专利名称：家蚕蜕皮激素氧化酶eo基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体是一种来自家蚕的具有氧化昆虫体内蜕皮激素活性的蜕皮激素氧化酶基因。
背景技术：
昆虫的变态发育主要是由前胸腺合成分泌的蜕皮激素(Molting hormone, ΜΗ) 和咽侧体合成分泌的保幼激素(Juvenile hormone, JH)协同控制的。蜕皮激素的主要作用是引发昆虫在不同的发育阶段有规律地蜕皮，从而决定昆虫幼虫虫体的大小和形态的变化，对于完全变态昆虫来说，在其幼虫的最后一个龄期，幼虫停止分泌保幼激素，在高浓度的蜕皮激素作用下，幼虫完成向蛹的转变，开始昆虫的变态发育。从这可以看出，蜕皮激素在不同的发育时期的滴度是有规律变化的。蜕皮激素的滴度变化对昆虫的发育起着十分重要的作用。昆虫消减体内蜕皮激素浓度主要有两种方式，一是通过排泄排出体外，另外是通过将蜕皮激素转化为非活化形式从而降低体内蜕皮激素的浓度。目前研究证明，有很多转化途径能使蜕皮激素失活(Rees 1995)，例如形成非活性的3位差向异构化蜕皮激素 (3-epiecdysone)。先前研究认为这一失活途径在鳞翅目昆虫中尤为重要。昆虫中蜕皮激素的3位差向异构化途径主要经过两步蜕皮激素在蜕皮激素氧化酶(Ecdysone Oxidase, E0)的作用下合成3位脱氢蜕皮激素，3位脱氢蜕皮激素进一步在 3 位脱Si兑皮激素 α 还原(3dehydro-ecdysone-3 α -reductase, 3DE-3 α -reductase) 的作用下形成非活性形式3位差向异构化蜕皮激素，从而使蜕皮激素活性丧失。其中蜕皮激素氧化酶(EO)是该途径的限速酶。因此，研究EO对于理解昆虫蜕皮激素的周期性变化起着重要作用。目前为止，蜕皮激素氧化酶的生理、生化性质已经在很多昆虫中有研究。但是，编码该酶的基因的研究却很少。家蚕是重要的经济型昆虫，也是鳞翅目昆虫的模式代表，但是被确认为家蚕蜕皮激素氧化酶基因的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于利用生物信息学、生物工程等方法在家蚕中克隆并鉴定蜕皮激素氧化酶基因。将该基因导入真核表达系统中，经诱导使其表达。酶活性测定证实其具有蜕皮激素氧化酶的活性。最后利用转基因手段将该基因转入家蚕体内，通过特异性启动子使目的基因特异地高量表达，从而降低虫体内蜕皮激素的滴度，进而人为地调节家蚕的生
长发育。本发明申请人利用生物信息学方法在家蚕基因组中鉴定了一个蜕皮激素氧化酶基因。利用家蚕5龄3天总cDNA为模板，设计了一对特异的蜕皮激素氧化酶EO引物，然后进行克隆，得到了一段序列。测序验证为目的序列。然后将该基因连接在表达载体PPIC9K 上。并经诱导表达，证实了酶活性，为下一步将该基因导入家蚕中奠定了物质基础。本发明的家蚕蜕皮激素氧化酶万0基因通过以下步骤得到(1)首先以NCBI上已报道的鳞翅目昆虫海灰翅夜蛾〈Spodopteralittoral is)中蜕皮激素氧化酶基因(S1E0登录号为AY035784)为问询序列，用Blast程序在家蚕表达数据库 (EST)和基因组数据库搜寻家蚕的同源基因。通过信息分析，最终得到一条匹配度最高的基因。该基因的核苷酸序列长2007 bp，有5个外显子，位于家蚕第17号染色体上。该基因编码一个含668个氨基酸的蛋白质，具有典型的葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶基因家族结构域，该序列与海灰翅夜蛾的SlEO相似性达到56%，并且该蛋白质具有保守的蜕皮激素结合位点(Leu96，Met346, Ala446, Thr533和Trp536)。因此，该基因为家蚕蜕皮激素氧化酶的候选基因。基于候选基因的核苷酸序列设计特异性引物，上游为5’ GAATTCATGGTTTGCGGGTTG 3’，下游为5’ GCGGCCGCTCATGCGACATTGAC 3’ ；划线部分为酶切位点，其中上游引物的酶切位点为SnaB I，下游引物的酶切位点为Not I ；
(2)提取家蚕5龄3天幼虫的全蚕RNA，然后将其反转成cDNA，并以其为模板，用设计的特异性引物进行扩增，获得目的条带，PCR产物回收后与PMD-19-T载体连接转化入大肠杆菌Dffia感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物工程公司测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致；
(3)将含有目的片段的T克隆与酵母表达载体pPIC9K分别用SnaBI和Not I进行双酶切，分别回收目的片段，电泳检测后，用DNA连接酶将其连接，并转化大肠杆菌Dffia感受态细胞，筛选获得含有pPIC9K-BmE0重组质粒的克隆，然后将扩大培养的菌液送往上海生工生物工程公司测序，测序结果与第一次测得的序列一致，获得正确的克隆；
(4)提取重组质粒pPIC9K-BmE0将其进行线性化和去磷酸化，然后用电击转化的方法转入酵母感受态细胞O0ZcAia pas tor is X_33)，再涂于MD板上培养两天，挑取单菌落，之后点种于含G418的YPD板上进行阳性克隆的筛选，再进行PCR验证确认其BmEO基因已导入酵母菌中，再置于BMMY中培养，添加甲醇以诱导BmEO的表达，取上清液进行蜕皮激素氧化酶酶活性的测定；
(5)对蜕皮激素氧化酶的酶活性进行测定。 通过上述方法获得家蚕蜕皮激素氧化酶万0基因，其完整的CDS及推断的氨基酸序列如下
ATGGTTTGCGGGTTGACTTCGTGTCTTGGG AGTGGCGCGGCCGGCGGCCTATTCTCATCCGCCGTTCAGTTCTTCMVCGLTSCLGSGAAGGLFSSAVQFFGCGGCGACGCAGTGCCTGGTCGGGGM ACTTGGCCA AAAGATTCTGTGCTGCAA MTGGCTCTAGATACGACTTCAATQCLVGETWPKDSVLQNGSRYDFATCATCGTGGGTGCCGGTACCGCTGGCTCTGCGCTCGCCGCC AGACTCTCCGAGGTTGCCAACTTCAGCGTACTCIIVGAGTAGSALAARLSEVANFSVLCTACTGGAGGCGGGCGGAGATCCACCG ΑΤΑGAGGCTATTATACCAGCGTTC AGAGAAACTCTAAAAGCALLETLKAGTCGATTGGGGAATAGAGCAAVDWGIEQCGAGGGAAGTTTCCTTCAGACRGKFPSDGMTGGGCCATGAAAACCGAGEWAMKTEACGGATACGGCTATAGAAGTTTDTAIEVACGAATGMTTCAAGACAGTTTNEFKTVATGACTTACGAACGCGACAGCMTYERDSAGGGCTCTCGTAACGAAGATTRALVTKIGAGMCGGATACGCTGATCGTENGYADRATTTTATCACGCTCAGAGCACILSRSEH
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昆虫正常变态发育要求高量的蜕皮激素，如果能在家蚕的蛹期有效地降低蛹体内的蜕皮激素浓度就有可能阻断家蚕的变态发育进程，从而使其永远停留在蛹期，称为“永久蛹”。 蚕业生产上为了获得蚕丝，收茧后必须及时烘茧以杀死蚕蛹，否则，蚕蛹发育成成虫一蛾子就会咬破蚕茧出壳，破坏蚕丝的完整度。因此，“永久蛹”在蚕业生产上有巨大的经济和生态效益价值。本发明获得的蜕皮激素氧化酶万0基因，其表达产物能有效地催化作用于蜕皮激素，使得蜕皮激素的活性降低，可以有效地降低昆虫体内蜕皮激素的滴度。将万0基因利用转基因技术导入家蚕体内，使其在蛹期高量表达，从而调节蜕皮激素的滴度，进而人为地控制家蚕的发育。
具体实施例方式实施例1
家蚕蜕皮激素氧化酶基因的生物信息学鉴定
首先以NCBI上已报道的鳞翅目昆虫海灰翅夜蛾〈Spodoptera littoral is)中蜕皮激素氧化酶基因(S1E0登录号为AY035784)为问询序列，用Blast程序在家蚕表达数据库 (EST)和基因组数据库搜寻家蚕的同源基因。通过生物信息学分析，最终得到一条匹配度最高的基因。该基因编码的蛋白质序列与海灰翅夜蛾的SlEO相似性达到56%，并且该蛋白质具有保守的蜕皮激素结合位点(Leu96，Met346, Ala446, Thr533和Trp536)。因此，该基因为家蚕蜕皮激素氧化酶的候选基因。实施例2
家蚕蜕皮激素氧化酶基因的克隆
基于候选基因的核苷酸序列设计特异性引物，上游为5’ GAATTCATGGTTTGCGGGTTG 3’，下游为5’ GCGGCCGCTCATGCGACATTGAC 3’ ；划线部分为酶切位点，其中上游引物的酶切位点为SnaB I，下游引物的酶切位点为Not I。提取家蚕5龄3天的全蚕RNA，用MLV反转
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7录酶(promega公司生产)将其反转成cDNA，然后以其为模板，用设计的特异性引物进行扩增，获得目的条带，PCR产物回收后与PMD19-T载体连接转化入大肠杆菌Dffia感受态细胞， 获得阳性克隆后送往上海生工生物工程公司测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致。 实施例3:
家蚕蜕皮激素氧化酶基因的真核表达及酶活测定
将含有目的片段的τ克隆与PPIC9K空质粒分别用SnaB I和Not I进行双酶切，分别回收目的片段，以solution I连接酶将其连接并转化大肠杆菌Dffia感受态细胞，筛选获得含有pPIC9K-BmE0的克隆，然后将扩大培养的菌液送往上海生工生物工程公司测序，测序结果与第一次测得的序列一致，获得正确的克隆；提取质粒PPIC9K-E0将其进行线性化和去磷酸化处理，然后用电击转化的方法转入毕赤酵母感受态中，再涂于MD板上培养两天， 挑取最先长的单菌落，之后点种于含G418的YPD板上进行阳性克隆的筛选，再进行PCR验证确认其BmEO基因已导入酵母菌中，然后置于BMMY中培养，添加甲醇以诱导BmEO基因的表达。利用饱和硫酸铵法沉淀表达上清液中的蛋白，用Tris-Hcl缓冲液溶解蛋白，过夜透析。然后取溶解液加入蜕皮激素进行酶促反应，反应产物用高效液相色谱(HPLC)检测。结果表明除了蜕皮激素的色谱峰以外，还有一个多出的色谱峰，根据3位脱氢蜕皮激素标准品的出峰时间，鉴定结果多出的色谱峰即为3位脱氢蜕皮激素，进而证实了该酶具有蜕皮激素氧化酶活性。
权利要求
1.家蚕蜕皮激素氧化酶EO基因，其特征在于具有如说明书序列表所示的核苷酸序列。
2.家蚕蜕皮激素氧化酶EO基因编码的蛋白质，其特征在于具有如说明书序列表所示的氨基酸序列。
全文摘要
一种来自家蚕的具有氧化昆虫体内蜕皮激素活性的蜕皮激素氧化酶EO基因，利用生物信息学、生物工程等方法在家蚕中克隆得到。其表达产物能有效地催化作用于蜕皮激素，使得蜕皮激素的活性降低，可以有效地降低昆虫体内蜕皮激素的滴度。将EO基因利用转基因技术导入家蚕体内，使其在蛹期高量表达，从而调节蜕皮激素的滴度，进而人为地控制家蚕的发育。
文档编号C12N15/10GK102250930SQ201110199448
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者向仲怀, 孙伟, 张泽, 沈以红 申请人:西南大学