专利名称：一种用于烟丝处理的短小芽孢杆菌制剂的制作方法
技术领域：
本发明属于烟用添加剂的技术领域，更具体地说，本发明涉及一种微生物制剂。同时还涉及所述微生物制剂的制备方法及其在烟草工业中的应用。
背景技术：
烟草是我国财政的重要支柱之一。国家烟草专卖局在“十一五”中国卷烟科技发展纲要第7条明确指出，要“攻克影响烟叶香气质、香气量的关键技术”，缩小与国外烟叶质量差距，以提高国内外市场竞争力。烟草中的主要成分为碳水化合物和含氮化合物。前者主要包括糖类、淀粉和纤维素、木质素、半纤维素、果胶等细胞壁成分，后者主要包括烟碱、蛋白质等，这类大分子物质对烟草内在品质及风味均有不利影响。微生物通过生长繁殖，可以产生许多具有生物活性的酶类，加速大分子底物的降解和某些有害物质的分解，并通过特定微生物的吸收、利用、 转化形成一系列有益小分子化合物，使烟草成分发生改变，最终导致烟草品质的改变。目前在国内外已有较多将生物技术应用于卷烟工业的研究报道。RayF. Dawson的研究表明，嗜热性放线菌属可使陈化烟叶产生一种令人感兴趣的香气，尤其是水果香气和酿香等。Reid等研究表明，烟叶中的芽孢杆菌、嗜热细菌和小球菌对烟叶的香气和品质是有益和必要的。Koller最早进行了将微生物接种烟叶以增加烟叶香气、改善烟叶吸味品质的尝试，之后科研工作者开始了微生物接种烟叶的研究并取得了大量成果。Izquierdo Tamayoa等人研究发现，用微生物接种的烟叶，香气和性状均得到改善，尤其是当采用微球菌属或杆菌属或两者的混合物接种烟叶时，效果更为显著。我国直到20世纪90年代才开展烟叶香气物质化学成分分析的研究，关于烟叶诱香微生物研究还处于探索阶段。谢和等研究表明，将烟叶表面的芽孢杆菌接种到烤烟烟叶上，可明显提高烟叶香气，改善烟叶品质。 陈福星等研究鉴定了烤烟叶面的优势菌种，并表明用优势菌种处理烟叶可缩短发酵时间并改善烟叶质量。迄今为止，关于微生物在卷烟工业中应用的研究多集中于利用烟叶自身或某些环境微生物的特定作用来减少烟叶刺激、降低烟碱含量或改善理化品质，试图达到加速烟草陈化的目的，而应用微生物制剂直接处理烟丝以提高卷烟抽吸品质的报道却很少。经文献检索，尚未发现与本发明内容相同的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有烟丝处理技术的不足，提供一种新的微生物制剂。本发明的另一目的是提供所述微生物制剂的制备方法。本发明进一步的目的是提供所述微生物制剂在烟丝处理中的应用。本发明的目的通过下述技术方案予以实现。*除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。A.本发明提供了一种新的微生物制剂，该微生物制剂是采用下述方法制备获得取从烤烟叶面上分离得到细菌Van35的液体菌种，按照0. 1 %的接种量接种于200ml的LB 液体培养基中，在37 °C摇床，转速180r/min振荡培养至OD值=2. 0 ;3500rpm/min离心 lOmin，用无菌水洗涤沉淀，离心，最后用20mL无菌水振荡均勻，使用时稀释10倍即为所需的微生物制剂；其中，所述的细菌Van35的液体菌种，经鉴定属于短小芽孢杆菌，该菌株命名为 Bacillus pumilus。B.本发明提供了一种所述微生物制剂的制备方法，该方法采用下述步骤(1)烤烟叶面上分离得到细菌Van35的液体菌种；(2)取液体菌种，按照0. 1 %的接种量接种于200ml的LB液体培养基中；(3)在 37 "C 摇床，转速 180r/min 振荡培养至 OD 值=2. O ； 3500rpm/min 离心 IOmin ；(4)用无菌水洗涤沉淀，离心，最后用20mL无菌水振荡均勻，使用时稀释10倍即为所需菌剂。C.本发明提供了所述微生物制剂在烟丝处理中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点(1)本发明提供的微生物制剂能明显提高烟丝的香气量、愉悦性等品质，杂气、刺激性等下降，烟气浓度和劲头减少，余味变得舒适。(2)本发明成本低、可控性强、操作简单，便于实现大规模工业化生产，具有良好的开发应用前景。保藏生物材料的说明本发明涉及的短小芽孢杆菌Van35的菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期2009 年11月5日；保藏号为CGMCC No. 3411。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。实施例1——试管斜面培养采用Luria-Bertani(LB)培养基，配方为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物 5g，琼脂20g，蒸馏水定容到1000ml。121°C灭菌25分钟，摆成斜面。接种Van35，28°C培养 Mh，获得试管种。实施例2——种子培养采用Luria-Bertani(LB)培养基，配方为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物 5g，蒸馏水定容到1000ml。121°C灭菌25分钟。接种Van35试管种，培养12h，获得液体菌种。实施例3——制备微生物制剂
取液体菌种，按照0. 1 %的接种量接种于200ml的LB液体培养基中，在37°C摇床， 转速180r/min振荡培养至OD值=2. 0。3500rpm/min离心lOmin，用无菌水洗涤沉淀，离心，然后用20mL无菌水振荡均勻，使用时稀释10倍即为菌剂。应用实施例——微生物制剂对烟丝的作用用制备好的微生物制剂对烟丝进行处理，具体实验步骤如下1)称取含水率在11% -13%的烟丝100g。2)取菌剂20ml，用小型喷雾器将其均勻地喷洒到IOOg烟丝上，密封，以防止水分蒸发。3)直接喷洒等量的无菌水作为对照。4)将样品封入密封袋，以防止水分蒸发，30°C恒温乩。5)将烟丝置于120°C烘箱中烘干，使含水率达到11^-13 ^
6)将烟丝于22°C相对湿度为60 %的恒温恒湿箱平衡48h。7)取出部分烟丝，检测主要化学成分含量和致香物质。8)将剩余的烟丝手工卷制成烟支，样品和对照随机编号，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。常规化学成分的检测结果表明经所述的微生物制剂处理后，烟丝的生物大分子化合物的含量发生了较大的改变，其中还原糖和总糖的含量发生了明显的提高，总氮、纤维素和烟碱的含量发生了下降，挥发碱和石油醚提取物总量有所下降，这些化合物的含量的变化有利于烟叶的吸食品质。致香成分检测结果表明经微生物制剂处理后，烟丝的致香成分，包括糠醇、香兰素、二氢猕猴桃内酯、苯甲醇、茄酮、巨豆三烯酮、大马酮、西柏三烯二醇和新植二烯等的含量较对照显著提高。感官评吸结果表明烟丝经微生物制剂处理后，香气量、愉悦性较对照显著提升， 杂气、刺激性等下降，烟气浓度和劲头减少，余味变得舒适。试验结果表明该发明的微生物制剂具有明显促进烟丝化学成分变化，从而降低烟丝刺激性、细腻醇和烟气，能够达到提高烟丝抽吸品质的目的。
权利要求
1.一种微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂是采用下述方法制备获得取从烤烟叶面上分离得到细菌Van35的液体菌种为原料，按照0. 的接种量接种于200ml的LB液体培养基中，在37°C摇床，转速180r/min振荡培养至OD值=2. 0 ；3500rpm/min离心lOmin， 用无菌水洗涤沉淀，离心，然后用20mL无菌水振荡均勻，使用时稀释10倍即为所需的微生物制剂；其中，所述的细菌Van35的液体菌种，经鉴定属于短小芽孢杆菌，该菌株命名为 Bacillus pumilus。
2.—种权利要求1所述的微生物制剂的制备方法，该方法采用下述步骤(1)烤烟叶面上分离得到细菌Van35的液体菌种；(2)取液体菌种，按照0.的接种量接种于200ml的LB液体培养基中；(3)在37°C摇床，转速 180r/min 振荡培养至 OD 值=2. O ；3500rpm/min 离心 IOmin ；(4)用无菌水洗涤沉淀，离心，最后用20mL无菌水振荡均勻，使用时稀释10倍即为所需菌剂。
3.—种权利要求1所述的微生物制剂在烟丝处理中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种烟用微生物制剂及其制备方法和应用，属于烟用添加剂的技术领域。本发明由生产菌株液体发酵培养后得到相应的微生物制剂。所述的生产菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus.Van35)，该菌株已于2009年11月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3411。本发明的微生物制剂，能够明显提高烟丝的香气量、愉悦性等品质，杂气、刺激性等下降，烟气浓度和劲头减少，余味变得舒适，从而达到提高烟丝抽吸品质的目的。
文档编号C12N1/20GK102286403SQ201110199380
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月17日 优先权日2011年7月17日
发明者何华, 叶灵, 李先毅, 李庆华, 杨丽萍, 段焰青, 王文元, 蒋举兴, 陈兴 申请人:红云红河烟草(集团)有限责任公司