专利名称：使用il-31拮抗剂在神经元性组织中治疗疼痛和炎症的方法
使用IL-31拮抗剂在神经元性组织中 治疗疼痛和炎症的方法
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本申请要求提交于2006年1月10日的美国临时申请序列号No. 60/758,066、提交于2006年1月10日的美国临时申请序列号No. 60/757,979、提交于2006年2月14日的美国临时申请序列号No. 60/773, 031、提交于2006年6月22日的美国临时申请序列号No. 60/805, 552、提交于2006年6月22日的美国临时申请序列号No. 60/805, 550、提交于2006年6月22日的美国临时申请序列号No. 60/805, 55、提交于2006年8月30日的美国临时申请序列号No. 60/823， 982以及提交于2006年8月30日的美国临时申请序列号No. 60/823， 987的权益，所有这些文献都通过参考并入本文。
背景技术：
炎性过程使得神经系统活化，导致炎性疼痛和对运动功能的破坏。 对感觉神经的刺激产生血管舒张(vasodialtion)和血浆外渗，导致 神经性炎症和刺激，进而导致感觉刺激、超敏感性和疼痛。
神经源性炎症是组织中有疼痛反映的、热敏感性末端(endings) 的活化导致的，其可由先天病况(例如自身免疫疾病，包括变应)、 病毒感染以及受伤导致。来自上述病况的神经源性炎症可影响到躯体 感觉系统，该系统由多种感觉受体构成，这些受体作用于产生下述感 觉，所述感觉例如压力、触碰、温度、疼痛、发痒(Uch)、酥痒(tickle)、 刺痛和麻木。被活化的神经可通过诱导细胞因子的分泌、活化单核细 胞和趋化性使得炎症始终存在(perpetuate)。
神经源性炎症中有活性的蛋白可用作为诊断和治疗疾病的治疗性 手段的靶。
4用于治疗疼痛的药品的一个例子是镇顽癫(Neurontin)(加巴喷 丁 (gabapentin))，其用于治疗糖尿病性外周神经炎(作为疱渗后 神经痛)。因此，人们需要额外的药来治疗神经病性疼痛。
发明描述
本文提供下述定义，用于协助对本文描述的发明的了解。 术语"抗体"或"抗体肽"指完整抗体或其能针对特异性结合与 完整抗体竟争的结合片段，其包括嵌合抗体、人化抗体、完全的人抗 体和双特异性抗体。在某些实施方式中，结合片段是通过重组DNA技 术产生的。在其它一些实施方式中，结合片段是通过对完整抗体进行 酶促切割或化学切割产生的。结合片段包括但不限于Fab、 Fab'、 F(abO. sub. 2、 Fv和单链抗体。
术语"经分离的抗体"指已被鉴定出并且已从其天然环境的组分 分离出和/或回收的抗体。其天然环境的污染性组分是可能干扰抗体的 诊断或治疗性用途的材料，其可能包括酶、激素和其它蛋白质性或非 蛋白质性溶质。在一些实施方式中，抗体将被纯化至下述程度(1) 按重量计抗体超过95% (通过Lowry方法测定的)，包括按重量计超 过99%， ( 2 )足以通过使用旋杯式顺序分析仪获得至少15个残基的 N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)在还原或非还原条件下，使 用考马斯蓝或优选银染，通过SDS-PAGE测定为均质。经分离的抗体包 括原位存在于重组细胞中的抗体，因为抗体天然环境中的至少一种组 分将不存在。但是，通常，通过至少一个纯化步骤来制备经分离的抗 体。
"变体"抗IL-31抗体在本文中指氨基酸序列与"亲本"抗IL-31 抗体的氨基酸序列有所不同的分子，所述不同是亲本抗体序列中一个 或多个氨基酸残基的添加、缺失和/或取代造成的。在一种实施方式中， 变体包含处于亲本抗体一个或多个高度可变区域中的一处或多处氨基 酸取代。例如，变体可在亲本抗体的一个或多个高度可变区域中包含 至少一处，例如大约一处至大约十处，以及大约两处至大约五处的取 代。通常，变体将具有与亲本抗体重链或轻链可变结构域序列有至少75%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，更优选地，至少80%,更优选 地，至少85%，更优选地，至少90%，最优选地，至少95%。关于该序 列的同 一性或同源性在本文中被定义为对序列进行比对以及如果需 要的话引入缺口以获得最大百分比序列同 一性后，候选序列中与亲本 抗体残基相同的氨基酸残基的百分比。抗体序列的N-末端、C-末端或 内部的延伸、缺失或插入均不应被解释为影响到序列同一性或同源性。 变体保留与人IL-31结合的能力，其优选具有优于亲本抗体的性质。 例如，变体可具有更强的结合亲和性、增强的抑制IL-31诱导的对免 疫细胞的刺激的能力。为分析此类性质，人们应当，例如，用变体的 Fab形式与亲本抗体的Fab形式比较，或者用变体的全长形式与亲本 抗体的全长形式比较，因为已经发现在本文公开的生物学活性检验 中，抗IL-31抗体的形式将影响其活性。本文中具有特殊兴趣的变体 抗体是较之亲本抗体展示出至少大约10倍，优选至少大约20倍，最 优选至少大约50倍的生物学活性增强的变体抗体。
术语"亲本抗体，，在本文中使用时指用于制备抗体的氨基酸序列 编码的抗体。优选地，亲本抗体具有人框架区域，以及如果存在的话， 具有人抗体恒定区域。例如，亲本抗体可以是人化抗体或人抗体。
术语"激动剂，，指能增加另一分子的活性、作用或功能的任何化 合物，包括蛋白、多肽、肽、抗体、抗体片段、大分子或小分子(小 于10kD) 。 IL-31激动剂能导致，例如对NK细胞、T细胞亚组和B 细胞亚組以及树突细胞的刺激。
术语"拮抗剂，，指能减少另一分子的活性、作用或功能的任何化 合物，包括蛋白、多肽、肽、抗体、抗体片段、大分子或小分子(小 于10 kD) 。 IL-31拮抗剂能导致，例如NK细胞、T细胞亚组和B 细胞亚组和树突细胞的免疫功能的减少；与IL-31结合，使得IL-31 蛋白的相互作用被阻碍、抑制、降低、拮抗或中和。
在某些实施方式中，"双价抗体"与"多特异性"或"多功能性" 抗体不同，其应当被理解为包含具有相同抗原特异性的结合位点。
"双特异性"或"双功能"抗体是具有两种不同重/轻链对和两种不同结合位点的杂交抗体。双特异性抗体可通过多种方法产生，所述
方法包括但不限于杂交瘤融合或Fat/片段的连接。见，例如， Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 2i: 315-321 (1990); Kostelny et al.， J. Immunol.里1547-1553 (1992)。
术语"嵌合抗体"(或其复数形式)指这样的抗体，其轻链和重 链基因是从属于不同物种的免疫球蛋白的可变和恒定区域基因构建 的，所述构建典型地通过遗传工程来进行。例如，来自小鼠单克隆抗 体的基因的可变片断可连接到人恒定片断(例如Y 1和Y 3)上。因此，
典型的治疗性嵌合抗体是由来自小鼠的可变或抗原结合结构域和来自 人抗体的恒定结构域构成的，虽然其它哺乳动物物种也可以使用。
术语"表位"包括能与免疫球蛋白或T-细胞受体特异性结合的任 何蛋白决定子。表位决定子通常由具有化学活性的分子表面基团(例 如氨基酸或糖側链)构成，其通常具有特异性的三维结构特征以及特 异性的电荷特征。更具体地，术语"IL-31表位"在本文中使用时指 IL-31多肽的在动物(优选哺乳动物，最优选小鼠或人)中具有抗原 或免疫原性活性的部分。具有免疫原性活性的表位是IL-31多肽的能 在动物中引发抗体应答的部分。具有抗原活性的表位是IL-31多肽的 能被抗体免疫特异性结合的部分，所述结合是通过本领域公知的任何 方法(例如免疫检验)测定的。抗原表位不一定必须要是免疫原性的。
术语"标签化的表位，，在本文中使用时指与"表位标签"融合的 抗IL-31抗体。表位标签多肽具有足够的残基，以提供可针对其制造 抗体的表位，但所述表位标签多肽仍足够短，使得不会千扰到IL-31 抗体的活性。表位标签优选足够独特，使得抗体不会与其它表位发生 实质上的交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基， 其通常在大约8-50个氨基酸残基之间(优选地，大约9-30个残基之 间)。例子包括流感HA标签多肽及其抗体12CA5 ( Field etal. Mol. Cell. Biol. !: 2159-2165 (1988) ) ; c-myc标签及其8F9、 3C7、 6E10、 G4 、 B7 和 9E10 抗体(Evan et al.， Mol. Cell. Biol. 5 (12): 3610-3616 (1985))和单纯性疱渗病毒糖蛋白D ( gD )标签及其
7抗体(Paborsky et al. ， Protein Engineering 3 (6): 547-55 3 (1990))。 在某些实施方式中，表位标签是"救助(salvage)受体结合表位"。 在本文中使用时，术语"救助受体结合表位"指IgG分子(例如IgG^ IgG2、 IgG3或IgG4)的Fc区域的下述表位，所述表位作用于增加IgG 分子的体内血清半寿期。
术语"片段"在本文中使用时指这样的肽或多肽，其包含IL-31 多肽或能与IL-31多肽免疫特异性结合的抗体的氨基酸序列的至少5 个连续氨基酸残基，至少IO个连续氨基酸残基，至少15个连续氨基 酸残基，至少20个连续氨基酸残基，至少25个连续氨基酸残基，至 少40个连续氨基酸残基，至少50个连续氨基酸残基，至少60个连续 氨基酸残基，至少70个连续氨基酸残基，至少连续的80个氨基酸残 基，至少连续的90个氨基酸残基，至少连续的IOO个氨基酸残基，至 少连续的125个氨基酸残基，至少150个连续的氨基酸残基的氨基酸 序列。
在本文中使用时，术语"免疫球蛋白"指由实质上由免疫球蛋白 基因编码的一种或多种多肽构成的蛋白。免疫球蛋白的一种形式构成 抗体的基础结构单位。该形式是四聚体，其由两对相同的免疫球蛋白 链对构成，每对具有一条轻链和一条重链。在每对中，轻链和重链可 变区域一起作用于使抗原结合，恒定区域作用于抗体效应器功能。
全长免疫球蛋白"轻链"由NH2-末端的可变区域基因和COOH-末 端的K或A恒定区域编码。简单地，全长免疫球蛋白"重链"由可变 区域基因和提到的其它恒定区域基因之一编码(大约330个氨基酸)。 重链被分为Y、 U、 a、 5或s，其将抗体的同种型分别定义为IgG (包括IgGl、 IgG4) 、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。在轻链和重链中，可 变区域和恒定区域通过大约12个或更多个氨基酸的"J"区域连起来， 重链还包括大约10个或更多个氨基酸的"D"区域(一般见， Fundamental Immunology (Paul, W. ， ed. ， 2nd ed. Raven Press, N. Y. 1989)， Ch. 7,其通过引用整体并入本文)。
免疫球蛋白轻链或重链可变区域由被三个高度可变区域隔开的"框架"区域构成。因此，术语"高度可变区域"指抗体中作用于抗 原结合的氨基酸残基。高度可变区域包含来自"互补性决定区域"或
"CDR，，的氨基酸残基(见，Kabat et al.， Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda， Md. (1991)和Chothia and Lesk， 1987， J. Mol. Biol. 196: 901-917 )(这两篇文献都通 过引用并入本文)。"框架区域"或"FR"残基是并非本文定义的高 度可变区域残基的那些可变区域残基。不同轻链或重链的框架区域的 序列在物种中相对保守。因此，"人框架区域"是与天然存在的人免 疫球蛋白高度相同(大约85%或更高，通常90-95%或更高)的框架区 域。抗体的框架区域(其是组成型轻链和重链的框架区域的组合)作 用于对CDR's定位和比对。CDR' s主要作用于与抗原表位的结合。
因此，术语"人化，，免疫球蛋白指包含人框架区域和来自非人(通 常小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR's的免疫球蛋白。提供 CDR's的非人免疫球蛋白被称为"供体"，提供框架的人免疫球蛋白 被称为"接受体，，。恒定区域并不必须要存在，但是如果它们存在的 话，它们必须与人免疫球蛋白恒定区域高度相同，即，至少大约 85-90%，优选大约95%或更相同。因此，人化免疫球蛋白的所有部分 (可能除了 CDR's)与天然人免疫球蛋白序列的对应部分高度相同。 "人化抗体，，是包含人化轻链和人化重链免疫球蛋白的抗体。例如， 人化抗体将不包括上文定义的典型嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的 整条轻链是非人的。
在本文中使用时，术语"人抗体"包括具有人免疫球蛋白氨基酸 序列的抗体，以及包括从人免疫球蛋白文库或从转基因有一种或多种 人免疫球蛋白并且不表达内源免疫球蛋白的转基因动物分离的抗体， ^口上文戶斤述，例:i口，见Kucherlapati et al. in U.S. Patent No. 5， 939， 598。
术语"经遗传工程改造的抗体"表示这样的抗体，其中氨基酸序 列与天然抗体的氨基酸序列已有不同。因为抗体的产生与重组DNA技术有关，因此其不必被限定为天然抗体中发现的氨基酸序列；抗体可 被重新设计，以获得想要的特征。可能的变化有很多，其范围为从一 个或数个氨基酸的改变到对例如可变或恒定区域的完全重新设计。通 常，恒定区域中的改变将被用来改进或改变下述特征，例如，补体固 定、与膜的相互作用和其它效应器功能。可变区域中的变化将被用来 改进抗原结合特征。
除了抗体之外，免疫球蛋白还可以以多种其它形式存在，包括， 例如，单链或Fv、 Fab和(Fab')2以及微型双功能抗体(diabody)、 线性抗体、多价或多特异性杂交抗体(如上文所述，在Lanzavecchia et al.， Eur. J. Immunol. U， 105 (1987)中有详细描述)以及以 单链存在(例如，Huston et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., ^ 5879-5883 (1988) and Bird et al.， Science, 242: 423-426 (1988)，其通过引用并入本文)(一般而言，见Hood et al.， "Immunology", Benjamin, N. Y. ， 2nd ed. (1984)， and HunkapUler and Hood， Nature, 1^15-16 (1986)，其通过引用并入本文)。
在本文中使用时，术语"单链Fv"、"单链抗体"、"Fv"或"scFv" 指这样的抗体片段，其包含来自重链和轻链的可变区域，但其缺少恒 定区域，但它们处于单多肽链中。通常，单链抗体还包含VH和VL结 构域之间的多肽接头，这使其可以形成想要的允许抗体结合的结构。 单链抗体由 Pluckthun 在 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113， Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)中详细讨论过；还见国际专利申请公 开文本No. W0 88/01649和美国专利号Nos. 4， 946， 778和5， 260， 203， 其公开内容通过引用以任何目的并入本文。在一些特别的实施方式中， 单链抗体还可以是双特异性的和/或人化的。
"Fab片段，，包含一条轻链和一条重链的可变区域和CH1。 Fab分
子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
"Fab'片段，，含有一条轻链和含有位于Cm和CH2结构域之间的恒 定区域的大部分的一条重链，使得两条重链间可形成链间二硫鍵，以形成F(ab。2分子。
"F(ab')2片段"含有两条轻链和两条重链，所述重链含有位于 Q和CH2结构域之间的恒定区域的部分，使得两条重链间形成链间二硫键。
术语"微型双功能抗体"指具有两处抗原结合位点的小抗体片段， 所述片段包含与同一多肽链(Vh-VJ轻链可变结构域(VJ相连的重 链可变结构域(Vh)。通过使用短到不能允许相同链的两个结构域间 配对的接头，迫使结构域与另一链的互补结构域配对，产生两处抗原 结合位点。微型双功能抗体在例如EP 404,097 、 W0 93/11161和 Hollinger et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 中描述得更充分。
术语"线性抗体，，指Zapata et al. Protein Eng. 8 (10): 1057-1 062 (1995)描述的抗体。简言之，这些抗体包含串联的Fd片断 (VrCfn-VK-CB1)的对，其形成抗原结合区域的对。线性抗体可以是双 特异性的或单特异性的。
术语"免疫功能性免疫球蛋白片段"在本文中使用时指至少含有 免疫球蛋白重链和轻链的可变结构域的多肽片段。本发明的免疫功能 性免疫球蛋白片段能与配体结合，防止配体与其受体结合，阻断配体 与受体结合导致的生物学应答，或者上迷的任何组合。
术语"单克隆抗体"指源自单个克隆(包括任何真核、原核或噬 菌体克隆)的抗体，其并非指生产其的方法。
本发明部分基于下述发现与IL-31 (例如IL-31Ra和0SMRb )结 合的异二聚受体的亚基在神经细胞(例如背根神经节细胞)上表达。 因此，本发明包括IL-31的拮抗剂在抑制疼痛和验证以及炎性肠病、 Crohn's症、瘙痒症和神经源性疼痛和敏感化的症状中的用途。本发 明还包括IL-31拮抗剂在通过对背根神经节细胞的刺激来提高敏感化 中的用途。
IL-31是以前在公开的美国专利申请中作为Zcytol7rlig被描述 的细胞因子的HUGO名称(见，公开的美国专利申请号20030224487(提交于2003年1月21日的美国专利申请序列号10/352,554,其现被授 权为美国专利号7,064,186 ) ; Sprecher, Cindy et al, ， 2003，它 们通过引用被并入本文)。针对IL-31的异二聚受体包含IL-31Ra和 抑瘤素M受体e (OSMRb)之间形成的异二聚体。IL-31Ra是在共同所 有的美国公开专利申请号20030215838 (提交于2003年1月21日的 美国专利申请序列号10/351,157 )中被称为zcytorl7的蛋白的HUGO 名称。针对人IL-31的多核苷酸和多肽序列分别如SEQ ID NOs: l和 2所示。针对鼠IL-31的多核苷酸和多肽序列分别如SEQ ID NOs: 3 和4所示。在本文中使用时，术语IL-31将表示上文所述的美国专利
发明者C·科耶萨, J·比尔斯伯罗格, L·祖克曼, M·罗格, 约 姚 申请人:津莫吉尼蒂克斯公司