcteaaccgt 300
cgccttttcg atcaggtcca agcactcgcc aaaaaggagg cattggggct gccgctgctg 360
tacgcagtca acaccagtta tcatggcgat cactcgtatg ggaacatgta cctgaaggcg 420
ccgacgcgtg tcatecaaag caccaaaacg cgtgattatg tcgatggtca cctcgccgac 480
gacaaggcat tcatggtgaa gaatttcggt gccgggcgcg gtgttgagca gatcacggca 540
aggacgggcg acatcctcgt gcctccggga ggtcgcgtga gcgtcgacct tggcggcaag 600
actgttgaga tcatcgactt cgggttcgca cagaccggcg gggacctgtt cgtctgggag 660
ccgcaatcea aagttatgtg gacaggcaac gcagtggtcg ccagcaagcc agctctacct 720
tggctgctcg atggcaagct ggtagagacg ttggcgacgc tacagaaagt ctacgatttt 780
ctaccgcctg atgccaccat cgtccctgga catggtgtac ccatggcccg cgaaggcctg 840
cgctggcatc tggactacct cgcagecgtg caagcaggcg tcaaggatgc tttggctcgc 900
aaactgagcc tcgaacagac agtgaccgaa ctcaagatgc cggagttccg cggctacgta 960
ctgttcgact gggttcatcc agatctcaac gtccccgctg cttacaagga tctegcagcc 1020
aggccttga 1029
<210> 2
<211> 342
<212> PRT
<213> Pseudomonas sp. CTN-3 <220>
<221>推测的百菌清水解脱氯酶的氨基酸序列
<222> (1)..(342)
<223>nsi J3S nsi sXi 3jy biv ns"[可v ds v s^i !b八v ul￡) 1ba bjv
08Z
biv nsi jX丄dsv nsq s!h dj丄&v nsq々o Siy v cxij jb八 OZZ 09Z
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乙<00fr>
虽〃9憲法能改
6 y69ss00i600s290 295 300
Glu Gin Thr Val Thr Glu Leu Lys Met Pro Glu Phe Arg Gly Tyr Val 305 310 315 320
Leu Phe Asp Trp Val His Pro Asp Leu Asn Val Pro Ala Ala Tyr Lys
325 330 335
Asp Leu Ala Ala Arg Pro 340
<210> 3 <211> 25 <212> DNA <213>人工合成 <220>
<221>百菌清水解脱氯酶基因的PCR扩增正向引物 <222> (1)..(25) <223>
<400> 3
gacatatgcc gcctggatgt tccgg
<210> 4
<211> 25
<212> DNA <213>人工合成 <220>
<221>百菌清水解脱氯酶基因的PCR扩增反向引物
<222> (1)..(25) <223>
<400> 4
atctcgagag gcctggctgc gagat
25
25
9
权利要求
1.百菌清水解脱氯酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2. 权利要求1所述的百菌清水解脱氯酶基因核苷酸序列所推导的百菌清水解脱氯酶蛋 白质,其氨基酸序列为SEQIDN0.2。
3. 含权利要求1所述百菌清水解脱氯酶基因的pET-29a(+)重组质粒。
4. 含权利要求3所述的重组质粒的重组微生物BL21(DE3)。
5. 权利要求1所述百菌清水解脱氯酶基因在土壤、水体和农作物的百菌清残留去除方 面的基因工程应用。
6. 权利要求2所述百菌清水解脱氯酶蛋白质在农作物、土壤、水体的百菌清残留去除 方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种杀菌剂百菌清水解脱氯酶基因，属于应用环境微生物领域。本发明提供了杀菌剂百菌清水解脱氯酶基因及其所推导的水解脱氯酶蛋白质。该基因全长为1029bp，G+C含量为58.6％，编码342个氨基酸，为新的脱氯酶基因资源。利用该基因构建的工程菌株能高效表达百菌清水解脱氯酶，能在36h内将20mg/L的百菌清完全降解，生产的酶制剂可用于土壤、水体和农作物上的百菌清残留的去除。
文档编号C12N15/54GK101649324SQ20091003369
公开日2010年2月17日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者荣 李, 李顺鹏, 斌 梁, 王光利, 蒋建东 申请人:南京农业大学