专利名称：家蚕BmSpry基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因领域，特别是涉及家蚕的控制家蚕对核型多角体病毒 (BmNPV)抗性的关键基因。
背景技术：
蚕桑生产是丝绸工业的基础，在我国很多农村地区，养蚕业是当地经济的支柱性产业和农民的主要经济收入来源，蚕丝业每年为蚕农创收上百亿元。核型多角体病毒病是蚕业生产上最常见而且危害最严重的一类蚕病，引起该病的病原为核型多角体病毒 (BmNPV)，该病的传染力极强并且难以控制，全国各蚕业主产区经常因为该病的爆发而造成严重的经济损失。由于BmNPV在蚕业生产上危害严重，科研工作者对它的病原特性、感染性和抵抗性作了持续深入的研究。目前的研究结果显示不同的家蚕品种对BmNPV的抵抗性不一样， 家蚕对BmNPV的抵抗性是由多基因控制的，其中至少有一个是主效基因。对家蚕抗性关键基因及其调控序列进行克隆和鉴定，为阐明家蚕抵抗BmNPV的机制，以及培育抗性品种应用于蚕业生产有着重要的理论价值和实践意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一段核苷酸序列及其制备方法，该序列为家蚕调控核型多角体病毒抗性的关键基因。为实现上述目的，本发明的技术方案为
家蚕BmSpry基因，所述家蚕BmSpry基因的核苷酸序列含有如SEQ ID NO 1所示。进一步，所述家蚕汝基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。所述的家蚕汝基因的制备方法，以家蚕大造品种全蚕或者组织cDNA为模板进行PCR扩增，设计的上游引物为F 5' - cggtcgtttcgttggagc-3’，设计的下游引物为R 5，- atttgcgtagaatccaaaatactaac-3，，PCR 反应条件为94°C预变性 4 分钟，然后 94°C变性 40秒、58 °C退火40秒、72 °C延伸1分钟，共30个循环，最后72°C延伸10分钟，得如SEQ ID NO 2所示的家蚕BmSpry基因。本发明的目的之二在于提供家蚕基因的应用，该应用为调控家蚕核型多角体病毒抗性提供了新方法。为实现上述目的，本发明的技术方案为
所述的家蚕基因在调节家蚕型多角体病毒抗性中的应用。本发明的有益效果在于通过对转基因家蚕敏感系统LI-S进行检测，克隆得到了一个家蚕抗性关键基因彻分iT全长序列，包括213bp的5’非翻译区序列(5’Untranslated region，5，UTR)、642bp 编码区序列(Coding sequence，CDS)和 332 bp 的 3，非翻译区序列 (3’UTR)。彻分^基因表达量降低一半导致家蚕对BmNPV的抵抗性降低了 100倍，本发明克隆和鉴定了一个影响家蚕对BmNPV抗性的关键基因。汝基因在培育家蚕抗BmNPV品种的理论研究和生产应用中都具有重要的价值。
图1为LI-S和正常大造添食不同浓度BmNPV以后的死亡率统计结果。图2为LI-S外源片段在家蚕基因组和染色体上的插入位点分析。图3为RT-PCR检测正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry的表达量。图4为定量PCR检测正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry的表达量。图5为插入位点附近其他基因RT-PCR检测结果。图6为BmSpry基因的结构示意图(上)和全长序列及对应的氨基酸序列(下)。
具体实施例方式实施例1转基因家蚕LI-S和LI-A的构建
一构建转基因增量表达载体pBac[IElP- lipase-l-3XP3-EGFPafm] 1用幻招/和/双酶切载体pBSII-IEl-orf，回收获得IEl启动子片段，并把其连入 L4440 载体，用 SV40 引物(SV40 F: 5 ‘-tgctctagaagatcataatcagccata-3，，SV40 R: 5 '-ggaagatctgcagtgaaaaaaatgctt-S' )hk piggyBac [3Xp3 EGFP afm]中扩增出 SV40 终止信号，由于引物两端分别加有损a /和勒#酶切位点，以此两个酶双酶切把SV40加入已经带有IEl启动子的L4440载体，这样重组载体L4440-IE1P-SV40中既包含IEl启动子序列，又含有SV40终止信号。2 用 Bmlipase-1 弓丨物(Lipase-1 F: 5 '-ccggaattcatgcctgatggcgagggtgt- 3，， Lipase-I R: 5 '-ctagtctagattagaaaggccaactgctgcc-S') ^C H Φ J cDNA Φ Γ ±1 Bmlipase-I的CDS序列(如SEQ ID NO:3所示)，TA克隆连入pMD19_T simple载体，进行 PCR和酶切检测确定无误，并送由上海生物工程有限公司测序做进一步验证。3用损a /和分别双酶切L4440-IE1P-SV40和Bmlipase-1 T克隆质粒，连接重组后，得到含有增量表达骨架结构(包含启动子、表达基因序列和终止信号)的L4440-IElP- Bmlipase-l-SV40 重组载体。4 用 ^7/7 / 和 II 分别酶切 pSLfall80fa 载体禾Π L4440- IElP-Bmlipase-l-SV40 重组载体，连接重组后，得 1180- IElP- Bmlipase-l_SV40 重组载体。5用限制性内切酶Asc I分别酶切1180- IElP- Bmlipase-l_SV40及 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]质粒。由于pSLfall80fa载体骨架在多克隆位点两端都含有一个Asc /位点，切下的增量表达骨架结构便可与经Asc /酶切后5’端去磷酸化的piggyBac 3Xp3 EGFP afm线性片段连接，形成最终的转基因增量表达载体pBac[IElP-Bmlipase-l-s v40-3XP3-EGFPafm]。上述实验的完成参见了西南大学陈杰的《增量表达抗病毒蛋白Bmlipase-1的家蚕转基因系统的建立》一文。二转基因显微注射和阳性个体的筛选
1将家蚕大造品种蚕卵浸酸解除滞育以后，放于15°C和80%湿度的黑暗环境中催青直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养，化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4h，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射；
2将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2h用Eppendorf显微注射仪将实施例1所得的转基因增量表达载体pBac [IElP-Bmlipase-l-sv40-3XP3-EGFPafm] 和辅助质粒A3H，一起注射进932粒大造蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25°C、相对湿度 80%的环境中催青孵化，将孵化的510头GO代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾；
3 GO代蚕蛾通过自交或回交共获得32蛾圈Gl代蚕卵，用Olympus 电动宏观荧光显微镜观察筛选并获得7个阳性蛾圈，转化效率为21. 88%。三转基因系统的抗性检测
1将实施例2所得的7个阳性蛾圈各自单蛾圈饲养，继代扩大得到7个转基因系统Li， 随机选择3个转基因系统进行后续的抗性检测。2取3个转基因系统和正常大造品种，在4龄起蚕时期以半致死剂量单头经口添食BmNPV病毒，4个系统各设置3个重复区，每个重复区100头蚕，同时每个系统设置3个不攻毒对照区，死亡率统计到化蛾时期；
3攻毒结果显示3个转基因系统中有两个系统(分别命名为LI-A和LI-B)提高了家蚕对BmNPV的抗性(符合我们的预期结果)，但其中一个系统(命名为LI-SWfBmNPV的抗性明显降低。抗性检测结果显示和正常大造系统相比较，转基因系统LIA—直具有明显的抗性效果，能降低35%左右的死亡率。LI-S对BmNPV的抵抗性比正常亲本低了 100倍左右。 具体为
(1)将LI-A、LI-S和正常大造蚕卵浸酸(盐酸比重为1.073，温度为46°C，时间为5分钟)解除滞育以后，放于25°C和85%湿度的环境中催青10天左右直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养(温度25°C，湿度80%)。(2)在四龄起蚕经口添食BmNPV病毒检测抗性。将新鲜的桑叶切成直径一厘米的小块，然后将病原涂抹在切好的桑叶小块上面，一头蚕单独吃一小块涂抹过病原的桑叶，只有将这小块桑叶吃完了的蚕才被挑选出来继续饲养，统计死亡率到化蛾。攻毒数据统计结果(图1)显示，在四龄起蚕以IO4多角体/头经口添食感染BmNPV后，正常亲本(大造)和 LI-S的死亡率分别为10%和50%左右；在以IO6多角体/头经口添食感染BmNPV后，正常亲本(大造)和LI-S的死亡率分别为50%和80%左右。和正常亲本相比，LI-S对BmNPV的抵抗性降低了 100倍左右。实施例2检测LI-S中外源片段的插入位点一反向PCR鉴定LI-S外源片段的插入位点
取20 μ g实施例1提及的LI-S的基因组在37°C用汤e//Jl切过夜，酶切产物纯化后用Solution I (购买自TaKaRa)进行连接，以自连产物为模板，用转座子特异的引物进行 PCR 扩增(pb-left F: 5 '-atcagtgacacttaccgcattgaca-3，，pb-left R: 5 '-tgacgagct tgttggtgaggattct-3')，PCR反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、54°C退火40秒、72 °C延伸2分钟，共30个循环，最后72°C延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与PMD19-T载体连接，连接反应在T4 DNA连接酶作用下，16°C过夜连接，然后转化DH5ci感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序。将测序结果在家蚕基因组数据库中进行比对，结果(图2)显示外源片段插入在nsCafl898的12392322处，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示，其距离最近的上游基因35. 8Kb，距离最近的下游基因14. 6Kb。二 LI-S外源片段插入位点的再次确定
根据反向PCR的结果和家蚕基因组序列，设计两对引物对插入位点再次进行检测 (LlS-Pb-l F :5'-acaagcacgcctcacgg-3', R :5'_tacaacaagcaaacatagcga_3' ；LIS_Pb_2 F 5' - taccgcattgacaagcac-3，, R 5' _actcgatatgcctgctcc_3，),每对弓丨物的上游弓丨物在插入的载体序列上，下游引物在家蚕基因组上。以LI-S基因组为模板，用LIS-Pb-I和 LIS-Pb-2两对引物进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40 秒、52 °C退火40秒、72 °C延伸35秒，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出目地条带，将目的条带回收连接转化，挑取阳性克隆测序。测序结果显示反向PCR的结果是正确的，LI-S的外源片段确实插入在家蚕基因组nscaf 1898的 12392322 处(图 2)。实施例3检测LI-S外源片段插入位点附近基因的表达量变化情况
在家蚕基因组数据库中下载插入位点附近的基因序列和对应的EST序列，结果显示在距离插入位点150kb范围内，插入位点上游基因BGI000882、BGI001264、BGI001265 (上述基因详见家蚕基因组数据库)有EST证据，插入位点下游基因BGI000879、BGI001266、 BGI001267、BGI001268、BGI001269 (上述基因详见家蚕基因组数据库)有EST证据。 选择上述基因设计检测引物(BGI001266QRT F 5' -cgtgaaggcgctgttctacca-3，，R 5，-gcggcgggactagataatactgg-3，；其他基因检测引物略)。插入位点下游距离最近的基因为BGI001266基因。通过RT-PCR进行检测，RT-PCR 的反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、58°C退火40秒、72°C延伸30秒， 共30个循环，最后72°C延伸10分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现除了 LI-S中BGI001266基因表达量降低以外(图3)，其他基因的表达量在LI_A、LI_S和正常大造中没有区别(图5)；定量PCR的结果显示，和正常大造和LI-A相比，LI-S中BGI001266 的表达量降低了一半(图4)。LI-A外源片段插入在家蚕基因组12号染色体的nsCaf2987 上(TTACAGCGACTTAAACTTCTTTAA-piRRyBac-TTAAAGTTGCTATTTTCATCAG)，LI-A 插入位点附近的基因表达量没有受到影响。由于LI-S和LI-A唯一的区别就是外源片段在家蚕基因组上的插入位点不一样，所以，LI-S对BmNPV病毒抵抗性大幅降低是由外源片段的插入导致 BGI001266表达量降低引起的。实施例4克隆BGI001266基因全长序列
在家蚕基因组数据库中下载该基因的EST序列，根据家蚕基因组序列和该基因的 EST 序列，设计引物克隆该基因(BGI001266qc F 5' -cggtcgtttcgttggagc-3，，R :5，-atttgcgtagaatccaaaatactaac-3，)。以家蚕大造品种5龄3天幼虫cDNA为模板进行PCR 扩增，PCR反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、58°C退火40秒、72°C延伸 1分钟，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出目地条带，将目的条带回收连接转化，挑取阳性克隆测序。测序结果显示我们克隆了 BGI001266的1190bp全长序列，如SEQ ID NO:2所示， 包括 213bp 的 5，UTR、642bp CDS (如 SEQ ID NO: 1 所示)和 332 bp 的 3，UTR。该基因的GC含量高达71. 5%，有两个外显子，编码区序列(Coding sequence，CDS)位于第2外显子上面。LI-S外源片段的插入位点距离该基因有14. 6Kb。生物信息学分析发现该基因具有一个Spry的结构域，我们将其命名为iMST/T。在 NCBI站点上用BLAST完成序列同源性分析，结果没有发现该基因的报道，说明BmSpry基因是一个新基因。BmSpry的全长序列以及对应的氨基酸序列如图6所示。查阅相关文献报道(Hong Joo Kim. Modulation of signalling by Sprouty: a developing story. (J) NATURE REVIEWS. 2004; Mark A. Lemmon. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. (J) Cel1. 2010; Susumu Katsuma. ERK- and JNK-Dependent Signaling Pathways Contribute to Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus Infection. (J) J Virol. 2007)，我们发现Spry基因是MAPKs信号传导通路上游的一个负调控因子，BmNPV感染家蚕后利用MAPKs信号通路来进行复制增殖，当用抑制剂分别抑制家蚕细胞中MAPKs信号传导通路的ERK和JNK蛋白后，家蚕细胞中的病毒含量明显减少。在LI-S系统中，由于外源片段插入到BmSpry基因上游，可能破坏了汝aS^f基因的调控序列，从而导致的表达量降低一半，导致对MAPKs信号通路的抑制能力减弱。 当BmNPV感染家蚕后，病毒能更加容易的利用该信号通路进行复制增殖，最终导致家蚕对 BmNPV的抵抗性严重降低。所以，BmSpry基因是控制家蚕对BmNPV的抵抗性的关键基因。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.家蚕汝基因，其特征在于，所述家蚕汝基因含有如SEQID NO: 1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的家蚕彻分^基因，其特征在于，所述家蚕基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1所述的家蚕基因的制备方法，其特征在于以家蚕大造品种全蚕或者组织cDNA为模板进行PCR扩增，设计的上游引物为F 5' - cggtcgtttcgttggagc-3'， 设计的下游引物为R 5' - atttgcgtagaatccaaaatactaac-3，，PCR反应条件为94°C预变性 4分钟，然后94°C变性40秒、58 °C退火40秒、72 °C延伸1分钟，共30个循环，最后72 °C延伸 10分钟，得如SEQ ID N0:2所示的家蚕汝基因。
4.权利要求1所述的家蚕基因在调节家蚕核型多角体病毒抗性中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物基因领域，特别是涉自于家蚕的控制家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)抗性的关键基因，所述家蚕BmSpry基因含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；其以家蚕cDNA为模板进行PCR扩增而得，其在调节家蚕型多角体病毒抗性中的应用；BmSpry基因表达量降低一半导致家蚕对BmNPV的抵抗性降低了100倍，本发明克隆和鉴定一个影响家蚕对BmNPV抗性的关键基因；BmSpry基因在培育家蚕抗BmNPV品种的理论研究和生产应用中都具有重要的价值。
文档编号C12N15/10GK102392025SQ20111037830
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月24日 优先权日2011年11月24日
发明者夏庆友, 徐汉福, 王根洪, 程廷才, 蒋亮, 金盛凯, 陆改 申请人:西南大学