专利名称：一种鼻咽癌eb病毒特异性dna酶检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒。
背景技术：
鼻咽癌(Nasopharyngenl Carcinoma, NPC)是发生于鼻咽部的恶性肿瘤，最常见于 中国南方，如广东、广西、湖南、福建等省和东南亚一些国家。全世界80%以上的鼻咽 瘤发生在中国的南方。目前对鼻咽癌尚无确切的一级预防(从病因上预防)措施，因此 人们把鼻咽癌的预防寄希望于二级预防上，也即是早发现、早诊断及早治疗。目前，NPC 的早期诊断存在较多困难，主要表现在1)鼻咽解剖部位较深，某些患者由于种种原 因无法用间接鼻咽镜进行检査；2)早期鼻咽癌病灶一般较小，容易为临床检査所忽略 而造成漏诊。因此临床上迫切需要一种简便，特异性高的检测方法来提早确诊、提高早 期诊断率。通过对高发区长期的研究，发现鼻咽癌的自然发展史为健康人一EB抗体 阳性一原位肿瘤一浸润癌。从开始出现症状至死亡平均仅18.7个月，恶性度很高。但鼻 咽癌在病理确诊前有较长时间(平均4.36年)，体内的多种EB病毒抗体水平就开始升 髙，这一现象提示可以通过血清免疫学和生物化学的方法探测鼻咽癌。
' 针对EB病毒(EBV)某些相关抗体，如EBV 1B关的抗原与病毒衣壳抗原 (VCA-IgA)、病毒的早期抗原(EA-IgA)、病毒诱导的膜抗原(MA-IgA)等的血清 学检测早已应用于鼻咽癌对现场普査、临床诊断、病程追踪。但研究表明如以VCA-IgA 作为NPC早期诊断指标或视为癌前可疑指针，则出现较高的假阳性率；而EA-IgA特异 性较高但灵敏性差，漏诊可能性大；其它一些抗体如MA—IgA、 EBNA—IgA (病毒的 核抗原)等灵敏性和特异性都较差，因而寻找其它方法作为NPC辅助诊断的指标就显 得非常急需。1980年郑永齐等发现EBV重感染的Raji细胞可以诱导出EBV特异性DNA 酶，并证实NPC患者血清中含有高频度和高滴度的该酶抗体(DNA酶中和率，EB病 毒特异性DNA酶)。中山大学肿瘤防治中心黄迪教授在此基础上进一步研究发现利用化 合物巴豆油和正丁酸可以联合激发原含有EBV基因组的细胞株产生EB病毒特异性DNA酶，酶的活性用"C标记的同位素方法探测，并证实NPC病人的血清可以明显的 降低该酶活性。临床前期研究发现，EBV特异性DNA酶抗体的血清学检测有很高的特 异性和灵敏性，可以很好的解决VCA、 EA等特异性或灵敏性差的问题，是目前最行之 有效的NPC检测方法。
经过多年的研究，基本探明EB病毒特异性DNA酶检测的原理与方法，并试用于 临床辅助诊断，但此方法要用到同位素标记DNA (同位素法)。众所周知，同位素发射 出来的射线具有一定的能量，它可以破坏细胞组织，从而对人体造成伤害。而且同位素 的生产、运输都很不方便，检测步骤烦琐，因此现有的DNA酶检测方法尽管取得较好 的临床诊断效果，却没有得到推广，也不容易商品化。
发明内容
本发明旨在提供一种鼻嚼癌EB病毒特异性DM酶检测试剂盒，通过检测血清中 EBv-DNA酶的抗酶率从而实现对早期鼻咽癌患者的无创伤快速诊断，安全灵敏。本发 明还提供该检测试剂盒的制备方法。
本发明鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒，包含标准DNA，标准SYBRGreen I， EB病毒特异性DNA酶，稀释缓冲液。
所述标准DNA的浓度为35Pg/ml，体积为15ml;所述标准SYBR Green I的浓度为 IOX工作液，体积为80 |Lll;所述EB病毒特异性DNA酶的浓度o.08 0,25U/ul，体积为 100W;所述稀释缓冲液为TE Buffer,其中Tris HC1 0. 01 M， EDTA 0. 001 M， pH 7. 0， 体积为20ml 。
本发明还提供该鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒的制备方法，包括以 下步骤
(1) 标准DNA的生产和纯化发酵培养含有p-CL质粒的大肠杆菌以生产标准 DNA，所述标准DNA为p-CL质粒；提取所述的p-CL质粒；
(2) EB病毒特异性DNA酶的生产和纯化在培养人Burkitt、s淋巴瘤细胞株 的过程中，以巴豆油和正丁酸作为诱导剂，同时采用Epstein-Barr病毒重复感染Raji 细胞，大量生产EB病毒特异性DNA酶；纯化所述的EB病毒特异性DNA酶；
(3) 标准SYBR Green I的浓度配比固定质粒DNA含量，设置标准SYBR Green I浓度梯度，确定低浓度SYBR Green I含量得到较敏感的荧光信号；在标 准SYBR Green I浓度确定的情况下，对标准DNA的浓度进行比例稀释，确定标准 DNA的稳定的线性可测浓度范围。其中，步骤(1)中所述提取p-CL质粒的方法优选碱裂解法；步骤(2)中纯 化所述的EB病毒特异性DNA酶的方法优选离子交换层析法。
本发明提供的鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒，对门诊初诊病人的诊断准 确率与病理结果一致，该检测安全、灵敏、快速、对患者不造成损伤，病人及正常人均 可接受；结合我们的回顾性分析结果说明，该项研究不但可以用于鼻咽癌的早期诊断， 而且适用于鼻咽癌的早期大规模筛查与患病风险预测，为鼻咽癌的早期诊断与防治提供 了强有力的技术支持。本试剂盒具有重要的临床和社会价值1)可做到鼻咽癌的早发 现、早治疗，提高5年生存率，降低鼻咽癌的死亡率，降低医疗费用，节约医疗资源。 早期鼻咽癌患者85%可以治愈，晚期的死亡率则高达90%。而且晚期患者生存质量差， 手术或维持性治疗费用高，就会浪费大量的人力、物力和财力，给国家和家庭带来重大 负担，不利于和谐社会构建。2)检测方便，仪器和检测条件要求不高，易于推广，大 到三甲医院小到社区医院都可以检测，这就极大的方便了患者，减轻了大医院的就诊压 力。3)试剂盒的价格较低，可以为广大中低收入人群所接受，有利于对普査工作的开 展。4)试剂盒的推广前景广阔，市场前景可观。
图1为EB病毒特异性DNA酶检测的阴性组与阳性组生存曲线，其中Survival Functions (生存率)为观察对象经历t个单位时段后仍存活的可能性，Cum Survival为 生存概率，"censored"为缺失；
图2表示荧光信号与DNA含量之间的线性关系；
图3 (i)表示六例阴性病人用鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒法与 同位素法检测EB病毒特异性DNA酶的结果比较；
图3 (2)表示六例阳性病人用鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒法与 用同位素法检测EB病毒特异性DNA酶的结果比较。
图3 (1)和图3 (2)中，" "代表经同位素法检测得到的抗酶率，"■"代 表鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒法检测得到的抗酶率。
具体实施例方式
实施例l鼻咽癌患者的生存状况与EB病毒特异性DNA酶检测数值之间的关系
5图1为对1824例患者的病例资料进行回顾性分析，采用又2检验法，总的误差 X2=59.304,P=0.000，说明EB病毒特异性DNA酶在鼻咽癌患者和正常人群中分布有高度 显著性差别，EB病毒特异性DNA酶在鼻咽癌患者中出现的频率比健康人为高。经 log-rank检验EB病毒特异性咖A酶表达阳性与阴性(抗酶率大于30%为阳性，小于30 %为阴性)患者的生存曲线具有显著性差异，提示EB病毒特异性DNA酶的检测可以作 为生存预测的一个指标。
肿瘤分期的目的是通过检査明确肿瘤的范围，提供预后的情况，指导并确定治疗方 案。肿瘤分期可分为基于临床检査为基础的临床分期(Clinical Staging)和根据手术标 本的组织和病理学检査为基础的病理分期(Pathologic Staging)两种。由于手术并不是 鼻咽癌的主要治疗方法，因此鼻咽癌的分期以临床分期为主。目前国内外公认的鼻咽癌 分期标准是2003年修改的国际抗癌联盟(UICC)和美国肿瘤联合会(AJCC)联合制 定的TOM分期法。本实施例利用EB病毒特异性DNA酶检测的抗酶率作为分型的基础， 分别以抗酶率30%， 50%， 80%和100%作为界限，将病人分为四期，结合TNM分期 法对于五年存活率和十年存活率分别统计，比较两种分型方法预测的结果(表l)，说 明EB病毒特异性DNA酶分型与UICC分期对于五年存活率和十年存活率的预测具有可 比性。
表1EB病毒特异性DNA酶酶分型和UICC分期五年和十年存活率比较
DNA酶分例数中位生存 时间大于五年存活率大于十年存活率例数百分比例数百分比
0—30433例137312例72.06%137例31.64%
31—50260例103170例65.38%61例23.46%
51—80819例75451例55.06%126例15.38%
81 — 100312例54140例44.87%39例12.5 c/0
UICC分期例数中位生存 时间大于五年存活率大于十年存活率例数百分比例数百分比l期103例89例86.41 %4139.81 %2期136例111例81.62 c/03626.47%3期684例110462例67.54%16123.54%4期894例56411例45.97%12513.98%6实施例2鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒
试剂盒由以下试剂组成 (1 )标准DNA，浓度为35Pg/ml，体积为15ml;
(2) 标准SYBR Green I，浓度为IOX工作液，体积为80^x1;
(3) EB病毒特异性DNA酶，浓度0.08 0.25U/nl，体积为100W;
(4 )稀释缓冲液为TE Buffer,其中Tris HC1 0. 01 M， EDTA 0.001 M， PH 7. 0， 体积为20ml 。
实施例3鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒的制备及其灵敏性、特异性和稳
定性
1.鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒的制备方法 (I) DNA的生产和纯化
经过常规的大规模发酵培养含有p-CL质粒的大肠杆菌，制备DNA。利用碱裂解 法从大肠杆菌中分离纯化p-CL质粒，对该质粒DNA进行鉴定(美国PE ABI公司DNA 测序仪测序)和定量分析(使用分光光度计测量溶液在600nm的吸光度，从而计算出DNA 含量)。理论上每个反应中DNA的用量大约为50 ng - 500 ng，所以在试剂盒中提供的 DNA为3.5Pg (如何确定)。100 ml大肠杆菌大约可生产500 ng DNA，因此每个试剂盒 的制作大约需要发酵1L太肠杆菌。
利用碱裂解法纯化大肠杆菌质粒DNA的具体步骤
(1) 取培养至对数生长后期含p-CL质粒的大肠杆菌。培养液250ml， 4'C下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。
(2) 将大肠杆菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE (STE的成分 为0.1mol/LNaCl、 10醒ol/LTris.Cl、 O.lmol/L EDTA， pH8.0)中。
(3) 同步骤1方法离心以收集细菌细胞。
(4) 将大肠杆菌沉淀物充分重新悬浮于5ml溶液I (成分为50mmol/L 葡萄糖,Tris.Cl (pH8.0) 25mmol/L, EDTA(pH8.0) 10 mmol/L,在101 bmn2(6.895X 104Pa) 高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4°C)中。
(5) 向步骤(4)获得的大肠杆菌悬浮液中加入12ml新配制的溶液 II(含有NaOH 0.2 mol/ L SDS 1%，其中NaOH从5mol/L贮存液中现用稀释)，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次以充分混匀内容物，然后冰浴10分钟。
(6)向步骤(5)获得的混合物中加9迈1用冰预冷的溶液III (5mol/L 乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml 28.5ml，所配成的溶液重钾的浓度为3mol/L，乙酸根的 浓度为5mol/L)，摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应 形成白色絮状沉淀。 —(7)继步骤(6)之后，于4'C下5000g离心15分钟。
(8) 取离心后的上清液，加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37'C水浴 20分钟。
(9) 加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀，4'C下12000g离心10分钟。
(10) 取上层水相，加入等体积氯仿,振荡混匀,4'C下12000g离心10分钟。
(11) 取上层水,相，加入1/5体积的4mol/LNaCl和10y。PEG(聚乙二 醇，分子量6000),冰上放置60分钟。
(12) 4'C下12000g离心15分钟，沉淀用lml 70%冰乙醇洗涤，4'C 下12000g离心5分钟。
(13) 干燥沉淀物，将所得沉淀溶于500ml TE ( lOmmol / L Tris.HCl， lmmol/LEDTApH8.0)或水中。
需要注意的是，提取过程中应尽量保持低温；加入溶液II和溶液III 后揚作应混和，切忌剧烈振荡；由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用 RNA酶耐热的特性，使用时应先对该酶液进行热处理(80'C 1小时)，使DNA 酶失活。
(II) EB病毒特异性DNA酶的生产和纯化 RPMI1640培养液(商品化的通用培养基)中添加20%小牛血清，在37'C条件下大 规模培养Raji细胞(人Burkitt's淋巴瘤细胞株)。培养时间达24小时后，向培养 体系中加入诱导剂巴豆油(终浓度为400 ng/ml)和正丁酸(终浓度4raM)，同时采用 Epstein-Barr病毒(EBV)重复感染Raji细胞，诱导出EB病毒特异性DNA酶。培养时 间达到96h，收获细胞，用Hanks液洗涤3次，制成混悬液，超声破碎，取上清液作为 粗制酶液。将该粗酶液采用如下的方法进行EB病毒特异性DNA酶的分离纯化(在4° 进行)
8(1)硫酸铵分级盐析 按不同饱和度将粉末状固体(NH4)2S04分别加入粗酶液中，进行分级盐析，定性测
定各个沉淀部分及其对应上清液的酶活以确定盐析范围。
(2 ) DEAE-Sephadex A-50离子交换层析 将盐析后的沉淀溶于0.25迈01/1:， pH8.5Tris-HCl缓冲液中，透析脱盐后上柱。采 用含有不同浓度NaCl(O、 0.1、 0.15 、 0.20、 0.25和1.0 M)的0.25 mol / L， pH7.5Tris-HCI 缓冲液进行洗脱，收集活性峰。将所获得的活性峰用PEG20000浓縮至适当体积， (3) Sephadex G-75凝胶过滤 将浓縮后的活性峰上柱，ffl0.25mol/L， pH7.5Tris-HCl缓冲液洗脱，自动部分收 集器收集，收集各活性峰，用PEG20000浓缩至适当体积，分装保存。
对该酶的活力单位的测定基本上按照Hoffmann等的方法进行一个酶单位(U)定义 为在37'C时，每10分钟将Uig DNA分解为单核苷酸的酶量。
当EB病毒特异性DNA酶用量为0. 08—0. 20 U时，同一个NPC患者的血清标本的抗 酶率基本一致。试剂盒中EB病毒特异性DNA酶的量为65个反应的用量，保证同一个 NPC患者六个平行样，每个试剂盒可进行10人次的检测。这样可以保证在较短时间内将 EB病毒特异性DNA酶充分利用。
(III) SYBR Green I的浓度配比
SYBR Green I的优化分析，对于试剂盒中提供的质粒DNA，根据其大小和浓度， 优化分析SYBR Green I (购买于Invitrogen公司)使用浓度为1: 10000到1: 70000, 通过测试后，稀释到使用范围，每个反应加入工作浓度的SYBR Green I为5W-10W， 每个试剂盒中提供IOX工作浓度的SYBR Green I为80 W。
为了建立一个合理的数学模型，需要考虑的因素首先是SYBR Green I分析的优 化主要包括2个因素SYBR Green I浓度和质粒DNA浓度。
① SYBR Green I浓度
为了找到最适的SYBR Green I浓度，获得最强和最稳定的荧光信号，固定质粒 DNA含量，设置SYBR Green I浓度梯度，检测荧光强度，保证在低浓度SYBR Green I含量得到较敏感的荧光信号。推荐的SYBR Green I终浓度变动范围是l: 5000到 1: 100000，经常用到的浓度范围是l: 10000到l: 70000。
② 质粒DNA浓度
在SYBR Green I浓度确定的情况下，为了获得合适的SYBR Green I与质粒DNA
9作用的线性范围，需要对DNA的浓度进行比例稀释，从而寻找一个稳定的线性可测浓 度范围，我们已建立了应用于检测的线性范围(图2)。
从图3 (1)图3 (2)可知，鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶无论用本试剂盒检测或 用同位素法检测，其检测数据基本相符，对于病人的诊断均具有相同的效力。
2. 鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒灵敏性，特异性，稳定性的检测
在96孔板各孔中分别加入0, 10， 20, 50, 100, 200， 500, 1000 ng的质粒DNA， 每个样品六个平行样，然后加入0.08 0.251]/^1的EB病毒特异性DNA酶lul, 37'C孵育 30min后加入5 W工作浓度的SYBR Green I ，振荡混匀后上酶标仪检测，在激发光 的作用下，在520nm波长下通过荧光强度检测DNA浓度。通过检测最低的DNA浓度，结 果显示可以检测到10ng DNA的含量，说明本发明的试剂盒具有较高的灵敏度。通过统 计学分析六个平行样本之间无显著性差异，均为有效数据，说明该检测方法具有稳定性。 同时利用该方法和以前的同位素方法同时检测六个病人，所得到的结果基本一致，说明 该方法具有特异性。.
实施例4鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒检测EB病毒特异性DNA酶的 方法
1.对患者静脉采血2m1,将取得的血样，离心，静置于37'C温水中，直至血清析出， 开始利用本试剂盒对本患者的EBv特异性DNA酶的抗酶率进行检测。
3. 在待测孔A3、 B3、 C3、 D3、 E3、 F3和G3中，分别加入标准DNA (含500ng) 100 W,每个病人血清5W和EB病毒特异性DNA酶1W，各样本均加六孔；对照孔A2、 B2、 C2、 D2、 E2、 F2和G2中以正常血清代替病人血清，其它添加成分一致；然后将酶 标板在37'C摇床以100转/分钟的速度孵育30min。
4.各反应孔中分别加入工作浓度的SYBR Green I (以稀释缓冲液将标准 SYBRGreenI稀释10倍)5W，放置5分钟后，在激发光作用下，520nra波长的酶标 仪下读数；
5.根搪测得的荧光强度值，根据公式计算抗酶傘 抗酶率的计算过程如下
(1)标准曲线FI=AX+B 其中FI (荧光强度信号，fluorescence intensi訂L X (DNA的质量，单位是ng)
10FI标准500ng的质粒DNA的标准荧光强度信号。
(2)荧光强度值标准化 受试者血清FAR值=受试者血清FI - FI标准 正常新鲜血清FAR值=受试者血清.FI _ FI标准
其中，FAR表示荧光信号衰减数(fluorescence attenuation rate, FRA乂
(3)抗酶率计^:
,—^^_ 正常l l聘平
6.以30%作为评判指标，大于30%认为是阳性，低于30%认为是阴性'
正常新鲜血清FAR值、，1rt ,
抗酶率-i--xioo%
权利要求
1. 一种鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含标准DNA，标准SYBR Green I，EB病毒特异性DNA酶，稀释缓冲液。
2. 根据权利要求1所述的鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒，其特 征在于所述标准DNA的浓度为35Mg/ml，体积为15ml;所述标准SYBR Green I 的浓度为IOX工作液，体积为80 所述EB病毒特异性DNA酶的浓度o.08~ 0.25U/ul，体积为所述稀释缓冲液为TE Buffer,其中Tris HC1 0. 01 M， EDTA 0.001 M， pH 7.0，体积为20ml。
3. —种制备权利要求1的鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒的 方法，包括以下步骤-(1) 标准DNA的生产和纯化发酵培养含有p-CL质粒的大肠杆菌以生 产标准DNA，所述标准DNA为p-CL质粒；提取所述的p-CL质粒；(2) EB病毒特异性DNA酶的生产和纯化在培养Raji细胞的过程中， 以巴豆油和正丁酸作为诱导剂，同时采用Epstein-Barr病毒重复感染Raji细 胞，大量生产EB病毒特异性DNA酶；纯化所述的EB病毒特异性DNA酶；(3) 标准SYBR Green I的浓度配比固定质粒DNA含量，设置标准 SYBR Green I浓度梯度，确定低浓度SYBR Green I含量得到较敏感的荧光 信号；在标准SYBR Green I浓度确定的情况下，对标准DNA的浓度进行比例 稀释，确定标准DNA的稳定的线性可测浓度范围。
4. 根据权利要求3所述鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒的方法， 其特征在于步骤(1)中所述提取p-CL质粒的方法为碱裂解法。
5. 根据权利要求3所述鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒的方法， 其特征在于步骤(2)中纯化所述的EB病毒特异性DNA酶的方法为离子交换 层析法。
全文摘要
本发提供一种鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒及其制备方法。所述的试剂盒包含标准DNA，标准SYBR Green I，EB病毒特异性DNA酶，稀释缓冲液。该试剂盒的制备过程为(1)标准DNA的生产和纯化；(2)EB病毒特异性DNA酶的生产和纯化；(3)标准SYBR Green I的浓度配比。采用该试剂盒，可以通过检测血清中EB病毒特异性DNA酶的抗酶率从而实现对早期鼻咽癌患者的无创伤快速诊断，安全灵敏。
文档编号C12Q1/44GK101586158SQ200910033490
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月22日 优先权日2009年6月22日
发明者强 刘, 艳 赵 申请人:常州生奥基因生物科技有限公司