家蚕钠钾atp酶及其基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种家蚕钠钾ATP酶及其基因和应用，家蚕钠钾ATP酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或SEQ ID NO.8所示氨基酸序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸且来源于家蚕的具有钠钾ATP酶功能的酶，该酶具有四个钠、钾离子及ATP结合的保守的氨基酸位点，属于典型的P-type钠钾ATP酶，编码该酶的基因在家蚕五龄第3天的各个组织中均有表达，但钠钾ATP酶只在家蚕五龄三天的头部和表皮中有表达，经体外真核表达后发现钠钾ATP酶具有水解ATP酶活性，由于家蚕丝腺腔内金属离子交换是影响家蚕丝蛋白构象转换的重要影响因素，因此家蚕钠钾ATP酶功能研究对今后改良家蚕丝纤维具有重要的意义。
【专利说明】家蚕钠钾ATP酶及其基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及家蚕钠钾ATP酶，还涉及编码家蚕钠钾ATP酶 的基因和应用。
【背景技术】
[0002] 钠钾ATP酶（NKA)又叫钠钾泵，是由丹麦科学家J. C. Skou在1957年首次发现的 P-type ATP酶，它存在于大多数真核生物细胞中。细胞内外的钠离子浓度梯度可以维持细 胞的体积，而且可以通过Na+/H+和Na+/Ca 2+交换体维持细胞内的氢和钙离子浓度。此外，细 胞内钠离子梯度产生的静电势是很多细胞膜转运过程（例如葡萄糖，氨基酸和其他营养物 质向细胞内的转运）的驱动力，而NKA的主要功能就是维持细胞内的高钾和低钠的离子浓 度梯度。
[0003] 迄今为止，在脊椎动物细胞中共发现四个NKA的同位体，除了具有离子转运的功 能外，脊椎动物的NKA的a 1亚单位可与Src相互作用形成内源激素哇巴因（ouabain)的 受体，进而介导细胞下游信号通路来调控细胞的生长速度，特别是在胚胎发育，神经导向， 中枢神经系统发育等生理学过程中，发挥了重要作用。近年来许多非脊椎动物如果蝇、暗 蚊、线虫和水蛭等的钠钾ATP酶基因相继被克隆出来，经过同源比对发现它们与脊椎动物 的NKA同源性非常高，但对非脊椎动物NKA是否也可以与Src相互作用形成受体复合物的 研究未见报道。作为鳞翅目昆虫模式生物，家蚕的神经组织中存在NKA，但NKA基因在家蚕 体内是以何种形式存在及该基因表达酶的活性包括对家蚕生长发育等过程的影响均未被 研究，因此，对家蚕钠钾ATP酶（BmNKA)的全长基因进行克隆、表达和相关功能的研究将有 利于阐明NKA在参与无脊椎动物发育、信号传导等过程中所起的具体功能。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供家蚕钠钾ATP酶，本发明的目的之二在于 提供编码家香纳钟ATP酶的基因，本发明的目的之二在于提供含有上述基因的表达载体； 本发明的目的之四在于提供家蚕钠钾ATP酶的应用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1、家蚕钠钾ATP酶，所述家蚕钠钾ATP酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示或SEQ ID NO. 8所示氨基酸序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸且来源于家蚕的具有钠钾ATP 酶功能的酶。
[0007] 2、编码权利要求1所述家蚕钠钾ATP酶的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 7第172-3021位所示或SEQ ID NO. 7第172-3021位经取代、缺失或添加 至少一个碱基且来源于家蚕的编码具有钠钾ATP酶功能的核苷酸序列。
[0008] 优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0009] 3、含有所述基因的表达载体。
[0010] 优选的，所述表达载体由SEQ ID NO. 7第172-3201位所示核苷酸序列连入 pEYFP-Cl载体的BspEI和BamHI酶切位点处。
[0011] 4、权利要求1所述家蚕钠钾ATP酶在改良蚕丝纤维性能中的应用。
[0012] 本发明的有益效果在于：本发明公开了家蚕钠钾ATP酶和编码家蚕钠钾ATP酶 的基因，家蚕钠钾ATP酶具有四个钠、钾离子及ATP结合的保守的氨基酸位点，属于典型的 P-type钠钾ATP酶，组织表达谱分析发现家蚕钠钾ATP酶基因在五龄第3天的各个组织中 均有表达，而在蛋白水平钠钾ATP酶只在家蚕五龄三天的头部和表皮中有表达，将编码家 蚕钠钾ATP酶的基因构建重组表达载体在体外真核表达后具有水解ATP酶活性，建立单克 隆细胞系是后续钠钾ATP酶在信号传导功能研究良好的细胞模型，这为阐明家蚕钠钾ATP 酶参与家蚕发育、信号传导等过程具有重要意义，也为获得一种丝纤维性能改良的新型家 蚕品种具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0014] 图1为BmNKA基因的结构注释图。
[0015] 图2为BmNKA基因和BmNKA蛋白在5龄第3天家蚕雌雄幼虫中的组织表达特征 (A :BmNKA基因组织表达谱；B :BmNKA蛋白Western检测结果）。
[0016] 图3为建立的表达YFP-rata 1和YFP-Silkworma两个单克隆细胞系中外源大鼠 与家蚕钠钾ATP酶和内源钠钾ATP酶的Western定量检测结果（A和C表示外源钠钾ATP 酶表达结果；B和D表示内源钠钾ATP酶表达结果）。
[0017] 图4为稳定表达YFP-ratNKAa 1和YFP-SilkwormNKAa的两个单克隆细胞系中外 源钠钾ATP酶的细胞定位检测结果（A :稳定表达YFP-ratNKAa 1的单克隆细胞系；B :稳定 表达YFP-SilkwormNKA a的单克隆细胞系）。
[0018] 图5为家蚕和大鼠的钠钾ATP酶分别在PY17细胞系中瞬时转染表达后的酶活性 测定及Western定量检测。
[0019] 图6为转基因家蚕获得的结果图（A为构建过表达BmNKA基因的转基因载体示意 图，B为绿色波长的激发光下筛选转基因阳性个体，转基因阳性个体的蛹和蛾的眼分别在下 发出绿色荧光；C为以EGFP为探针的Southern blot杂交结果，泳道1是转家蚕钠钾ATP酶 基因的实验组，泳道2与3分别为阳性与阴性对照）。
[0020] 图7为利用红外光谱仪对转基因蚕与非转基因蚕的再生丝蛋白溶液蛋白二级结 构观察结果。
【具体实施方式】
[0021] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022] 以下实施例中使用的家蚕品种为大造，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。
[0023] 实施例1、家蚕钠钾ATP酶基因（BmNKA)mRNA全长序列的克隆
[0024] 从NCBI中（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)下载果蝇典型的钠钾ATP酶全长氨 基酸序列，将该序列在家蚕9倍基因组预测的蛋白质数据库（http://silkworm. swu. edu. cn/silksoft/blast2_simple· html)中进行同源比对，发现基因编号为BGIBMGA005058的 基因与果蝇的钠钾ATP酶具有最高的同源性，由于家蚕的钠钾ATP酶（BGIBMGA005058)基 因具有8条EST序列，利用软件DNAStar Lasergene对这8条EST序列进行拼接得到该基因 的部分正确的mRNA序列后，设计合成5'RACE的基因特异引物和巢氏基因特异引物。5'RACE 引物序列如下：
[0025] 5058-pl :5'-ttcgataatacggatgtcggcggga-3'（SEQ ID NO. 1);
[0026] 5058_p2 :5,-gaagataccagtaacgatcacgacg-3，（SEQ ID NO. 2);
[0027] 5058_p3 :5'-acggatgacggtggcgaattggggg-3'（SEQ ID NO. 3)。
[0028] 然后按照GeneRacerTM试剂盒（Invitrogen公司）说明书，扩增得到该基因 5'端 的非翻译区序列（SEQ ID NO. 4)，根据获得的5'端的非翻译区序列与拼接的EST序列设计 BmNKA基因的全长序列扩增引物，具体引物如下：上游引物序列为：（5' -cgtccggaatgggcga gacgcgcagaaaacctcccgc_3，）（SEQ ID N0.5);下游引物序列为：（5，_gcggatccttaataataag tctcttgttcgagcc-3'）（SEQ ID NO. 6)。
[0029] 以家蚕（大造）五龄3天的头部cDNA为模板，利用SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6 所示的引物进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒（上海华 舜生物技术有限公司）切胶回收纯化目的片段，再将所得目的片段克隆到载体PEasy-Tl simple (Transgen公司），并委托上海生工生物工程有限公司进行测序，结果SEQ ID NO. 7 所示。结果显示，BmNKA基因 mRNA全长共计3030个核苷酸，开放阅读框（ORF)为3030个 核苷酸，编码长为1009个氨基酸的BmNKA蛋白（SEQ ID NO. 8)，经信号肽预测发现在BmNKA 蛋白N端包含一个由22个氨基酸组成的信号肽序列，将获得的全长序列同家蚕基因组数据 库比对分析，发现BmNKA基因含15个外显子和14个内含子，如图1所示。
[0030] 将BmNKA基因开放阅读框（ORF)序列及预测的氨基酸序列在NCBI上进行BLAST 比对，根据比对结果分析BmNKA基因进化树。结果显示昆虫、鸟类和哺乳动物等典型的NKA 蛋白序列均具有很高的同源性，而且不同物种的钠钾ATP酶亚单位的α 1，α 2, α 3, α 4分 别聚为一支。但作为NKA酶家族进化的早期形式的昆虫和虫类的钠钾ATP酶仅具有一种亚 单位形式。然后根据比对BmNKA，果蝇NKA α，线虫NKA α，人NKA α 1，鼠 NKA α 1，鼠 NKA α 2 和鼠 NKA α 3的氨基酸序列。结果显示，BmNKA基因含有NKA基因的典型结构，表明BmNKA基 因属于典型的P-type钠钾ATP酶。
[0031] 实施例2、BmNKA基因组织表达谱
[0032] 根据BmNKA基因全长序列设计特异引物，具体如下：上游引物序 列（FP) :5' -gacaggaatggacctaccg-3'（SEQ ID N0·9);下游引物序列（RP): 5'-gcctgatctcgtcgtagat_3'（SEQ ID N0.10)。同时设计内参基因家蚕肌动蛋白基因 Actin3 的特异引物，具体如下：上游引物为（A3-F:5'-aacaccccgtcctgctcactg_3'）（SEQ ID N0·ll)，下游引物为：（A3-R:5'-gggcgagacgtgtgatttcct-3'）（SEQIDN0·12)。分别取家 蚕5龄第3天雌雄幼虫的各组织（1.生殖腺；2.头；3.表皮；4.中肠；5.脂肪体；6.马氏 管；7.血细胞；8.前部丝腺；9.中部丝腺；10.后部丝腺；11.阴性对照）材料，取一部分 组织材料分别采用TRIzol试剂（Invitrogen公司）提取总RNA，利用M-MLV反转录试剂盒 (Invitrogen 公司）合成 cDNA 第一链，再用 SEQ ID NO. 8 和 SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID NO. 11所示的引物对进行PCR，PCR扩增条件为：95°C预变性10分钟，95°C变性40 秒、55°C退火30秒、72°C延伸90秒，共25个循环，最后72°C终延伸10分钟，将PCR产物用 琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图2 (A)所示。结果显示，在mRNA水平，5龄第3天的家蚕 各个组织都有BmNKA基因的表达。然后将各组织的剩余材料用于Western杂交以在蛋白水 平检测BmNKA酶在各组织的表达情况（与家蚕钠钾ATP酶杂交的LEAVE抗体由美国德克萨 斯大学医学院生理学与细胞生物学实验室馈赠），结果如图2 (B)所示。结果显示，在蛋白水 平BmNKA酶只在家蚕五龄三天的头部和表皮中有表达。
[0033] 实施例3、单克隆细胞系的建立过程如下
[0034] 根据BmNKA基因 mRNA全长序列设计扩增BmNKA基因开放阅读框（ORF)的引物， 具体如下：上游引物序列（FW) ：5' -cgtcc￡gaatgggcgagacgcgcagaaaacctcccgc-3' (SEQ ID NO. 13)，下划线为 BspEI 酶切位点；下游引物序列（RW) :5' -gcggatccttaataataagtctcttg ttcgagcc-3'（SEQ ID NO. 14)，下划线为BamHI酶切位点；然后以家蚕五龄3天的头部cDNA 为模板进行PCR扩增，经BspEI和BamHI酶切后连入pEYFP-Cl载体的（pEYFP-Cl载体同样 也经过BspEI和BamHI进行双酶切），获得重组表达质粒，命名为BmNKA-pEYFP。
[0035] 同时克隆大鼠的钠钾ATP酶基因（基因编号GI :55771)，将其连接入pEYFP-Cl载 体，获得含有大鼠钠钾ATP酶的pEYFP-Cl载体RatNKA-pEYFP，作为阳性对照。
[0036] 将LLC-PKl (猪肾表皮细胞系）细胞在6孔板进行培养，待细胞生长到80%左右分 别用重组表达质粒BmNKA-pEYFP和RatNKA-pEYFP转染，细胞转染过程参照invitrogen公 司的Lipofectamine2000转染试剂盒说明；之后给细胞换成不含FBS和抗生素的培养基，24 小时后换成含FBS和抗生素 G418 (500 μ g/mL)的培养基培养5天，筛选仅表达家蚕和大鼠 NKA酶的细胞群落，继续在含有抗生素 G418 (500 μ g/mL)的培养基中扩大培养3-5天，再将 扩大培养的混合的细胞群落用胰酶消化下来后转移到含有新的培养基的24孔板继续扩大 培养一周，最后把这些细胞消化下来后移种入96孔板，确保每个孔内仅含有一个细胞，扩 大培养后筛选两个单克隆细胞系（YFP-rat a 1和YFP-Silkworma )进行Western杂交分别 检测家蚕和大鼠 NKA蛋白（一抗购自FISHER公司，CAT#05369MI)在单克隆细胞系表达的 正确性。利用YFP抗体检测外源大鼠与家蚕钠钾ATP酶基因在猪肾表皮细胞系（LLC-PKl) 中的表达，Western杂交结果如图3 (A与C)所示。结果显示，两个外源钠钾ATP酶基因 BmNKA-pEYFP和RatNKA-pEYFP质粒都能够在LLC-PKl细胞中特异表达，但大鼠比家蚕的钠 钾ATP酶基因表达量要高的多。同时以转染E-YFP质粒的LLC-PKl细胞系为阴性对照，利 用YFP抗体未检测到外源大鼠和家蚕钠钾ATP酶基因在转染E-YFP质粒在LLC-PKl细胞系 中表达量。
[0037] 为检测新建立的YFP-rat a 1和YFP-Silkworma两个单克隆细胞系中内源性猪钠 钾ATP酶（GI: 164381)的表达量，利用通用的商品化哺乳动物的钠钾ATP酶抗体a 6F与两 个单克隆细胞系进行杂交，Western杂交结果如图3的B与D所示。结果显示，在YFP-rat a 1 单克隆细胞系中大鼠与猪的钠钾ATP酶基因均可以在大鼠的单克隆细胞系中表达，而在 YFP-Silkworma单克隆细胞系中内源性piga 1表达量比YFP-rat a 1细胞系中ATP酶表达 量要高得多。
[0038] 四.BmNKA的细胞定位与酶活性测定
[0039] I、BmNKA细胞定位流程
[0040] 将灭菌后的玻璃切片轻放于6孔板，将YFP-rat a 1和YFP-Silkworma两个细胞 系分别培养于玻璃切片上，待贴壁生长至细胞密度达到80%左右后直接利用荧光共聚焦显 微镜观察，如图4所示。结果显示，连接有YFP标签的大鼠钠钾ATP酶α?亚单位基本都定 位在细胞膜上，而家蚕钠钾ATP酶大部分都在细胞质中，但仍有少部分定位在细胞的膜上。
[0041] 2、BmNKA酶活测定步骤
[0042] (1)制备ΡΥ17细胞系：ΡΥ17细胞系是通过瞬时转染A4siRNA表达载体 (?5即?^ 8〇1^4以1?嫩）到猪肾表皮细胞系（1^(：-?1(1)24小时后利用浓度11^/1^嘌呤霉 素（puromycin)进行筛选，其中内源性的猪钠钾ATP酶基因被设计的SiRNA靶标序列干涉 掉，最后获得了仅含有维持细胞生命必需的7. 5 %左右内源性猪钠钾ATP酶的PY17细胞 系，PY17细胞系可作为下一步测量钠钾ATP酶活性的生物模型（具体方法参见：Man Liang et al. Functional Characterization of Src-interacting Na/K-ATPase Using RNA Interference Assay. JBC. 2006. 281(28)。
[0043] PY17细胞系培养至细胞密度达到80-90 %后，瞬时转染YFP-rat a I与 YFP-silkworma两个质粒到PY17细胞系，每类细胞传代三盘到IOcm的盘中，生长到90% 左右后用 buffer A(BufferA 为 pH7. 4 终浓度为 30mM 组氨酸，250mM 蔗糖，lmMEDTANa2*2H20 的混合溶液）溶液收集；勻楽搅拌15次后超声处理；800g离心IOmin后收集沉淀；再 在4°C，45000g高速离心45min获得细胞膜沉淀；接着在IOOg速度条件下离心IOmin,用 buffer A溶解后测定蛋白浓度，并用buffer A稀释到蛋白浓度为1?2mg/mL，得待测样品； 每个样品准备6个管子，其中3个管子加入哇巴因至终浓度为ImM，另3个管子加入等体积 的水，每管加入含5?10μ g蛋白的待测样品；然后加入丙甲菌素（alamethicin)，加入量 按每10 μ g蛋白加入1 μ L丙甲菌素，然后于室温下静置10min。
[0044] 准备如表1所示的反应混合体系：
[0045] 表1、反应混合体系
[0046]
【权利要求】
1. 家蚕钠钾ATP酶，其特征在于：所述家蚕钠钾ATP酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所 示或SEQ ID NO. 8所示氨基酸序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸且来源于家蚕的具 有钠钾ATP酶功能的酶。
2. 编码权利要求1所述家蚕钠钾ATP酶的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列 如SEQ ID NO. 7第172-3201位所示或SEQ ID NO. 7第172-3201位经取代、缺失或添加至 少一个碱基且来源于家蚕的编码具有钠钾ATP酶功能的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所 /Jn〇
4. 含有权利要求2或3所述基因的表达载体。
5. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体由SEQ ID NO. 7第 172-3201位所示核苷酸序列连入pEYFP-Cl载体的BspEI和BamHI酶切位点处。
6. 权利要求1所述家蚕钠钾ATP酶在改良蚕丝纤维性能中的应用。
【文档编号】C12N15/85GK104312993SQ201410555339
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】赵萍, 衣启营, 王鑫, 夏庆友, 宋倩茹 申请人:西南大学