专利名称：一种以醋糟为原料固体发酵生产植酸酶的培养基及方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵生产植酸酶的培养基及方法，具体涉及一种以醋糟为原料固 体发酵生产植酸酶的培养基及方法。
背景技术：
植酸(phytic acid)，即肌醇六磷酸，是植物籽实中磷的主要贮存形式，其中 60% 70%的磷是以植酸盐的形式存在的。单胃动物消化道中由于缺乏植酸盐分解酶，必 须在饲料中添加价格昂贵的无机磷酸盐，不仅提高了饲料成本，而且不能消化吸收的无机 磷随粪便排出，造成环境污染；此外，植酸盐能螯合蛋白质、矿物等营养因子，降低了营养因 子的利用率，被认为是抗营养因子。植酸酶(phytase)可以将植物性饲料中的植酸及其盐 分解为肌醇和磷酸，增加可利用磷的含量，降低植酸对矿物质和蛋白质的螯合，解除植酸的 抗营养作用，增加动物对蛋白质和某些金属离子的吸收能力。目前，饲料中添加植酸酶的效 果已经在世界范围内得到了确证。由于植酸酶的生产方法主要是采用发酵法，因此对植酸酶生产过程中的发酵条件 进行优化就尤为重要。有文献报道，固体发酵时，利用统计优化方法，可以使得微小毛霉 (R. pusillus)所产的植酸酶提高1. 3倍(Chadha等，2004)，总状毛霉(M. racemosus)所产 的植酸酶提高1.85倍(Bogar等，2003a)，使得无花果曲霉(A. ficuum NRRL 3135)所产的 植酸酶提高1. 67倍(Bogar等，2003b)。在进行发酵培养基的优化时，通常采用单次单因子法(one-factor-at-one-time) (褚以文，1999)，或者在单因子的基础上采用正交试验补充考察因素间的交互作用，这些方 法在考察因素时仅比较了各因素的已选定水平的优劣，无法提供未考察区域的信息，不能 进行预报和控制，而且需要较多的试验次数和较长的试验周期，尤其对于自身生长周期较 长的菌株需要更长的试验周期。Plackett-Burman设计法是一种两水平的试验设计方法，它可以用最少的试验次 数使主效应因素得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最 为重要的几个因素，供进一步研究(褚以文，1999 ；胡运权，1997)。对PB (Plackett-Burman) 试验结果进行分析时，一般选择可信度大于90% (或80%)以上的因素作为重要因素(梅 兴国等，2001 ；胡升等，2001)。最速上升试验是指沿着最速上升的路径，即响应有最大增量的方向逐步移动的方 法。试验沿着最速上升的路径进行，直到观察到的响应不再增加为止，这种方法可以充分逼 近最大响应区域，以利于后续试验中找到最大的响应值。响应曲面分析(RSM)是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法。它通过 综合实验设计和数学建模，局部试验回归拟合因素和结果间的全局关系，从而得到有效的 结论(李平和张克昌，1999 ；高修功等，1998)。其中CXD法，即中心复合设计是在2水平全 因子和分部试验设计的基础上发展出来的一种试验设计方法，它是2水平全因子和分部试 验设计的拓展。通过对2水平试验增加一个设计点(相当于增加了一个水平)，从而可以
3对评价指标和因素间的非线性关系进行评估。它常用于需要对因素的非线性影响进行测 试的试验中，它用于2-6个因素的优化试验。3个因素的CCD设计，每个因素取5水平，以 (-α，-1，0，+1，+ α)编码。根据相应的实验表进行试验后，对数据进行二次回归拟合，得到 带有平方和交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定的水平范围 内求出最佳值。响应面分析法和Plackett-Burman设计法是20世纪中后叶发展起来的优化试验 条件的统计学方法(胡运权，1997)，它们的结合可用较少的实验数据推算出目标值的优化 条件，优化效率高，在微生物发酵和酶生产方面已有广泛应用(Francis等，2003 ；Bogar等， 2003a, b ；Chadha 等，2004 ；Singh 禾口 Satyanarayana，2006b)。
发明内容
本发明的目的是供一种以醋糟为原料固体发酵生产植酸酶的培养基及方法。本 发明通过Plackeet-Burman试验进行众多因素中的主要因素的选择，用最速上升法对所选 重要因素进行最大响应值的各因素水平的选择，然后采用中心复合试验结合响应曲面分析 (RSM)得到响应值与重要因素间的关系式，并计算得到最大响应值时的重要因素的水平，从 而确定了固体发酵生产植酸酶的最佳发酵条件。本发明的技术方案如下一种固体发酵生产植酸酶的培养基，该培养基由醋糟、葡萄糖和豆粕组成，其中按 固体培养基的总重量计，葡萄糖含量为7. 2% (重量)，豆粕含量为5.1% (重量)。一种固体发酵生产植酸酶的方法，该方法采用的固体培养基由醋糟、葡萄糖和豆 粕组成，其中按固体培养基的总重量计，葡萄糖含量为7. 2 % (重量)，豆粕含量为5. 1 %
(重量)。在上述方法中，发酵时间优选为271小时。在上述方法中，发酵采用的菌种可以为无花果曲霉，优选为保藏编号为CGMCC No. 2980的无花果曲霉。在上述方法中，发酵温度为27°C。本发明采用的植酸酶生产菌株无花果曲霉(Aspergillus ficuum)NTG-23，于2009 年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCCJia 北京市 朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No. 2980。传统的对于多变量的发酵优化试验方法通常采用的是单次单因子或是在单因子 的基础上进行正交试验来确定各因素之间的互作效应，但此法费时，费力而且费钱(Bogar 等，2003a，b ；Chadha 等，2004 ；Singh 和 Satyanarayana，2006b)。针对多变量的统计试验设 计Placket-Burman和RSM法可以克服采用“单次单因子方法”优化培养基的局限。本发明 将PB、最速上升和响应曲面法结合使用，从而得到以醋糟为原料发酵生产植酸酶的最佳条 件。通过PB试验得到对发酵结果有显著性影响的三个因素葡萄糖、豆粕和发酵时 间，T检验结果置信度在95%以上。因此，确定这三个因素为后续培养基优化的因素。以葡 萄糖、豆粕和发酵时间为最速上升试验的三个变量，分别选定步长为1. 5%,0. 7%,96小时 进行试验，结果显示当葡萄糖含量为5.0%，豆粕含量为2.8%，发酵时间为180小时时，植酸酶活性逼近最大值区域。后续试验将此结果作为中心复合设计的中心点进行回归方程的 拟合，拟合方程的失拟检验不显著，说明此方程可以替代试验真实点对试验结果进行分析。 回归方程的一次、二次项是显著的，说明各处具体因子对响应值的影响不是简单的线性关 系。对回归方程求一阶导数并使其等于零，得到发酵培养的最佳条件组合为葡萄糖7. 2% (重量)、豆粕5.1% (重量)、发酵时间271小时。经验证试验得到此条件下，植酸酶活性 均值达到98. 37U/g DMR。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图1为γ = MX1，X2)的响应面立体分析图(X3 = 180小时)；图2为Y = f(Xi; X2)的等高线图(X3 = 180小时)；图3为Y = f (X1, X3)的响应面立体分析图(X2 = 2. 8% )；图4 为 Y = f(X1 X3)的等高线图(X2 = 2.8% )；图5为Y = f(X2，X3)的响应面立体分析图(X1 = 5% )；图6 为 Y = f(X2, X3)的等高线图(X1 = 5% )。在图1至6中，X1表示葡萄糖浓度(％ )，X2表示豆粕浓度(％ )，X3表示发酵时间 (小时)。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。实施例11.材料与方法1. 1菌株来源A. ficuum NTG-23 0. 5mg/mL亚硝基胍辐照后得到的诱变菌株。1. 2培养基1. 2. IPDA培养基马铃薯200g ；葡萄糖20g ；琼脂20g ；水IOOOmL0将马铃薯去皮，切成小块，放入IOOOmL水中煮沸30分钟，四层纱布过滤，收集滤 液。溶入葡萄糖，补足水量至IOOOmL,加入琼脂，pH自然。121°C，湿热灭菌20分钟。1. 2. 2麸皮培养基麸皮IOOg ；琼脂20g。将麸皮放入IOOOmL水中煮沸30分钟，四层纱布过滤，收集滤液，加入琼脂，补足水 量至lOOOmL，pH自然。121°C，湿热灭菌20分钟。1. 2. 3固体发酵培养基醋糟IOg ；蒸馏水19mL。将醋糟装于250mL的三角瓶中，加入蒸馏水，用封口膜密封，于121 °C湿热灭菌20 分钟。1. 3主要仪器生化培养箱LRH_250A，广东省医疗器械厂电热手提压力蒸汽消毒器中国上海医疗器械厂旋涡混合器QL_901，江苏海门市麒麟医用仪器厂
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超净工作台哈尔滨东联电子开发有限公司电子天平(METTLER TOLEDO) =Mettler-Toledo instr(shang hai)Ltd移液器=EppendorfO.25-1000 μ L 系列电热恒温水浴锅江苏省东台市电器厂紫外分光光度计Thermspetronic Helios-αρΗ 测定仪(pH-211) Microprocessor pH Meter，意大利哈纳仪器低温冷冻离心机(5810R) :Eppendorf公司恒温培养振荡器哈尔滨东联电子开发有限公司恒温水浴锅优莱博技术有限公司1. 4主要试剂亚硝基胍(NTG)日本株式会社葡萄糖北京北化精细化学品有限责任公司植酸钠Sigma公司三氯乙酸(TCA)国药集团化学试剂有限公司琼脂汕头市西陇化工厂有限公司甘氨酸优博奥有限公司吐温-80 国药集团化学试剂有限公司CaCl2 汕头市西陇化工厂有限公司(NH4)6Mo7O24 · 4H20 国药集团化学试剂有限公司H2SO4 北京北化精细化学品有限责任公司NH4NO3 北京北化精细化学品有限责任公司KCl 北京北化精细化学品有限责任公司MgSO4 · 7H20 北京北化精细化学品有限责任公司FeSO4 · 7H20 北京北化精细化学品有限责任公司MnSO4 · 7H20 汕头市西陇化工厂有限公司1. 5试验方法1. 5. 1菌株的活化将A. ficuum NTG-23诱变菌株制成菌悬液移植于琼脂试管斜面，于27°C培养24小 时。取斜面菌种，分别加入5mL无菌生理盐水，用接种环将菌苔轻轻刮下，振荡，无菌条件下 倾注于另一盛有20mL无菌生理盐水的250mL三角瓶(盛有数粒玻璃珠)中。置于摇床上 以200rpm振荡20分钟，制成均勻菌悬液，吸取200 μ L此菌悬液接种于马铃薯(PDA)平板 培养基上，27 °C培养72小时，用于后续试验。1.5. 2孢子悬液的制备将活化好的NTG-23菌株接种于麸皮培养基上，于27°C生化培养箱中培养5天，取 出加入无菌水，将菌苔轻轻刮下，倾注于盛有玻璃珠和无菌水的三角瓶中，200rpm震荡20 分钟，用定性滤纸过滤，滤液用血球计数板计数，调整孢子浓度为106CFU/mL。1. 5. 3Plackett-Burman 试验设计表1列出了 11种待筛选的因素，因素的最高、最低水平的百分含量和发酵时间，按 照表1和表3所示各种成分配制固体发酵培养基，每瓶接入浓度为106CFU/mL的孢子悬液lmL，于27°C生化培养箱中培养，在pH值为1. 3，温度为37°C条件下，用硫酸亚铁-钼蓝法进 行植酸酶活性的检测，每次试验三个重复，结果取均值。
表IPlackett-Burman试验设计各因素及其水平
权利要求
一种固体发酵生产植酸酶的培养基，该培养基由醋糟、葡萄糖和豆粕组成，其中按固体培养基的总重量计，葡萄糖含量为7.2％(重量)，豆粕含量为5.1％(重量)。
2.一种固体发酵生产植酸酶的方法，该方法采用的固体培养基由醋糟、葡萄糖和豆粕 组成，其中按固体培养基的总重量计，葡萄糖含量为7. 2% (重量)，豆粕含量为5.1% (重量)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵时间为271小时。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵采用的菌种为无花果曲霉， 优选为保藏编号为CGMCC No. 2980的无花果曲霉。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵温度为27。C。
全文摘要
本发明提供一种以醋糟为原料固体发酵生产植酸酶的培养基及方法，该方法采用的固体培养基由醋糟、葡萄糖和豆粕组成，其中按固体培养基的总重量计，葡萄糖含量为7.2％(重量)，豆粕含量为5.1％(重量)。本发明通过PB试验得到对发酵结果有显著性影响的三个因素葡萄糖、豆粕和发酵时间，并采用最速上升法对所选重要因素进行最大响应值的各因素水平的选择，然后采用中心复合试验结合响应曲面分析(RSM)得到响应值与重要因素间的关系式，并计算得到最大响应值时的重要因素的水平，从而确定了固体发酵生产植酸酶的最佳发酵条件，即葡萄糖7.2％(重量)、豆粕5.1％(重量)、发酵时间271小时。经验证试验得到此条件下，植酸酶活性均值为98.37U/g DMR。
文档编号C12R1/66GK101993860SQ200910090909
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月14日 优先权日2009年8月14日
发明者佟建明, 张国庆, 张琪, 王志红, 董晓芳 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所