专利名称：家蚕微孢子虫极丝蛋白ptp3基因及用途的制作方法
技术领域：
本发现涉及生物技术领域，特别是涉及一种来自于家蚕微孢子虫的繁殖和侵染有关的 重要蛋白PTP3基因。
背景技术：
微孢子虫是普遍分布于自然界的细胞内专性寄生原虫，近150个属1200余种，有着 极为广泛的宿主，包括脊椎动物和无脊椎动物，是经济昆虫、鱼类、兔类、产毛动物、啮 齿类及灵长类的致命病原。而家蚕微孢子虫(7fow历s ^历Z^cis)，分类地位属于原生动物 门，单丝孢子虫亚门，微孢子虫纲。由微孢子虫寄生于经济昆虫家蚕而引起严重的传染性 微粒子病，且由于微孢子原虫可以通过胚胎向下代传播， 一直被养蚕国家和地区列为蚕业 生产法定检疫对象。单就我国每年因带毒种和微粒子病而带来的直接经济损失即达上千万 元以上。攻克微粒子病这一蚕丝业的顽症，是蚕业界的重点和难点研究领域。
微粒子病是由微孢子虫寄生宿主而引起的疾病。微孢子虫以其独特的侵染方式，广泛 寄生并感染极具经济价值的昆虫、鱼类、啮齿类、兔类、皮毛动物、灵长类以及家庭宠物 如狗和鸟，引发严重疾病甚至死亡，严重制约着世界蚕业生产和动物保育。甚至还能机会 性地感染艾滋病(HIV)患者、器官移植病人、服用免疫抑制剂药物病人和先天性免疫机 能不健全者，引起呼吸系统、泌尿系统和皮肤溃烂等恶性疾病，加剧病情，加速病人的死 亡。100多年来，尽管己使用了多种化学药物进行治疗，如咪唑类、烟曲霉素、歌咪啶 碱、苯莱特、甲基托布津等等，但治疗效果并不理想，至今仍未发现有治疗微孢子虫病的 特效药物。
极管是家蚕微孢子虫繁殖和侵染的重要器官，在家蚕微孢子虫对家蚕的侵染中起着关 键性作用。极管长度一般在50 15(Vm，直径一般在O. 1 0.2pm范围。极管具有柔韧性， 在运送孢原质的过程中其管直径可以增加到0.4pm，孢原质运送完毕后其长度会縮短5 10%。在家蚕微孢子虫入侵过程中，极管在适当剌激后迅速弹出并"刺入"家蚕细胞中， 同时将孢原质注入其细胞质，完成对家蚕的入侵。而其组成成分主要是蛋白，而极管蛋白 PTP1是它主要的组成部分。极管蛋白PTP1是一种伴刀豆球蛋白，是极管的主要蛋白，在 ￡力e^o历中PTP1蛋白的含量占整个极管蛋白的70%。通过SDA-PAGE和银染分析PTP1发 现，不同种类的微孢子虫的PTP1分子大小不等。对不同微孢子虫PTP1蛋白的研究表明，PTP1蛋白具有疏水性、高脯氨酸含量和免疫抗原性等诸如特征(Delbac et al.,1998)。 而PTP2和PTP3也是构成极管的重要组分。有研究认为，在极管弹出过程中，PTP1和PTP2 在孢子激活之前呈类结晶状蛋白质单体，发芽过程中在极管顶端形成聚合体，而PTP3通 过调控PTP1-PTP2聚合体的构象状态影响极管的弹出。另外，极管蛋白PTP1的糖基化作 用对极管的构造起着重要的作用，从而间接影响微孢子虫对宿主细胞的入侵。但是目前关 于微孢子虫极管蛋白的研究仅局限于^7c印/ a"'tozo朋、67收朋、^7es朋和7fe^历a等部 分微孢子虫属的少量微孢子虫。
发明内容
本发明拟基于基因组分析数据，其目的在于提供一种家蚕微孢子虫极管蛋白PTP3基 因。通过分析PTP3的功能、组成和特性，弄清极管蛋白PTP3在家蚕微孢子虫极管弹出过 程中的作用，探明家蚕微孢子虫侵染宿主家蚕致病的机制，对生产实践和疾病防治具有极 其重要的意义。
本发明申请人通过对家蚕微孢子虫极丝蛋白PTP3基因的克隆，得到了该蛋白基因的
编码序列，具体方法如下
(1) 同源性预测通过对家蚕微孢子虫与兔脑炎微孢子虫基因组的基因同源性分析，
得到了家蚕微孢子虫极管蛋白PTP3基因序列CDS;
(2) 引物设计利用引物设计软件Primer 5.0进行引物设计，在正向引物加入BamH
I酶切位点，在反向引物加入SalI酶切位点，引物序列分别为 PTP3-Primer-F5'-CGGGATCCCTACACATTATTTG-3'
PTP3-Primer-R5-CGGTCGACGTGATGATGGGATTCC-3'
(3) 极丝蛋白PTP3PCR扩增和克隆利用提取的微孢子基因组直接作为模板，采 用基因组PCR扩增目的片段；将扩增片段克隆到pMD18-T (TaKaRa)载体上，然后进行
序列测定(上海英俊)，从而获得的极丝蛋白PTP3全长编码序列；
(4) 序列同源性分析同源性比对在NCBI站点上用BLAST完成，BLAST分析表明家
蚕微孢子虫极丝蛋白PTP3与NCBI蛋白质库中蛋白质没有显著的同源性，而极丝蛋白PTP3
是家蚕微孢子虫极管的重要蛋白，因此极丝蛋白PTP3基因是一种新发现的蛋白基因。
上述方法获得的PTP3基因全长cDNA基因及其推断的氨基酸序列如下
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S S P L KPTP3基因在制备杀虫剂特别是杀蝗剂中的应用。
10本发明的优点是-
(1) 由于微孢子虫极管蛋白PTP3是组成微孢子虫极管的主要蛋白，而极管是微孢子虫繁殖和侵染的重要器官，通过它广泛寄生并感染极具经济价值的昆虫、鱼类、啮齿类、兔类、皮毛动物、灵长类以及家庭宠物如狗和鸟，引发严重疾病甚至死亡，严重制约着世界蚕业生产和动物保育。甚至还能机会性地感染艾滋病(HIV)患者、器官移植病人、服用免疫抑制剂药物病人和先天性免疫机能不健全者，引起呼吸系统、泌尿系统和皮肤溃烂等恶性疾病，加剧病情，加速病人的死亡。齿此所获得的极管蛋白PTP3对研究微孢子虫繁殖和侵染机制有其重要作用。通过分析PTP3的功能、组成和特性，弄清极管蛋白PTP3在家蚕微孢子虫极管弹出过程中的作用，探明家蚕微孢子虫侵染宿主家蚕致病的机制，对生产实践和疾病防治具有极其重要的意义。
(2) RNAi干涉等试验分析表明，把极丝蛋白PTP3干涉到后，微孢子虫失去感染宿主的能力。所以微孢子虫的极丝蛋白PTP3和它潜在的调控基因将成为治疗微孢子虫感染新的因素。还可以通过转基因的手段，使之它高丰度的表达，从而杀害蝗虫等部分害虫。
具体实施方式
-
应用Glimmer3.0软件，通过对家蚕微孢子虫与兔脑炎微孢子虫基因组的基因同源性分析，得到了家蚕微孢子虫极管蛋白PTP3基因序列CDS;应用Primer5. 0软件，设计出一对特异性引物
PTP3-Primer-F5-CGGGATCCCTACACATTATTTG-3'
PTP3-Primer-R5'-CGGTCGACGTGATGATGGGATTCC-3'扩增片断克隆到PMD18-T载体上，序列测定由上海英骏完成，获得的极丝蛋白PTP3全长编码序列；同源性比对在NCBI站点上用BLAST完成，序列分析表明它为一个新蛋白基因。序列表
SEQUENCE LISTING<110>西南大学
<120>家蚕微孢子虫极丝蛋白PTP3基因
<130>
<140><141>
<160> 1
<170>
<210> 1<211> 4110<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyxmori)<400> 1
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<213> 家蚕(Bombyxmori) <400> 1
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781 KIHIDEATAY FKPAAKLKME KKGIKTDNFR PKTNQGEIRD MPKGETYYEV DLKDADLSLP
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1021 GQEDPKKARL MTQKTIDVTE YYINDGKPSS AIKNQLIQNY RALADSLGMT EEDFIQFARK
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1261 IVGVPIVAAV TTPVIRPAVL RTPPAAQSSS SALQGNTALT GAGTPRAGVA GSPGVNPGPT
1321 GKAPVSPPAP TSPASSPTAS PIAPTASPIA PTGASIGAPG SLGIPSSPLK
1权利要求
1、一种家蚕微孢子虫极丝蛋白PTP3基因，其特征在于其序列如下1 atgatctaca cattatttgt aatatacata tctagcacat tttgtaggat aatctcaaga61 agtacagtag aaaatggtcc tcccacagtt cctttcgatg aacatcaagc taaacatgtt121 catgttcgag tgcacggtag acacagacat ggaaatcacc atggtggtgg tcaagacgta181 cacgaagttc aaaaacacca cagtcatcac cacaatgggc ataattacgg tcttgaacat241 ggaaaattcg gaaatgtaac ttacacttct ggaaatcacc atggtcacca ttctcatcac301 ggttctcacg cggatggaca ccattctcaa tacggttcgc acgcggacgg acatcatgtt361 aacgcccaat cagatgcttc tgcaccacta gacgttttgc caatgaaaga agtaagaagt421 ggtgatgatc cagctttgga gagagatcta ggaattcaac aagccatgaa agcttttcga481 tcttctttac ctgtttcaaa taaagacacc aattctcttt tggataaagc tgaaggaatt541 ttaagaagtg caccagacgg ccaattagat gctcctgttc ttgatagtta cggaaatcca601 actgggcaga catacagaga agccgcagaa gatgcagtag gctataagta tccaacagca661 gtagcagatg aagaattcga tagtttagta aggagtggtg ttgaaccggg aagagccaag721 caagtagctg ataaaattga agaaacaggt tttgaacacg agaaaattaa agatgcagta781 agaaatgaag tagctagagg tacagcaaac agagccgtag cagaattaca agacgaaatt841 caaagacgta aaaatgctac taaagtcaaa gaacgtgtta aagttgaaga tgaattgtac901 agacaacaca ctcttcctgc tactggttta ttcgatgaag acgtgtctgt tctgaaaaat961 atgagccaaa ttgttccgcc tgcgaaaatt gtcgactaca tcagagactc ctatgataat1021 tcaattgaag ccggacttcc tcctgcggtt gctcgtgctc aggccgatcg tgttggttct1081 ttaattacgg atttcaatac aatgttaaga agtggtgaat ctcctgaaac tgctttgtcc1141 catcttaaag acatgtctga taggcaatca aaagtcgatc aaagaagaga attacttcag1201 aactctagtc cagaagtctt aaaaatactt tcagataaag ataatttaat taaagaagca1261 ctggttaaaa ctgcaagaga tcctgactgt agagacagat actttgatga agcctcccag1321 aagatgaaga ttcttgatgc aagagaagcc agttttattc atgatactga aaataacaag1381 cacatacgtc gtcctaggaa aatggcagaa gatttaatgg ataagactaa cagagataat1441 gcagaattag ttgatgtagc ttatagtcac ccagtagtag ccaaagacat tttaaaacaa1501 ggtattgcaa acactgaaag agtagctgag aaattggctg atcatttgga tgctgtaaaa1561 tttgctgaaa aagctcaaaa tccttcagct gtttcggctt tgaaacttct tgacgagaga1621 aagagacaag atgaacttga aaaaatcaat aagagaaata cagaaaatga gcaaaagatg1681 ttcaagcaga ttctaaaaga ccaagaagac gcggaagtaa tgcaaaccga agagaaaatg1741 gcagccgcaa acaaagcaag aaagatttta gatgaaggac gtagggcagc tgaacaagtt1801 ttgaaagcgg gtggaagtac tgatgaagct gctgctgttc gtgttgcagc tgagaatgct1861 actgctcgag gtttggaaca aagagaatcc atgatcgaag aagagattat gaaaaggttt1921 ggaggcgcag gtgatcctga aaaagctcgt aaaatggctg ctcacattgc tatcgctcac1981 agtggagaaa atgccgtagg aaaaacgccc gaagaagtca ttaagaaaga acaagaagcg2041 caaaagaaag agattttaag aaatgctttg tatgatgata ttggaaaaga accaatcgaa2101 attaagtctg taattccaga agaccgagat gaatactcta ttgacagaag tgtaattaaa2161 tttcctctta aaacatttat tgatgaagaa gtaagcaatg ttggagaagc ctacgtaaag2221 aacaaaaagc aaagtatcaa cgacgaagtc aggaataaag tcactaccac caacgtcaac2281 agcggtctta atgtaattga aacagaaaat ggtttcttga atctaggaga gaatagtaag2341 aaaatccaca ttgacgaagc cacagcctat tttaaaccgg ccgccaaatt aaaaatggag2401 aaaaaaggta ttaagacgga taatttcaga ccaaaaacca atcaaggtga aataagagac2461 atgcccaaag gagaaactta ctatgaggtt gatcttaaag acgccgatct aagtcttcct2521 tctcctacta atcctactcc tgatacactt gtctcaaatg gaaaagacgt tgttgatgtt2581 gaagatgttt ctgccattgt aattaataaa ggtactttag tccagacacc atggaacgaa2641 tactctgaca tgattaagcc gaagtttaat ccgtatccaa atgaaggaga gaaaattaat2701 caaatcaaga aacttcaaaa actcatagcc gatgagaaga gaaaagacac attagaccga2761 attaaagtta acacaattac taatcctgac ggagaaaagc gaatgattgt taatacgcct2821 tatggtgttc aagaaatgtt cgaggaaact gaaggaatga aaagactttc tcatattgat2881 ccaaataaga acgtggctat tagtgaaact ccgactgatg ataacaaaga atctatttac2941 agcgccttta agaacgtttc accaaatgaa gcagtcggaa aattcattga agatactttt3001 aattctgcat actcatccgg tcaagctcag agatttgtaa atcccacaaa cgcctttact3061 ggtcaagaag atccaaagaa agccagactc atgactcaga agactattga tgttacagag3121 tattatatta atgacggtaa accatcttcg gctatcaaaa atcaactaat ccaaaattac3181 agagccttag ctgatagcct tggaatgacc gaagaagatt tcattcaatt cgctcgtaaa3241 attcctgatg attctttggc acaaatgatc tcttataatg aacaatcaga atcttcgagg3301 cccgcattag tcgatgctcc attctttaag acacttcagc cacttgcaaa tcaaacgtca3361 aagaccaaac ttaacgacat catcaaaata atcttcacac aaatttctaa agtaactggt3421 aaaaccaatt caaccacagg cacaacactc gagaagaaga tagttcctaa tctaaaggca3481 gtaagatctg accaagtcat tgcaggacca aatggaggaa cttcagcttt atcccaagcc3541 acagctccaa gaaccggttc tacagttttg agtaagcaaa tcacacgagg acttcccaga3601 gttccttcag gtacaggtac tagttatcca gtgagagatc ccaatggtat taatacaagt3661 gaagataatg aaagatataa agtcaatcct tataatccat attctaaatc tgatactagt3721 ggtcttgaag cacctggtgg tgaaatagta cataatggta caagaccaag tccttacgct3781 atagtaggag ttccaatagt cgcagcggtt acaacaccag tcatcagacc agcagtctta3841 agaacgcctc cagcagcaca atcgagttct agtgcacttc aaggaaatac agcacttact3901 ggagcaggaa caccaagagc cggagtagca ggatcaccag gagtaaatcc aggaccaact3961 ggtaaagcac ctgtctcacc ccctgcacca acatcaccag cttcatctcc tacagcctca4021 cctatagcac ctacagcttc acctatagca cctacaggag catcaatagg agcacctggt4081 tcacttggaa tcccatcatc accattgaag。
2、 一种家蚕微孢子虫极丝蛋白PTP3基因编码的蛋白质，其特征在于其序列如下: 1 MIYTLFVIYI SSTFCRIISR STVENGPPTV PFDEHQAKHV HVRVHGRHRH GNHHGGGQDV 61 HEVQKHHSHH HNGHNYGLEH GKFGNVTYTS GNHHGHHSHH GSHADGHHSQ YGSHADGHHV 121 NAQSDASAPL DVLPMKEVRS GDDPALERDL GIQQAMKAFR SSLPVSNKDT NSLLDKAEGI181LRSAPDGQLDAPVLDSYGNPTGQTYREAAEDAVGYKYPTA■EEFDSLVRSGVEPGRAK241QVADKIEETGFEHEKIKDAVRNEVARGTANRAVAELQDEIQRRKNATKVKERVKVEDELY301RQHTLPATGLFDEDVSVLKNMSQIVPPAKIVDYIRDSYDNSIEAGLPPAVARAQADRVGS361LITDF画LRSGESPETALSHLKDMSDRQSKVDQRRELLQNSSPEVLKILSDKDNLIKEA421LVKTARDPDCRDRYFDEASQ腿IL證EASFIHDTENNKHIRRPRKMAEDLMDKTNRDN481AELV歸YSHPVVAKDILKQGIANTERVAEKLADHLDAVKFAEKAQNPSAVSALKLLDER541KRQDELEKINKRNTENEQKMFKQILK,DAEVMQTEEKMAAANKARKILDEGRRAAEQV601LKAGGSTDEAAAV證A腿TARGLEQRESMIEEEIMKRFGGAGDPEKARKMAAHIAIAH661SG腿VGKTPEEVIKKEQEAQKKEILRNALYDDIGKEPIEIKSVIPEDRDEYSIDRSVIK721FPLKTFIDEEVSNVGEAYVKNKKQSINDEVRNKVTTTNVNSGLNVIETEN'GFLNLGENSK781KIHIDEATAYFKPAAKLKMEKKGIKTDNFRPKTNQGEIRDMPKGETYYEVDLKDADLSLP841SPTNPTPDTLVSNGKDVVDVEDVSAIVINKGTLVQTPWNEYSDMIKPKFNPYPNEGEKIN901QIKKLQKLIADEKRKDTLDRIK丽ITNPDGEKRMIVNTPYGVQEMFEET EGMKRLSHID961PNKNVAISETPTDDNKESIYSAFKNVSPNEAVGKFIEDTFNSAYSSGQAQ RFVNPTNAFT1021GQEDPKKARLMTQKTIDVTEYYINDGKPSSAI認QLIQNYRALADSLGMTEEDFIQFARK1081IPDDSLAQMISYNEQSESSRPALVDAPFFKTLQPLANQTSKTKLNDIIKIIFTQISKVTG1141KTNSTTGTTLEKKIVPNLKAVRSDQVIAGPNGGTSALSQATAPRTGSTVLSKQITRGLPR1201VPSGTGTSYPVRDPNGINTSEDNERYKVNPYNPYSKSDTSGLEAPGGEIVHNGTRPSPYA1261IVGVPIV膨TTPVIRPAVLRTPPAAQSSSSALQGNTALTGAGTPRAGVAGSPGVNPGPT1321GKAPVSPPAPTSPASSPTASPIAPTASPIAPTGASIGAPGSLGIPSSPLK
3、 PTP3基因在制备杀虫剂特别是杀蝗剂中的应用。
全文摘要
一种家蚕微孢子虫的繁殖和侵染有关的重要蛋白基因PTP3，依据家蚕微孢子虫的9倍基因组数据，得到编码家蚕微孢子虫极管蛋白PTP3基因序列CDS，并经一系列生物技术克隆证实。本发明所获得的极管蛋白PTP3对研究微孢子虫繁殖和侵染机制有其重要作用。从而对生产实践和微孢子虫病的防治发挥作用。RNAi干涉等试验分析表明，把极丝蛋白PTP3干涉到后，微孢子虫失去感染宿主的能力。所以微孢子虫的极丝蛋白PTP3和它潜在的调控基因将成为治疗微孢子虫感染新的因素。还可以通过转基因的手段，使之它高丰度的表达，从而杀害蝗虫等部分害虫。
文档编号C12N15/30GK101492683SQ200810233310
公开日2009年7月29日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者向仲怀, 周泽扬, 潘国庆, 许金山 申请人:西南大学