孢子纲物种体外培养的方法及其用途的制作方法

专利名称：孢子纲物种体外培养的方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及孢子纲(Sporozoea)及其种属的成孢子囊原生动物连续培养的培养体系和方法。本发明还涉及用本发明的培养体系和方法制成的裂殖子和卵囊及相关孢子纲生命阶段细胞，供疫苗、检定和其他用途之用。
背景技术：
孢子纲原生动物包括成孢子囊原生动物，其中许多是导致全世界人和动物疾病的病源。其中有着特殊的商业联系的是由孢子纲的球虫亚纲(Coccidia)、真球虫目(Eucoccidiida)和艾美球虫亚目(Eimeriina)引起的疾病，以及由成孢子囊原生动物的囊等孢虫属(Cystoisospora)、艾美球虫属物种(Eimeria)、等孢子球虫属(Isospora)、新孢子虫属(Neospora)、肉孢子虫属(Sarcocystis)、弓浆虫属(Toxoplasma)、泰泽属(Tyzzeria)和温扬球虫属(Wenyonella)引起的疾病。
特别是，球虫病是由球虫亚纲、艾美球虫属物种原生动物寄生虫引起包括家畜如家禽在内的动物所患的一种伤寒疾病。这些专性细胞内原生动物寄生虫主要在肠上皮复制。此类寄生虫具有单宿主的生活周期并展现出高度的宿主性和组织特异性。总的说来，由于球虫病和预防药物费用的综合损失，受其影响的工业每年蒙受重大的经济损失。
家畜球虫病传染的经济影响在养鸡业中体现得尤为严峻，因为养鸡业密集的禽舍会加快疾病的传播。球虫亚纲感染使得禽类例如家禽及其他驯养的鸟类生长迟缓和表皮色变从而造成经济损失。另外，多数艾美属球虫可以经由口腔途径和/或从环境吸入传染的微粒感染单宿主。一旦吸入，寄生虫穿透并损害肠壁粘液层而引起急性发病，例如，导致受感染的禽类生长缓慢和饲料利用性降低。
艾美球虫属物种、等孢子球虫属、囊等孢虫属或隐孢子虫属(Cryptosporidium)原生动物仅需要单宿主即可完成它们的生命循环。在自然条件下，从环境摄取形成孢子的卵囊开始生命周期。摄取成孢子的卵囊的细胞壁被胃机械破坏和/或肠酶消化而破碎。生物体感染期的孢子体在孢子囊内。孢子体侵入肠粘膜或其他位置的薄壁细胞。该感染位置是所包含种属的特征。
在宿主动物的细胞内，孢子体发育成也被称作裂殖体的多核分裂体。各分裂体核成长进入被称作裂殖子的感染体，也就是进入新的细胞并重复该过程。在无数的无性世代以后，裂殖子发育成为小配子母细胞或大配子。小配子母细胞发育成能依次使大配子受精的许多小配子。最终的合子通过形成坚韧的细胞外膜包在囊内，然后被称作卵囊未成孢子就脱落在排泄物中。在适当的环境下，卵囊发育成孢子并可以传染。通过易感的动物传染然后重复该循环。
球虫亚纲传染引起一种特异性免疫。例如，有七种已知的球虫亚纲可以感染雏鸡，其中六种被认为能使之从普通状态到急性发病。
因此，在驯养的鸟类中，引入另外的球虫亚纲或以前未出现的鸟类可以导致该疾病的爆发。卵囊能最大限度防御PH、去垢剂、解朊、酵解、脂肪分解酶、机械破坏(尽管它们可以被实验室的方法破坏)和例如次氯酸钠和重铬酸钾的化学制品，并可在宿主外部存活多个星期。例如，有七种已知的球虫亚纲可以感染雏鸡，其中六种被认为能使之从普通状态到急性发病。
多种方法被用来使家禽对球虫亚纲免疫。所有成功的商业方法均是基于对被包在囊内通常带减毒株的活原生虫给药。尽管已经习惯使用其他途径，但最常规的接种途径还是口服。在美国专利US3,147,186中，Edgar指出可以通过口服给药能存活的柔嫩艾美球虫(E.tenella)成孢子卵囊让雏鸡接种疫苗。在美国专利US4,544,548中，Davis等教导一种不管抗球虫药物是否联合给药而通过连续给药少量成孢子的卵囊接种疫苗的方法。
在雏鸡体内可以通过连续传代完成减毒美国专利US5,055,292已经描述了卵囊早期形成的球虫亚纲株系的选择和减毒，该文献在此引入作为参考。
口服给药孢子囊减毒株也被应用于预防球虫病的交互免疫性。[Shirley的美国专利US4,438,097；McDonald的美国专利US5,055,292和Schmatz等的PCT.WO94/16725]。在Jenkins等Avian Dis.，37(1)74-82(1993)中公开了减毒的另一种方法，它教导用γ幅射处理的孢子体口服给药以防止卵片发育。
接种疫苗的非肠道途径包括皮下或腹腔注射脱囊的孢子体(见BhogalUS4,808,404；Bhogal等US5,068,104)和体内注射卵囊或孢子囊(见Evans等，PCT WO96/40223；Watkins等，Poul Sci.，4(10)1597-602(1995))。Thaxton，US5,311,841教导一种通过卵黄囊注射把卵囊或孢子体给药到刚孵出的雏鸡来对球虫亚纲接种疫苗的方法。
需要对能存活的原生动物接种疫苗是当前所有接种疫苗方法中的一个共同要素。因为需要预防临床传染，使不能存活的原生动物或原生动物抗原具有高度免疫性的方法未能取得成功。
在此以前，已经先从未被感染的活鸟类上获取能存活的活原生动物如卵囊。然而，利用活的动物或一些球虫亚纲种属的鸡卵来培养用于疫苗生产的能存活的球虫亚纲细胞的方法既昂贵又低效。
人们已经长时间寻求一种培养疫苗生产及其他目的所需大量球虫亚纲的高效经济的替代方法。已经试验过球虫亚纲体外繁育，但进展有限。已经有马-达氏牛肾(细胞)(MDBK)支持艾美属球虫体外生长的报道，但是该进展局限在无性发育的复制周期[D.M.Schmatz，Adv，Cell Culture，5241(1987)]。当得自原始宿主的裂殖子用作接种物的时候，可以获得来自E.acervulina[M.Nacri-Bontemps，Aim.rech.Vet.，7223(1976)]、E meleagrImItis[Augustin等，J.Protozool.，2582，(1978)]和E.bovis[Speer等，Z.Parasitenk-d，(1973)]的艾美球虫属物种卵囊。然而，如上所述，应用得自感染动物组织的裂殖子的必要条件限制了这些方式的有效性。
美国专利US5,846,527指出鸟类细胞系来源于支持柔嫩艾美球虫和毒害艾美球虫(E.necatrix)生长的变态胚性组织，但是复制仅被维持72小时。另一个障碍是如果用于制造活菌苗，得自雏鸡的无限增殖比细胞会产生出转移肿瘤到雏鸡的风险。
裂殖子的有限传代已被获知。例如，在美国专利US6,500,438中，使用D.J.Doran，J.Parasit.57891-900，(1971)中提到的一种改进的方法，孢子体被感染进入出生一天的雏鸡肾细胞(PCK)，该细胞在作为细胞集合体的培养物中生长。然而，通过这种方法产生的裂殖子一旦被释放，培养即被终止。现在的意见是，艾美属球虫会显现出同步的生长发育，因此不能诱导产生裂殖子的无限增殖系。即，在相对短的时段后，在卵囊的释放过程中，裂殖子的无限增殖系不会终止。
所以，一种能获得充足的球虫亚纲细胞供疫苗生产及其他的研究使用的高效经济的方法还有着各种长期的需求。裂殖子在无限增殖比哺乳动物细胞上的体外生长的方法将令人期待。然而，如上所述，提供适当宿主细胞的体内培养体系早已用到球虫亚纲无性阶段的无限繁殖中，即，裂殖子仅根据需要就能引起感染阶段的转化。
此处对任何文献的引用不应被理解为将这些参考文献视为本申请可获得的“现有技术”。
发明概述本发明通过提供一种用于在无性发育阶段连续培养专性细胞内孢子纲原生动物的方法来解决上述提出的问题以及其他问题。本发明的方法包括以下步骤提供包含适合孢子纲物种生长的无限增殖比宿主细胞的细胞培养体系，在有效感染宿主细胞的条件下，将感染阶段的孢子纲物种和宿主细胞接触，引起在宿主细胞内的裂殖子生长，其中宿主细胞能通过吞噬作用掺入该原生动物。
此处提供的本发明方法和培养体系用于生产以前不能获得量的孢子纲原生动物的卵囊、裂殖子与/和其他生命阶段。如此量的这些细胞具有多种用途，包括提供包含在动物用活疫苗中存活的孢子纲细胞，和易于获得经济量的孢子纲蛋白质和/或核酸、用于任何有用目的的细胞，如用于诊断、蛋白质疫苗、生物分子学和/或生物体基因研究，等等。
该细胞培养体系包括适合维持宿主细胞和培养物中的孢子纲物种的生长培养基。可以使用适于所选择的宿主细胞系的任何培养基。
在一个优选的实施方案中，生长培养基包括还原剂，所述还原剂呈例如能有效将孢子纳物种在无限培养中保持在其中生殖是无性的生命周期阶段的浓度。可以使用适于本培养体系的任何还原剂，例如，以等效于约0.01～0.05mM的β-巯基乙醇的浓度。
优选的宿主细胞是源自哺乳动物网状内皮细胞的保持吞噬细胞活性的无限增殖比细胞，例如源自单核细胞系的无限增殖比细胞系。
采用本发明方法和培养体系培养的优选的生物体是仅自然感染单一类型宿主细胞且在此之前未成功地以商业规模保持在无限细胞培养中的孢子纲种原生动物。例如，这些原生动物包括感染鸟类的球虫和/或如艾美球虫属物种，等孢子球虫属，囊等孢虫属，隐孢子虫属及其组合。更优选的是艾美球虫属物种。
自然感染两种宿主细胞的孢子纲例如新孢子虫属、弓浆虫属、哈蒙德虫属(Hammondia)、弗伦克虫属(Freankelia)、贝诺孢子虫属(Besnoitia)和肉孢子虫属(Sarcocystis)通常对长期培养更为敏感，虽然它们可以在本发明的细胞培养体系中生长，但这些孢子纲不是通过这些方法生长的优选生物体。
本发明也提供通过本发明的方法产生的孢子纲类原生动物，以及包含此原生动物的抗原生动物疫苗。还提供了鸟类对抗这些孢子纲类原生动物的鸟类接种的方法。
也提供了包含通过本发明培养体系和方法生产的生物体的疫苗组合物，其中包括例如一种或多种药学上可接受的佐剂和公知技术中的防腐剂、着色剂等。本发明的疫苗可以任意地与饮用水、谷物饲料或口服给药的颗粒状物混合。
此外，本发明提供了使用通过本发明的方法和细胞培养体系产生的生物体接种的鸟类。
本发明还提供了一种筛选破坏或抑制孢子纲原生动物生长的活性剂的方法，包括在与或不与所筛选的活性剂接触的情况下，通过上述方法培养该孢子纲物种，并检测相对于不存在该活性剂的生长对生长或生存能力的抑制作用。
发明详述如前所述，本发明提供了包括宿主细胞的培养体系和体外连续培养孢子纲类成孢子囊原生动物的方法。还提供了通过本发明培养体系产生的原生动物细胞，例如孢子纲裂殖子和/或卵囊或其他抗原物质。这样的物质可以被用于需要预防孢子纲感染的动物如人类、鸟类和包括家禽在内的家畜的抗孢子纲接种疫苗的生产。
因此，本发明提供了能无限维持孢子纲细胞无性阶段或充分延长体外期限的细胞培养体系和方法，从而能使此类的细胞的生产经济有效。
本发明的培养体系和方法可产生可存活的和有毒的即感染性的成孢子囊原生动物的培养物群。这些方法通常可用于孢子纲的任何成孢子囊原生动物，尤其是球虫亚纲更具体而言是真球虫目、还有艾美球虫亚目、以及囊等孢虫属、艾美球虫属、等孢子球虫属、新孢子虫属、肉孢子虫属、弓浆虫属、泰泽属和温扬球虫属的成孢子囊原生动物。
本文提供的方法可考虑用于所有孢子纲并特别用于如感染艾美球虫属物种、弓浆虫属、泰泽属、隐孢子球虫属、等孢子球虫属、哈蒙德虫属、弗伦克虫属、贝诺孢子虫属的所有鸟类的球虫目卵囊培养。体外培养方法可以替换和/或补充用于活动物的生长和/或测定具有所指示的寄生虫的宿主物种。
在一个特别优选的实施方案中，例如，本发明对于诸如艾美球虫属、等孢子球虫属、囊等孢虫属或隐孢子虫属和其它需要相似单宿主细胞的原生动物的体外培养是有用的。由于这些原生动物对它们优选的宿主细胞有特殊的受体，并且特异性地不会感染其它细胞，因而给培养这些细胞增加了难度。如前面所提到的，这些原生动物特异性地需要一个单一宿主来完成它们的生命周期。
相反地，其它孢子纲类需要两个宿主来完成它们的生命周期。例如，新孢子虫，弓浆虫属，弗伦克虫属、贝诺孢子虫属、哈蒙德虫属和肉孢子虫属需要两个宿主来完成它们的生命周期，并且已经证明这些在无限增殖比细胞培养中维持一点都不困难，例如，见Dame等，美国专利申请No.2002/0115828A1，其中描述了神经元肉孢子虫属的培养，所公开的内容在此引入作为参考。
在体外长时期的培养原生动物需要一个非常特殊的单一类型的宿主，此前这已被证明是一个棘手的问题，特别是艾美球虫属、等孢子球虫属、囊等孢虫属或隐孢子虫属和其它仅需要一个单一宿主的特殊孢子纲类。本发明方法解决了这个问题，并提供能使这些生物体延长培养的方法和细胞培养体系。
定义为了更好地理解本发明的范围和本质，给出下列定义的术语。
术语“宿主细胞”指在本发明的培养体系所使用的任何哺乳动物类的无限增殖比细胞。优选地，这些是将通过吞噬作用过程掺入原生动物的“吞噬细胞”，即，这类细胞将摄取需要在培养体系中供养的原生动物，以致原生动物被掺入一个吞噬体。例如，本发明考虑采用适合在体外培养并将维持目的原生动物的任何吞噬细胞系。这些包括，例如，源自单核细胞及其后代的细胞系，如巨噬细胞，以及淋巴结网状细胞、脾和骨髓、组织细胞，如中央神经系统的小胶质[细胞]、肺泡巨噬细胞、肝巨噬细胞等等。无限增殖比细胞可以任选自牛、猪、狗、猴、猫、人、马、羊、鼠和/或狼的来源，只举出这些动物来源的一些例子。无限增殖比细胞与所谓“原生”细胞系的区别在于，它们在体外无限生长，然而，原生细胞系和在体内的表现一样，但在体外却不能够无限地复制。
术语“培养”表示卵囊或裂殖子定位到宿主细胞并且传递到新宿主细胞。优选地，尽管这些数量可以变化，在一个典型的培养体系中原生细胞的数量远远大于106个，或在其他实施方案中远远大于109个细胞。除非另有说明，本文中的术语“连续培养”表示无限繁殖的细胞培养。优选地，对艾美球虫属的培养而言，在无性阶段增殖和持续生长的种系培养18天或更长时间就是连续培养。更优选地，连续培养物在无性阶段持续生长并保持长达150天或者更长时间，而且容易被冷藏或冷冻保存，在再引入适宜宿主细胞后随即恢复无性生长。
除非另有说明，术语“驯养的鸟类”在本文指的是包括雏鸡，火鸡，鸭，可捕猎的鸟(包括但不局限于鹌鹑，雉和鹅)和走禽(包括但不局限于驼鸟)。
术语“包囊的”表示原生动物寄生虫的卵囊阶段。
术语“孢子囊”指在卵囊中包裹孢子的囊。从孢子化卵囊的摄入到粪便中卵囊的出现的时间就定义为潜伏期。不同的艾美球虫物种有所不同。
除非另有说明，本文的术语“艾美球虫属物种”表示一个或者多个感染驯养的鸟类的艾美球虫属物种。艾美球虫属物种包括那些在雏鸡中找到的，并且包括例如，柔嫩艾美球虫，堆型艾美球虫(E.acervulina)，巨型艾美球虫(E.maxima)，毒害艾美球虫，缓艾美球虫(E.mitis)，早熟艾美球虫(E.praecox)和布氏艾美球虫(E.brunetti)、也包括那些在火鸡中找到的，并且包括火鸡和缓艾美球虫(E.meleagrimitis)、腺艾美球虫(E.adenoeides)、火鸡孔雀艾美球虫(E.gallopavonis)、分散艾美球虫(E.dispersa)、火鸡艾美球虫(E.meleagridis)，无害艾美球虫(E.Innocua)、和近圆艾美球虫(E.Subrotunda)也指感染如以上定义过的其它家禽的艾美球虫属物种。术语“艾美球虫属物种”也包括先前所有艾美球虫属物种的所有株系，包括但不局限于早熟株系和减毒株，其中包括受过辐射或者经其它处理的株系，致使它们不能完成发育。术语“艾美球虫属物种”还包括任何新发现的株系或如以上定义过的感染家禽的艾美球虫属物种。
除非另有说明，本文中的术语“卵囊”和“裂殖子”表示能存活的、即活的艾美球虫属卵囊和裂殖子，例如从环境、动物和根据本发明的无限增殖比培养中获得的。
本文中的“免疫”和“接种”是同义并可以交换使用。除非另有说明，本文中的术语“有效免疫剂量”表示一定数量的卵囊或裂殖子，或在混合时，一定数量的卵囊和裂殖子，足以引发接种的鸟类的免疫反应，例如，抗艾美球虫属物种抗体效价的提高和/或细胞介导免疫的活化。更确切地，引发的免疫反应提供保护性免疫，这能限制或减少接种后的鸟类临床疾病体征、体重损失、发病率和/或死亡率，这种接种的鸟接受了毒性剂量的禽类特有的艾美球虫属物种。
孢子纲来源本发明的培养体系培养的孢子纲是从已知样品即感染动物中获得，例如，取自血液、粪便、组织或来自环境污染物。如果在样品例如土壤样品或粪便样品中呈现出的种群主要处于孢子囊阶段，种群样品则按照在本文所描述的方法简单地被培养。如果该种群主要处于卵囊阶段，该种群可以通过已知的环境处理方法被诱导孢子形成，或者使用熟知的实验室方法诱导取自该种群的样本进行孢子形成。如果该种群或样本主要处于孢子化卵囊阶段，那么孢子囊可以通过现有技术的已知方法很容易地获得，例如用玻璃珠机械破坏。
卵囊的来源可以从感染动物的粪便或组织、污染的食物或水、土壤、围栏垃圾、床上用品或其它各种来源获得卵囊。孢子囊的分离方法是已知的。用来分离卵囊的关键步骤是改变那些获得卵囊的物质并且对本领域的技术人员将是显而易见的。
以下简要地概述一种从原始环境的样品中分离生物体的有用方式，简言之，第一步是从外来的物质中分离卵囊。通常通过用饱和盐水溶液制成浆液来处理土壤或排泄物，并从浆液中分离孢子囊。例如，将被处理的材料与最少2体积(W/V)饱和NaCl水溶液混合制成浆液。如果有必要，可以在搅拌机或混合器中处理浆液直到得到均匀的稠度。在4℃将浆液以约800×g离心10分钟。用双层24×24纱布过滤收集上清液。通常使用的由样品纯化卵囊的其它方法包括Sheather蔗糖浮集法和硫酸锌浮集法，例如，见LR Ash和TC Orihel，ParasitesA Guide to LaboratoryProcedures and Identification，ASCP Press1991，在此引作参考。
过滤后的上清液用两体积的饮用水稀释并在4℃以约1600×g离心10分钟。用水清洗粒状沉淀的卵囊并如上所述另外离心三次使之沉淀。然后在2.5％重铬酸钾中以相同的水洗涤步骤清洗卵囊三次。最终清洗后，把卵囊保存在4℃的2.5％重铬酸钾溶液内或者转移到用于孢子形成的容器中。
或者，连续过滤可以用来根据尺寸卵囊。如果使用过滤，可以按照前述，用水和2.5％的重铬酸钾清洗卵囊。
孢子形成用公知技术方法可能引发卵囊孢子形成。例如，把卵囊放在2.5％的重铬酸钾溶液的容器中并在开口放置棉花或泡沫橡胶塞就可以完成孢子形成。在28-30℃，容器以250rpm在轨道振动筛上摇动48-72小时。或者，可以不断地摇动含有卵囊的溶液，同时以每小时大约25到75立方英尺的速度向溶液中通入空气使发泡。在孢子形成过程中，样品按有规律的间隔被取出并通过镜检卵囊确定它们是否含有孢子来检验孢子形成。
或者，如果从环境中获得样品，例如地面垃圾，可以给垃圾提供引起孢子自然形成(所需要)的适当的水分和温度条件。
在孢子形成后，通过过滤、离心或本领域的技术人员公知的其它可接受的收集方法来收集成孢子的卵囊。例如，可以在4℃以约1600×g离心10分钟收集成孢子的卵囊并弃去上清液。浓缩后，成孢子的卵囊在4℃悬浮在5.25％的次氯酸钠中10分钟可以被消毒。消毒后将成孢子的卵囊在4℃以1600×g离心或以其它适合的方式从次氯酸钠中移出。然后用蒸馏水清洗成孢子的卵囊4到6次。清洗后，成孢子的卵囊可以保存在2.5％的重铬酸钾，含有30μg/ml庆大霉素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其它合适的消毒剂中。
成孢子的卵囊通过公知技术的方法例如机械分裂和/或外膜蛋白消化可以被断裂以获得无外膜的孢子。下面是一种简便方法。简而言之，例如，将如前所述的那些任选的从环境物质(土壤或粪便)中分离出来的成孢子的卵囊在PBS中稀释至浓度约2×106/ml。把1ml等份试样的这种PBS加到含有125μl的0.5mm玻璃珠的1.5ml微型离心管中。然后高速旋转试管5分钟。之后在冰上冷却。涡旋后，取出上清液并保留。然后用PBS清洗玻璃珠，并保留上清液，将其与涡旋后获得的上清液合并。然后将上清液在约900×g离心大约2～3分钟并弃去上清液。含孢子囊的颗粒沉淀被重悬浮在0.2ml的PBS中。再通过使用血球计或其它确定细胞数目的方法确定每ml的孢子囊浓度。
在宿主细胞系离体培养孢子纲为方便描述，培养体系被描述定义为分批培养体系。技术人员都清楚该培养体系和相关方法易适用于在培养物中生长细胞的其它公知的方法，包括分批投料和连续培养体系在内。例如，动物细胞体外生长的大量公知技术方法的详述见R.Ian Freshney，Culture of Animal Cells，Fourth Edition，John Wiley & Sons，Inc.(C)2000，在此引入作参考。
对于本发明的培养体系，开始的种群可以是自然存在或保持在实验室的种群。如果该种群主要包含卵囊或孢子化卵囊，且在吞噬溶酶体中完成释放的吞噬细胞系被用作宿主细胞，就没有必要依照本发明使寄生虫脱囊。
为使孢子形成/脱囊和裂殖子的生长，样品中的孢子囊用宿主细胞来培养一段时期，它在每个宿主细胞内扩增。这段时期可以变化不同的宿主细胞和裂殖子种类，但对艾美球虫属物种通常是大约72小时。
维持培养基是如本文所定义的一种培养基，它不能被代替但可每三天加入新鲜的培养基。培养的裂殖子发育成熟并生产卵囊或孢子囊。培养时间典型的是约4～约30天。例如，产生裂殖子的典型的培养时间是约10天，而产生卵囊的典型的时间是18天。
特别是如果没有分开培养物，并且让其增加密度，那么卵囊或孢子囊在大约18天被释放到培养基中。另外，适当分开培养物即定期减少细胞密度，培养物就不断产出裂殖子。
通过离心从维持培养基中获得孢子囊，并通过冷冻，低温冷藏或冷冻干燥保存。移去等份试样培养细胞获得裂殖子，通常限于感染的宿主细胞培养物体积的约1/20。然后将该等份试样插入新鲜胰蛋白酶化宿主细胞的亚铺满层。在实验室的规模生产中，裂殖子的最佳转移频率典型的是大约每10天，尽管这将多少随具体的宿主细胞系、孢子纲物种，和/或培养体系的规模而变。如果裂殖子在两个细胞系间通过以便能增强毒性或对新的宿主株系的毒性，最佳转移时间优选但不限于4天。然后通过任何适宜的染色和检测染色过的原生动物(例如，吉姆萨染色)检测宿主细胞的感染。相关地，根据样品中原生动物染色的程度可以估算原始种群中的原生动物的生存能力。潜能试验借助活的鸟类测定可以涉及到生存能力。活的鸟类测定可以确认体外潜能试验有效以制备疫苗。
在优选的实施方案中，本发明提供在艾美球虫属物种的连续培养中能支持生长和脱囊的培养体系。培养体系将裂殖子种群保持其无性分裂形式所需要长的时间，同时当需要的时候，培养体系可以诱发裂殖子脱囊，即终止裂殖子作为卵囊用于疫苗或其它用途。本发明的培养体系的宿主细胞是任何适当并经济地适用于本发明方法的无限增殖化哺乳动物细胞系。
在另一个优选的实施方案中，宿主细胞选自支持艾美球虫属物种脱囊和生长并且能够在连续培养中繁育的无限增殖比吞噬细胞，例如，源于如哺乳动物网状内皮细胞的无限增殖比细胞。这些包括例如，单核细胞及其后代如巨噬细胞，以及淋巴结的网状细胞，脾和骨髓，组织细胞，中心神经系统的小胶质细胞，肺泡巨噬细胞，肝巨噬细胞，等等。无限增殖比细胞可以任选自那些源自牛、猪、狗(例如，ATCC CRL 10389)，猴、猫、人(例如，ATCC TIB202)、马、羊、鼠(如ATCC TIB61)和/或狼的来源，只举出这样的动物来源的一些例子。
至于如何实施本发明并不意味着会受到任何理论或假说的限制，但是据信，吞噬细胞是培养孢子纲生物体最理想的物质，其中部分是归功于它们将寄生虫细胞吸纳入细胞内吞噬体的能力。
然而在另一个优选的实施方案中，本发明也提供了一种能用于鉴定在培养体系中所用的合适的宿主细胞的筛选体系。简而言之，合适的宿主细胞可这样鉴定使用如下文所举例的本发明的培养体系，用候选宿主细胞替代那些实例的牛单核细胞系，在替代培养体系中确定裂殖子的相对于用牛单核细胞所达到的寿命和生长，其它所有参数是相同或相似的。合适的宿主细胞如吞噬细胞将提供用于孢子纲生物体的可用于长期培养无性生殖状态的这类生物体的寿命和生长，例如，至少与作为例示的用于艾美球虫属物种和相关生物体的牛单核细胞一样成功。
在进一步优选的实施方案中，在适于所选宿主细胞长时间培养、同时也包括还原剂的培养基中培养宿主细胞，例如，具有在功能上等同于约0.01～约0.5mM的β-巯基乙醇的还原活性的一定浓度的还原剂。适当的还原剂是指在长期培养中能延长孢子纲生物体寿命的任何一种还原剂，例如，所述孢子纲生物体包括艾美球虫属物种。
在一个特殊的任选的实施方案中，依照本发明，从优选的还原剂中排除二硫苏糖醇(“DTT”)。
在更优选的实施方案中，本发明提供了一种用于鉴定适用于培养体系的还原剂的筛选体系。简而言之，合适的还原剂可这样鉴定使用如下文所举例的本发明的培养体系，用候选的还原剂代替那些实例的β-巯基乙醇，在替代培养体系中，确定裂殖子的相对于用和不用β-巯基乙醇所达到的寿命和生长，例如在类似的还原活性条件下，相对于那些成功使用β-巯基乙醇者。适宜的还原剂将提供用于孢子囊生物体的可用于长期培养无性生殖状态的这类生物体的寿命和生长，例如，对于艾美球虫属物种和相关生物体至少与β-巯基乙醇是一样成功的。
例如，简单地作为实例，优选的还原剂是还原二硫键的物质，包括β-巯基乙醇、巯基乙胺、2，3-二巯基琥珀酸、青霉胺、β-内酰胺、N-乙酰半胱氨酸、抗坏血酸及其等效物和/或其组合。
为了确定最佳的培养物生产能力和寿命，技术人员也可以通过常规地使用例示的细胞培养体系，同时改变选择的还原剂浓度，并保持其它参数恒定来优化适宜还原剂的浓度。例如，对于该还原剂，可以通过检测增加的浓度水平来确定在此浓度水平时，益处不再随浓度增加而提高的水平，或在此浓度水平时还原剂的任何副作用超过培养物的生产力和寿命的益处的水平。
β-巯基乙醇是最优选的还原剂，其在细胞培养基中的浓度为约0.01～约0.5mM或更高，更优选大约0.055mM的浓度。
如何实施本发明不受任何理论或假说的约束，但是据信，在使用的浓度通常小于1mM且优选小于0.1mM的情况下，还原剂选择性地干扰宿主细胞和/或涉及寄生虫性别分化的寄生虫信号和/或释放的信号事件。
如何实施本发明不受任何理论或假说的约束，可以假设，在任选的实施方案中，还原剂抑制吞噬性宿主细胞消化或杀死已掺入到宿主细胞吞噬体中的原生动物，因此有助于提高在吞噬性宿主细胞系中原生动物寄生虫的生存力。
在更优选的实施方案中，宿主细胞培养体系采用无限增殖比吞噬细胞系和包括适宜还原剂，例如，β-巯基乙醇或其功能等效物，如在上述的浓度范围在内的培养基，例如用于艾美球虫属物种生物体的连续培养。
在最优选的实施方案中，宿主细胞是Speer等，1985，Infection andImmunity50566-571中的牛单核细胞(有时指BM617)，在此引入作为参考(Dr.Speer，College of Veterinary Medicine，College Station，Texas)。源自ATCC CRL6017和ATCC CRL 6057的牛单核细胞也作为例证。
本发明培养体系使用培养基、密度、任意的生长底物或表面、温度和环境来决定所选的宿主细胞。任选地，宿主细胞生长在旋转或搅动的烧瓶中的悬浮液中。或者，例如，因为宿主细胞需要固体底物，细胞生长在烧瓶表面、在浸于培养基中的载玻片上、培养皿中、和/或在悬浮在培养基中的任选磁性的微玻珠的表面上，或在适于所选宿主细胞的任何其它公知的细胞生长载体上。
例如，使用本文例示和以上提到的牛单核细胞时，细胞优选以小于80％铺满的密度接种到约150cm2组织培养瓶中以用于培养。优选地，在标准细胞培养基例如Gibco的RPMI培养基中，在37℃、5％CO2气氛下让宿主细胞生长，所述培养基补充抗微生物剂如青霉素/链霉素和抑真菌剂。按实验室规模，当宿主细胞的培养烧瓶达到最大密度，例如80％到100％的铺满，烧瓶中培养物被分离或“分裂”以减少细胞密度例如减到1/6铺满密度。当然，当调整规模以在商业上生产用于疫苗的原生动物材料或其它目的时，技术人员知道该过程是可以变化的。
在适于所选宿主细胞系的温度实施培养体系。优选，在约25～约45℃的温度，更优选地在约37～约41℃实施培养。最优选在37℃。
以艾美球虫属物种培养的鸟类疫苗和疫苗接种虽然生物体是从活的动物或卵来源中得到的，但艾美球虫属物种疫苗是已知的，例如，McDonald等，美国专利5,055,292给出详细方案，在此引入作为参考通过培养体系得到的裂殖子可以用任何公知方法完成纯化。简单举例而言，但没有限制，卵囊可以释放到培养基、和/或通过已知方法破裂的培养细胞中从而得到裂殖子。例如，如J.A.Olson，1990，Antimicrob.Agents Chemother.341435-1439所描述，可以移去细胞碎片。简而言之，Olson的方法包括收集含有释放的裂殖子的培养基、并以450×g旋转离心10分钟以浓缩裂殖子。将包含裂殖子和宿主细胞碎片的颗粒沉淀悬浮在0.1M NaCl-0.05M KCl-20％牛血清白蛋白中，并施加到于pH8.2上平衡在75mM Tris-40mM NaH2PO4-86mM NaCl-100mM葡萄糖中的DE-52阴离子交换柱上。裂殖子过柱。根据A.Kilejian，J.Biol.Chem.2494650-4655，(1974)所述的电子显微镜法检查从柱子收集到的裂殖子的纯度。
用作鸟类疫苗的孢子体或裂殖子或它们的混合物，优选通过卵内给药或在任何适宜的生理介质中注射到雏鸡中。优选地，将它们悬浮在生理平衡的盐水中，例如磷酸缓冲盐水中。所选的介质可以任选包括一或多种悬浮剂，包括适宜的生理凝胶、明胶、水溶胶、纤维素或多糖胶。
在一个优选的实施方案中，例如包括裂殖子和/或孢子体的这种活的生物体，优选卵内给药或注射到雏鸡中或通过下列形式接种给药以任何适宜的本领域已知制剂形式的非肠道、皮下、划痕和/或肌内给药，例如，相容的缓冲液和/或生理学上可接受的盐水，任选与佐剂和/或免疫增强剂或刺激剂组合(例如疫苗接种以前或以后联合给药或系列给药)。
适当的免疫刺激剂包括但不限于细胞因子、生长因子、趋化因子、淋巴细胞细胞培养物的上清液、单核细胞、淋巴器官的细胞、细胞制品或细胞提取物(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或脂多糖制剂)、促细胞分裂剂或包括低分子量药品在内的佐剂。免疫刺激剂可以在培养的任何期间卵内给药。优选地，免疫刺激剂在含有艾美球虫属物种孢子体或裂殖子或它们的混合物的培养基中被卵内给药。
对于口服给药的疫苗/疫苗接种方法，可方便地使用本领域已知的生理学上适宜的缓冲液或悬浮剂。另外，可以加入组合物，例如，混合到饮用水或喷雾到食物颗粒上，撒或喷雾在玉米或其它谷物上，等等。
用于疫苗接种的目的，给药的剂量或接种物包括两种或多种艾美球虫属物种的裂殖子、卵囊和/或它们的组合的活细胞和活性细胞。
对于疫苗接种，通过本发明方法培养的艾美球虫属物种细胞的优选剂量为约10～约106个卵囊或裂殖子或它们的混合物，其中卵囊和裂殖子的总量为约10～约105个。给药后的细胞任选通过适宜的宿主细胞传代、辐射、重组突变和/或其它公知技术方法减毒。
更优选的剂量范围是约102～约105个的卵囊或裂殖子或它们的混合物，其中卵囊和裂殖子的总量为约103～105个。
此外优选的剂量范围是大约102～105个的卵囊或裂殖子或它们的混合物，其中卵囊和裂殖子的总量为102～105个。
任何鸟类包括需要疫苗接种的驯养的鸟类在内，可以考虑接受这种处理。优选地，接受这样疫苗接种的鸟类可以是与商业相关或非商业饲养的鸟类，例如，在球虫感染的条件下大量养殖鸟类是可能的但并不受欢迎。这些鸟类包括，例如鸭科(Anatidae)如天鹅、鹅和鸭，鸽类(Columbidae)例如斑鸠和鸽子如家鸽，雉科(Phasianidae)如鹧鸪、松鸡和火鸡，Thesienidae如家鸡，鹦鹉科(Psittacines)如长尾鹦鹉，麦皋和鹦鹉，例如，为宠物或收藏市场饲养的。也可以考虑用原生动物细胞或其它产自本发明方法的衍生物接种猎禽和走禽。艾美球虫属物种生物体疫苗给药优选的受体是雏鸡。
任何公知的给药途径或疫苗接种都易于使用。因此，可给雏鸡卵卵内任选地给予某一剂量。也可以通过接触幼禽例如刚出生携带疫苗生物体的雏鸡的羽毛任选地给予某一剂量，或通过喷雾器或滴管用饲料口服给药。通过把药物直接涂在口腔、加入到饮用水、和/或在羽毛上喷洒药物然后借助用嘴整理提供口腔传送，从而实现口部释药。也可以通过将生物体用在或混合到被雏鸡摄入的颗粒饲料或凝胶中来任意口服给药。
给雏鸡卵或出生一天的雏鸡卵内给药的优选剂量包括选自柔嫩艾美球虫，堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、毒害艾美球虫、缓艾美球虫、早熟艾美球虫和布氏艾美球虫的两种或多种艾美球虫属物种的卵囊或裂殖子或它们的混合物。
给火鸡卵或出生一天的雏鸡卵内给药的优选剂量包括选自火鸡和缓艾美球虫、腺艾美球虫、火鸡孔雀艾美球虫、分散艾美球虫、火鸡艾美球虫、无害艾美球虫和近圆艾美球虫的两种或多种艾美球虫属物种的卵囊或裂殖子或它们的混合物。对包括在此剂量的每个物种，剂量优选地包括10～106个卵囊或裂殖子或它们的混合物。
任选地，疫苗被联合给药，例如，通过本发明的培养体系产生的艾美球虫属物种进行疫苗接种的同时、之前和/或之后，使用某一剂量范围任何适宜的公知抗球虫病化学治疗剂或化学预防制剂以有效削减疫苗接种的效应，而不会损害接种过的动物的免疫保护性应答的形成。化学治疗剂包括但不限于任何有效的抗原生动物剂，例如，抗原生动物化合物例如抗微生物剂、抗生素、包括抗球虫病抗体例如单克隆抗体和/或其片段或重组衍生物的组合物。
本发明的联合治疗也包括，给予和/或联合同时给予任何公知的免疫刺激剂和疫苗接种，和/或在任何其它时候协同给药。
一种优选的免疫刺激剂给药方法是在最后四分之一培养期或出生一天的雏鸡的时候，同时用某一剂量卵囊或裂殖子或所述的卵囊或裂殖子的混合物卵内给药。
本发明的另一方面是通过冷藏、冷冻或冷冻干燥保存卵囊或裂殖子、或所述卵囊或裂殖子的混合物。例如，当冷冻由本发明培养方法和培养体系产生的活的生物体时，可任选使用公知的冷冻防腐剂。这些包括，举例而言，例如渗透保持剂，如甘油、二甲基亚砜(DMSO)、糖如葡萄糖，半乳糖，棉子糖)、蛋白质如血清、和/或白蛋白和其他血清成分，尿素或氨基酸组合物例如酪蛋白水解产物，例如，N-Z-AMINEA(Quest International，Hoffman Estates，Illinois的IPL5X59027)。
抗原生动物剂的筛选本发明培养体系也提供一种筛选和鉴别抗原生动物剂特别是抗艾美球虫属物种剂的高效有用的方法。筛选的活性剂包括潜在预防或治疗的药物活性剂如药物或抗体等。
简而言之，培养一种孢子纲物种并分离培养物。为了检测预防作用，通过用单层细胞在卵囊脱囊之前在培养基里引入检测活性剂。为了检测治疗效果，首次分裂在正常维持培养基上的培养体系中生长。在两种方法中，第二次分裂在补充有受试活性剂(呈现在溶液或浸渗在试纸或试验圆盘中)的正常维持培养基的培养体系中生长，以评估它杀死或抑制原生动物无性生殖阶段的能力。
为了筛选可替代的治疗剂，可任选使用药敏性原生动物或具有已知抗药性的生物体。
在一个可选择的策略中，培养一种孢子纲物种并分离培养物。首次分裂在正常维持培养基上的培养体系中生长。第二次分裂在补充有该受试活性剂(呈现在溶液或浸渗在试纸或试验圆盘中)的正常维持培养基的培养体系中生长，以评估它杀死或抑制原生动物无性生殖阶段的能力。为了筛选可替代的治疗药物，也考虑在培养体系中使用药敏性原生动物或具有已知抗药性的生物体。
用于疫苗的艾美球虫属物种减毒株的培养一种用于制备疫苗的众所周知的减毒病毒的方法是在组织培养物中培养至高传代水平。通过长期培养，生物体表现出适应培养条件的累积特性并可以丧失毒性。这里描述的培养体系是用于艾美球虫属物种的长期增殖，以培养用作活疫苗的非病毒株。该技术采用如实施例2中描述的有着50或更多次传代的裂殖子培养物传代。
或者，可以选择适于在牛单核细胞上生长的裂殖子，选择是根据其在可选细胞系例如取自各物种(如狗，猫，牛或其它)的肾脏细胞上生长的能力而作出的。在各种传代水平，源自这些连续培养物的裂殖子或卵囊可以通过接种到出生一天的雏鸡或实施例4中描述的胚胎化卵中来测试毒性。保留在培养物中复制的能力却在宿主上表现出毒性减弱的高传代株将被选择用于疫苗开发。
实施例除非另有说明，下列特定的实施例是为了举例说明，而非想要限定本发明的范围。
实施例1制备用于接种的连续培养体系连续培养体系可按以下制备将牛单核宿主细胞的无限增殖比系传代76次并发现不含支原体。牛单核细胞系是上述的Speer et al.，Id，中的细胞的衍生物。
将宿主细胞维持在补充有青霉素(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)、两性霉素(2.5μg/ml)、β-巯基乙醇(.055mM)和10％马或牛血清(维持培养基)的RPMI1640(Gibco)培养基中。
将宿主细胞以约6×104个细胞/ml和每瓶15ml的量接种在150cm2组织培养瓶中，产生不超过80％到100％铺满的密度。将细胞在37℃、5％CO2的培养箱中用固定的烧瓶培养。每三天用15ml的新鲜维持培养基对细胞补料并每七天分开一次。用0.25％的胰蛋白酶破坏单层而分开培养物，并使用相同培养基和培养条件把1/6的培养物移种在每个新的150cm2的培养瓶中。
实施例2培养艾美球虫属物种原生动物将取自被感染的雏鸡的粪便的堆型艾美球虫卵囊按以下制备用于培养。通过加入10份水到1份粪制成粪便浆液，并通过糖浮集法(类似于在LR Ash和TCOrihel，ParasitesA Guide to Laboratory Procedures and Identification，ASCP Presst1991，pp.34-35所描述的Sheather′s的糖浮集法)纯化卵囊，在此引入作为参考。将卵囊离心来浓缩，再重悬浮在2.5％的重铬酸钾中，然后室温下在空气里暴露24到72小时以利于孢子形成。使用前在4℃下保藏孢子囊。在约25℃下将形成孢子的卵囊在氯己定葡萄酸盐溶液[PerioguardTM]中悬浮1分钟以杀死污染性细菌。通过洗涤除去氯己定葡萄酸盐。通过离心(800×g 6分钟)使卵囊沉淀，丢弃上清夜，(如果上清夜被丢弃，怀疑还悬有沉淀颗粒)然后如实施例1所描述，在100体积的抗生素/抑真菌剂维持培养基中使沉淀悬浮来进行洗涤。离心和重悬浮再重复进行2次。
在不超过80％铺满，胰蛋白酶化接种后，立即使用实施例1中制备的牛单核细胞的烧瓶。然后每个新制备的烧瓶以约1000个的卵囊接种在15ml维持培养基中，该培养基如上所述制备，孢子囊/卵囊相对宿主细胞的密度为每宿主细胞10-3个寄生虫。将培养物接种在约37℃的5％CO2培养箱的固定烧瓶中。
用牛单核细胞培养卵囊10天，每3天加入新培养基(15ml)。10天后，通过以下方法收集培养物上清夜和感染的细胞，刮取单层细胞到培养液中，再如实施例1所述以小于80％的铺满将1/20的培养物接种在新鲜(未感染过)牛单核细胞的单层细胞上。每天观察培养物的裂殖体，并观察宿主细胞释放的和浮集在培养基中的孢子囊/卵囊。通过倾析上清夜培养液收集活的孢子囊/卵囊，随后以800×g的速度离心6分钟来浓缩寄生虫。立即使用孢子囊/卵囊或保藏在2-7℃的培养基中，直至用于另外的实验。感染裂殖子的细胞被传代总计180天，并保持它们在此培养物中连续复制的能力。
实施例3保藏成孢子囊的生物体本发明也提供通过观察体外培养和无须对鸟进行接种的感染性来评估保存的艾美球虫属物种卵囊/孢子囊生存能力的方法。
堆型艾美球虫的卵囊/孢子囊可通过使用蔗糖浮集的方法从雏鸡的粪便中获得或可从如实施例2所述的培养物中获得。
卵囊/孢子囊分为相等的个等份试样。其中四份用低温冷藏剂(如FreezingMediaTM，Gibco)，在-20℃冷冻，而第五份保藏在2～7℃。
通过与牛单核细胞中的感染性对比，可以比较得自该培养物的四份冷冻样品与已冷藏的第五份样品的生存能力。
生存能力比较按以下方法进行。
简要地，采用实施例1的方法，寄生虫接种之前(接种时少于80％铺满)，立即把牛单核细胞以每孔1～2×105个细胞的密度移种在带灭菌盖玻片的24孔培养板内。在维持培养基(来自实施例1)中制成连续稀释的检测样品(例如，10-1～10-4)，并将0.1ml接种在24孔培养板的一式两份孔中。在约37℃、3～5％CO2的条件下将培养板培养1到4天。通过显微镜检查检测孔中堆型艾美球虫感染阶段的出现。或者，从孔移去盖玻片，并用吉姆萨染色以便于堆型艾美球虫寄生虫的观察。当最高稀释表现出50％感染性时计算每个样品的效价。根据相关的感染效价比较样品的生存能力。
实施例4从培养物中收获裂殖子通常在培养物(见实施例1和2)被活跃地复制时，例如在最后分裂(传代培养)的10天内收获裂殖子。使用细胞刮取器获得感染的细胞和培养物上清夜。用机械方式(用27号针头的注射器抽取)溶解宿主细胞。然后，通过离心(450×g，10分钟)浓缩裂殖子并在维持培养基中重悬浮。再将最终的悬浮物用于试验动物的接种。
实施例5从培养物中收获卵囊为了积聚更多的卵囊，在18天或更长的时间里使其不分裂地生长，然后从培养物(见实施例1和2)中收获卵囊。如上所讨论过的，用Sheather浮集法收集培养物上清夜并纯化取自细胞碎片的卵囊。然后通过离心(405×g，10分钟)浓缩卵囊。将沉淀的卵囊在维持培养物中重悬浮并立即使用。
实施例6雏鸡的接种本实施例可以证明用上述实施例2的培养方法生长的堆型艾美球虫和柔嫩艾美球虫卵囊和裂殖子作为保护性疫苗的可能性。
实验A以堆型艾美球虫和柔嫩艾美球虫卵囊接种雏鸡方法通过倾析培养19天的培养物上清夜获得源自培养牛单核细胞的柔嫩艾美球虫和堆型艾美球虫卵囊。通过离心浓缩卵囊，并将其重悬浮在浓度为每ml 100,000个卵囊的培养基中，然后立即使用。
该试验采用三组Rhode Island Red出生一天的雏鸡。实验组1是接受堆型艾美球虫的源自组织培养物的卵囊的雏鸡(n＝3)；实验组2是接受柔嫩艾美球虫的源自组织培养物的卵囊的雏鸡(n＝3)；实验组3是对照雏鸡。无卵囊(n＝2)。组1和2分别用管饲法(每雏鸡100～1000)口服给予卵囊。
结果9天后在实验组1的雏鸡粪便中发现卵囊，而12天后在实验组1和实验组2的粪便中都有发现。这些数据证实了源自培养物的卵囊在这些物种所预期的正常潜伏期内在宿主中是存活的并且进行了复制。
没有给予卵囊的组3对照雏鸡在其粪便里没有脱落的卵囊。这些数据证实在试验的鸟类中或棚舍条件下没有艾美球虫属环境污染的证据。因此，组1和2中脱落的卵囊可以归因于培养物接种。
组织病理学给予柔嫩艾美球虫卵囊的雏鸡死于严重的腹泻。
显微镜观察取自死亡雏鸡的肠道组织切片确认球虫病的诊断。这些数据表明源自牛单核细胞培养物的卵囊可以对鸟类宿主维持它们的毒性。
实验B堆型艾美球虫和柔嫩艾美球虫对雏鸡的攻击生物体的培养和传代在制备实验中，将取自以上用于A部分的大量卵囊中的等份试样的卵囊按实施例2所述培养，以产生裂殖子的连续培养。在包含牛单核细胞的150cm2烧瓶中接种100个卵囊。如实施例2所述将的培养物经过2次传代以保证在培养物中没有未脱囊的卵囊出现。
接种用培养的裂殖子给出生一天的雏鸡(一半为Rhode Island Red或Barred Rock和Americana)口服接种。接受如上制备的100,000个源自培养物的堆型艾美球虫或柔嫩艾美球虫的裂殖子的鸟类出现腹泻。而接受1000,5000和10,000个裂殖子的出生一天的雏鸡没有出现腹泻。
在接种培养的裂殖子后14天，给予1000,5000和10,000个裂殖子的雏鸡和没有接种的1只未接种对照雏鸡都转移到如上从A部分脱落卵囊的雏鸡先前驻留过的环境中。当放置在这个污染过的环境里时，没有接受裂殖子的出生一天的雏鸡死于球虫病感染。然而，先前接种过少量裂殖子的雏鸡在临床上依然健康。这些数据表明亚临床剂量的裂殖子可以诱导鸟类的免疫性，这保护它们可免于随后艾美球虫属物种致死剂量的攻击。
表一雏鸡接种试验结果鸟类数目 试验号 #堆型艾美球虫 柔嫩艾美球虫裂殖子 对裂殖子的粪便/临床 对攻击的临床反裂殖子 反应 应2 B 60 60 粪便阴性 未进行2 B 100,000100,000 腹泻 未进行2 B 10,000 10,000 粪便阴性 无临床体征2 B 5,000 5,000 粪便阴性 无临床体征2 B 1,000 1,000 粪便阴性 无临床体征1 B 0 0 粪便阴性 死于球虫病实验C用堆型艾美球虫和柔嫩艾美球虫接种10天的胚胎将1000个源自牛单核细胞培养物的堆型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的裂殖子(如实施例2)通过尿囊途径体外接种到10天大的胚化雏鸡卵中，导致任一物种的裂殖子的胚胎死亡。在组织中没有卵囊形成的证据。这些数据表明在牛单核细胞中培养后两种艾美球虫属物种都保持胚胎毒性。
实施例7筛选抗原生动物剂通过使用实施例1和2的体系评估对抗孢子纲物种的推荐的抗原生动物剂的有效性。
A.筛选地克珠利(Diclazuri)使用包含ThermonaxTM(Nalge Nunc International，Naperville，IL)的24孔组织培养板，牛单核细胞被接种并在应用实施例1方法的维持培养基中生长到小于80％的铺满。随后，每个孔用堆型艾美球虫和柔嫩艾美球虫接种。把抗球虫剂地克珠利引入10个检测孔的每一孔的培养基中，而另10个孔作为对照。在24、48、72小时培养物中裂殖生殖的出现被用来在对照孔和治疗孔之间比较、以评估受试活性剂的抗原生动物活性。通过显微镜检查和吉姆萨染色的盖玻片观察寄生虫的生长。裂殖生殖的出现和对照孔减少的百分比也被用来评估药物治疗效果。
B.筛选其他活性剂采用24孔组织培养板，宿主细胞在适宜的维持培养基、温度和适于宿主细胞的大气压中生长到小于80％铺满，然后每个孔用本发明孢子纲物种接种。将被试验的一种或多种活性剂引入到10个检测加样孔的每一孔的培养基中，而其他10个加样孔作为对照。在对照加样孔和治疗加样孔之间比较在培养物中约1-10天后的生长，从而评估试验试剂的抗原生动物活性。
可以用显微镜检测或用吉姆萨染色法或观察寄生虫的适宜染色法染色的盖玻片来观察寄生虫的生长。
实施例8评估控制原生动物的方法实施除去可传播诸如球虫亚纲的生物体到圈养在特定位置的动物中的物质的处理方法是减少家畜原生动物感染的方法之一。
采用实施例1和2各自的方法和培养体系易于评估这些处理方法。
标准样品(例如垃圾的样品)取自相关地区，并将其处理以分离可能存在的卵囊。把这些接种到如实施例2所述的培养体系中，并测定5-10天后的生长，同时把具有已知数量生物体的样品联系起来，以确定与初始样品相关的生长水平。
然后实行新的处理方法，其后，在处理操作变化之前在选定的位置收集预定量的标准样品。然后培养新样品，并把在5-10天时的生长与处理前样品的生长相比较，以确定在相关的环境中存活的原生动物的任何减少。
权利要求
1.一种在无性发育阶段连续培养专性细胞内孢子纲原生动物的方法，包括(a)提供包含适合孢子纲物种生长的无限增殖比哺乳动物宿主细胞的细胞培养体系；其中专性细胞内原生动物可以感染鸟类；和(b)在有效感染宿主细胞的条件下将宿主细胞与感染阶段的孢子纲物种接触，从而导致宿主细胞内裂殖子的生长。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于细胞培养体系包括适于维持宿主细胞和孢子纲物种生物体的生长培养基。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于生长培养基包括还原剂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于该还原剂以有效维持无限培养物中的孢子纲物种生物体处于无性生殖生命周期阶段的浓度存在。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于该还原剂选自β-巯基乙醇、巯基乙胺、2，3-二巯基琥珀酸、青霉胺、β-内酰胺、N-乙酰半胱氨酸、抗坏血酸、谷光甘肽及其组合。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于该还原剂是浓度范围在约0.01～约0.5mM的β-巯基乙醇。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于该宿主细胞是源自哺乳动物网状内皮细胞的保持吞噬细胞活性的无限增殖比细胞。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于该网状内皮细胞是单核细胞。
9.权利要求1所述的方法，其特征在于该孢子纲原生动物是属于选自艾美球虫属、等孢子球虫属、囊等孢虫属、隐孢子虫属及其组合的属的物种。
10.权利要求9所述的方法，其特征在于该原生动物是艾美球虫属物种。
11.权利要求10所述的方法，其特征在于该原生动物选自柔嫩艾美球虫、堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、毒害艾美球虫、缓艾美球虫、早熟艾美球虫、和布氏艾美球虫、火鸡和缓艾美球虫、腺艾美球虫、火鸡孔雀艾美球虫、分散艾美球虫、火鸡艾美球虫、无害艾美球虫、近圆艾美球虫及其组合。
12.权利要求11所述的方法，其特征在于该原生动物是堆型艾美球虫或柔嫩艾美球虫。
13.通过权利要求1所述方法生产的活的孢子纲原生动物。
14.权利要求13所述的原生动物，其中所述原生动物是属于选自艾美球虫属、肉孢子虫属、弓形体属、隐孢子虫属、等孢子球虫属、哈蒙德虫属、弗伦克虫属和贝诺孢子虫属的属的物种。
15.一种包括权利要求13所述的原生动物的抗原生动物疫苗组合物。
16.一种引起抗原生动物保护性免疫的鸟类接种方法，包括把由权利要求1所述方法生产的活生物体给药到需要它的鸟类，其中活生物体的数量能有效引起鸟类的保护性免疫。
17.权利要求16所述的方法，其特征在于所述鸟类是驯养的鸟类，且该原生动物是球虫属。
18.权利要求16所述的方法，其特征在于该鸟类选自鸭科、鸠鸽科、雉科、Thesienidae、鹦鹉科及其物种。
19.权利要求16所述的方法，其特征在于该鸟类是火鸡或雏鸡。
20.权利要求16所述的方法，其特征在于活的生物体数量包括裂殖子或卵囊或其混合物，其中所述活的生物体总的数量范围是10～106。
21.权利要求20所述的方法，其特征在于活生物体数量包括102～105个裂殖子或卵囊。
22.权利要求16所述的方法，其特征在于活生物体包括以选自口服给药、扬撒或雾湿羽毛、卵内注射及其联合的给药方式给药裂殖子或卵囊。
23.一种细胞培养体系，包括适于孢子纲物种生长的无限增殖比吞噬宿主细胞，并且细胞培养基包括一定量的还原剂，该一定量的还原剂能有效提高无限细胞培养物中无性增殖生命阶段的孢子纲物种的存活，其中所述提高是相对于无还原剂时培养的孢子纲物种的存活而言的。
24.权利要求15所述的疫苗组合物，其特征在于包括药学上可接受的佐剂。
25.一种疫苗，包括食品组合物和权利要求24所述的疫苗组合物。
26.一种筛选破坏或抑制孢子纲原生动物生长的活性剂的方法，包括在与或不与所筛选的活性剂接触的情况下，通过权利要求1所述方法培养该孢子纲物种，并检测相对于不存在该活性剂的生长对生长或生存能力的抑制作用。
27.一种连续培养无性发育阶段专性细胞内原生动物的方法，包括(a)提供包含无限增殖比牛单核细胞的细胞培养体系；其中无限增殖比牛单核细胞能够通过吞噬作用与原生动物结合；其中细胞培养体系包含适于无限增殖比牛单核细胞生长的培养基，和浓度范围是约0.01～约0.5mM的β-巯基乙醇；和(b)在有效感染宿主细胞的条件下使宿主细胞与感染阶段的原生动物接触，导致宿主细胞中的裂殖子生长；其中原生动物选自感染鸟类的艾美球虫属、等孢子球虫属、囊等孢虫属、隐孢子虫属。
28.权利要求27所述的方法，其特征在于该原生动物是选自以下的艾美球虫属物种柔嫩艾美球虫、堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、毒害艾美球虫、缓艾美球虫、早熟艾美球虫、和布氏艾美球虫、火鸡和缓艾美球虫、腺艾美球虫、火鸡孔雀艾美球虫、分散艾美球虫、火鸡艾美球虫、无害艾美球虫、近圆艾美球虫及其组合。
29.权利要求27所述的方法，其特征在于该方法还包括降低培养体系中宿主细胞浓度的步骤，只要生长达到至少80％铺满。
30.一种得自一种或多种原生动物艾美球虫属物种、用于雏鸡或火鸡免疫的疫苗，包括鸟类艾美球虫属物种的裂殖子；产自裂殖子的卵囊或其混合物；其中裂殖子已在无限增殖比哺乳动物吞噬细胞的连续培养物中增殖。
31.权利要求30所述的疫苗，其中该哺乳动物吞噬细胞是单核细胞。
32.权利要求31所述的疫苗，其中该单核细胞是牛单核细胞。
全文摘要
本发明涉及通过导致产生裂殖子连续培养的体外组织培养而使原生动物的卵囊脱囊和生长的方法。本发明也提供一种经济又可靠的，用于疫苗生产、测定和研究的培养的艾美球虫属物种。还提供已用所给出的艾美球虫属物种接种的驯养的鸟类。
文档编号A61K39/38GK1652816SQ03811387
公开日2005年8月10日 申请日期2003年5月20日 优先权日2002年5月21日
发明者S·P·埃利森 申请人:先灵-普劳有限公司, 病原体研究公司