专利名称：家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法
技术领域：
本发明属于转基因物质，尤其是畜禽用转基因酶制剂制造领域。
中国专利CN99103564公开了一种应用重组BmNPV载体-家蚕宿主表达系统生产植酸酶的基因工程方法，用植酸酶基因替换家蚕核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因，并使其处于多角体蛋白基因启动子的控制下，再将此重组质粒与野生型BmNPV-DNA共转染于家蚕细胞，通过体内同源重组得到带有外源植酸酶基因的重组病毒，再利用多角体蛋白基因的启动子启动植酸酶基因，并将此重组家蚕核型多角体感染家蚕，在蚕体内繁殖产生目标物植酸酶蛋白。但如何将家蚕基因工程植酸酶生产在较大的工业化程度上实现，或者更具体地说在畜禽用转基因酶制剂工业中批量化、低成本生产出具有商业竞争力的产品仍是需要解决的问题。
本发明的目的是，研究一种家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法，使之能改善现有技术的不足，低成本、批量化生产畜禽饲料用基因工程植酸酶商品化制剂。
本发明的目的使通过如下的方法实现的。
家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法，应用重组BmNPV载体-家蚕宿主表达系统生产植酸酶，用植酸酶基因替换家蚕核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因，并使其处于多角体蛋白基因启动子的控制下，再将此重组质粒与野生型BmNPV-DNA共转染于家蚕细胞，通过体内同源重组得到带有外源植酸酶基因的重组病毒，再利用多角体蛋白基因的启动子启动植酸酶基因，并将此重组家蚕核型多角体感染家蚕，在蚕体内繁殖产生目标物植酸酶蛋白，其特征在于，收蚕后经匀浆后以细度大于16-60目的麸皮混匀，麸皮用量按重量比0.5-2.0/每克蚕混匀吸附，其混合物在温和温度下烘干，再经粉碎——过筛——搅拌均匀后制得畜禽用植酸酶制剂。
采用本发明的方法，在较小的生产成本下可保证较大批量的蛹(蚕)获得平均较高的酶活量，从而使基因工程植酸酶制剂能在在较大的工业化程度上实现商品化。
工艺条件的选择1.匀浆液用量经多次实验，选取匀浆缓冲液的组成为HAc-NaAc，pH 5.5，Ca2+1毫摩尔/升，缓冲液的加入量以缓冲液的加入量按0.5-2.0ml/克蚕为宜；2.麸皮细度将烘干后的麸皮分别粉碎至过8目、16目、30目、60目的筛网，与蚕浆混合吸附，再经50℃温和烘干粉碎过同样目数的筛网，取样测酶活，得如
图1结果。
图1为酶活性能与麸皮粉碎细度的关系图。
由
图1看出当粉碎细度在30目以上时，酶活性提高明显，而以60目时最高。然而，当粉碎细度超过30目以上时，粉碎时间将延长2～3倍，酶活提高与30目相比并不显著。因此，从产业化的角度看，30目附近的细度应该是最理想的。
3.烘干温度其他条件同实施例1，将以30目细度麸皮吸附的中间产品作烘干温度实验，将含植酸酶样品分别放置于室温，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃下烘干之后，按前述方法测酶活，结果见下表
由此看出温度在50℃以下时，植酸酶活性比较稳定，进一步的实验表明在55℃时，制剂仍有相当的植酸酶活性，但当温度≥60℃时，酶活立即降为0。因此，在家蚕基因工程植酸酶的烘干过程中，温度应控制在50℃以下，一般不宜超过55℃。
进一步的实验还表明，在匀浆工序前，将所收病蚕(蛹)作适度冻存处理，对于提高可检出酶活值具有良好的作用。
权利要求
1.家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法，应用重组BmNPV载体-家蚕宿主表达系统生产植酸酶，用植酸酶基因替换家蚕核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因，并使其处于多角体蛋白基因启动子的控制下，再将此重组质粒与野生型BmNPV-DNA共转染于家蚕细胞，通过体内同源重组得到带有外源植酸酶基因的重组病毒，再利用多角体蛋白基因的启动子启动植酸酶基因，并将此重组家蚕核型多角体感染家蚕，在蚕体内繁殖产生目标物植酸酶蛋白，其特征在于，收蚕后经加缓冲液匀浆，然后以细度16-60目，重量比为0.5-2.0克/克蚕的麸皮混匀吸附，其混合物在温和温度下烘干，再经粉碎——过筛——搅拌均匀后制得畜禽用植酸酶制剂。
2.根据权利要求1所述之家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法，其特征在于，所述麸皮细度为30目。
3.根据权利要求1所述之家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法，其特征在于，所述温和温度为30-55℃。
4.根据权利要求1所述之家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法，其特征在于，匀浆缓冲液的组成为HAc-NaAc，pH 5.5，Ca2+1毫摩尔/升。
5.根据权利要求1所述之家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法，其特征在于，缓冲液的加入量按0.5-2.0ml/克蚕。
6.根据权利要求1所述之家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法，其特征在于，蚕体在匀浆处理前先经冻存处理。
7.根据权利要求1所述之家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法，其特征在于，所述蚕体可为幼蚕及蚕蛹。
全文摘要
本发明涉及一种家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法,应用重组BmNPV载体－家蚕宿主表达系统生产植酸酶,感染的病蚕收蚕匀浆后以细度大于16－60目的麸皮混匀,其混合物在不超过55℃的温和温度下烘干,再经粉碎——过筛——搅拌均匀后制得畜禽用植酸酶制剂。在本发明的工艺条件下制得的酶制剂具有收率高、酶活损失小的优点。
文档编号C12N9/16GK1384194SQ0110739
公开日2002年12月11日 申请日期2001年4月30日 优先权日2001年4月30日
发明者陈英, 石钰, 秦俭 申请人:四川华神集团股份有限公司