专利名称：3α-羟基类固醇脱氢酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶，编码该酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，以及包括上述酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。更具体地，本发明涉及一种3α-羟基类固醇脱氢酶，编码该3α-羟基类固醇脱氢酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，以及包括上述3α-羟基类固醇脱氢酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。
背景技术：
3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-Hydroxysteroid Dehydrogenase，3α-HSD，EC1.1.1.50)可作用于多种底物，可逆性地催化C19-27类固醇3位羟基/酮基的氧化还原。胆汁酸是3α-HSD的作用底物之一，临床上用3α-HSD作为工具酶来测定人血清中的总胆汁酸(total bile acids，TBA)浓度。因而可以制备成包括3α-羟基类固醇脱氢酶的相应试剂盒，例如检测血清中胆汁酸浓度的试剂盒。
胆汁酸与3α-HSD及氧化型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD+)发生反应，生成3-酮胆汁酸和还原型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)。3-酮胆汁酸在3α-HSD和NADH作用下，还原生成胆汁酸及NAD+。例如，具体反应原理可以如以下的式一所示
(式一) 由以上反应式可知，Thio-NADH的生成速率与被测样本中胆汁酸浓度成正比，因此可以利用分光光度计，通过在405nm波长处监测Thio-NADH引起的吸光度的变化来计算出被测标本(例如，血清等体液)中的胆汁酸浓度。此外，还可以利用分光光度计，通过在340nm波长处监测NADH吸光度的变化，来计算出3α-HSD的酶活性。
现已经开发出符合以上原理的测定血清中胆汁酸浓度的试剂盒，例如旭化成株式会社(Asahikasei)生产的血清胆汁酸浓度的检测试剂盒。
但是目前的试剂盒所用的3α-羟基类固醇脱氢酶存在着耐热性差(参见图3)，使试剂盒的运输、保存和使用过程对环境温度要求较高，容易由于3α-羟基类固醇脱氢酶的变性而影响到试剂盒测定的有效性和准确性。
发明内容
本发明的一个目的是克服现有的3α-羟基类固醇脱氢酶耐热性差的缺点，提供一种耐热性好的3α-羟基类固醇脱氢酶。
本发明的第二个目的是提供编码所述3α-羟基类固醇脱氢酶的核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供包括所述核苷酸序列的重组载体。
本发明的第四个目的是提供包括所述重组载体的重组宿主细胞。
本发明的第五个目的是提供包括上述3α-羟基类固醇脱氢酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。
3α-羟基类固醇脱氢酶广泛存在于多种生物体中，但是不同种生物体(比如多种细菌等)来源的3α-羟基类固醇脱氢酶的性质差别很大。本发明的发明人付出了大量地创造性劳动，利用对多种生物体设计引物调取目的基因并结合定点突变技术的方法，最终通过从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putidaATCC12633)中调取3α-羟基类固醇脱氢酶编码基因并对之进行随机定点突变，得到本发明具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的3α-羟基类固醇脱氢酶。并且本发明的发明人意外地发现，所得3α-羟基类固醇脱氢酶耐热性好，从而降低了对由其制备的试剂盒的运输、保存的温度条件。其中所述恶臭假单胞菌购自美国标准生物品收藏中心，其编号为ATCC12633。
本发明提供了一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其中，所述3α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
本发明还提供了编码本发明所述3α-羟基类固醇脱氢酶的核苷酸序列。
本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。
本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。
本发明还提供了包括本发明所述的3α-羟基类固醇脱氢酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。
本发明提供的3α-羟基类固醇脱氢酶具有耐热性好的优点。参见图1可知，本发明的3α-羟基类固醇脱氢酶在60℃都具有80％以上的相对活性，明显高于在相同条件下的对比例1(参见图3)的3α-羟基类固醇脱氢酶的相对活性(仅有30％)。
图1制备实施例1的3α-羟基类固醇脱氢酶温度稳定性曲线图； 图2制备实施例1的3α-羟基类固醇脱氢酶最适温度活性曲线图； 图3对比例1的3α-羟基类固醇脱氢酶温度稳定性曲线图； 图4对比例1的3α-羟基类固醇脱氢酶最适温度活性曲线图。
具体实施例方式 本发明提供了一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其中，所述3α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
本发明提供的3α-羟基类固醇脱氢酶还可以进行修饰，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的3α-羟基类固醇脱氢酶存在有不影响序列的修饰形式上的差异。即所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的蛋白的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
本发明还提供了编码本发明所述3α-羟基类固醇脱氢酶的核苷酸序列。
本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的3α-羟基类固醇脱氢酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述3α-羟基类固醇脱氢酶活性一致的氨基酸序列。
优选情况下，本发明所述核苷酸序列为 (1)SEQ ID NO2所示的核苷酸序列；或者 (2)对SEQ ID NO2所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。
所述核苷酸序列更优选为SEQ ID NO2或者SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。所述核苷酸序列最优选为SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。本发明的发明人通过大量的实验最终确定的SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，由于可能更符合例如大肠杆菌的基因工程菌的密码子偏好性，因而更有利于基因工程菌表达蛋白产物。
本发明提供的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列和重组工程菌，可以很容易获得模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后将所得片段按正确次序拼接。一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。
本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。本领域公知，所述重组载体一般包括空载体和插入该空载体的目的基因，所述目的基因为本发明所述的3α-羟基类固醇脱氢酶的核苷酸序列。
在本发明中，所述“空载体”(或称“载体”)可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pET28b(+)质粒、pET30a、pMAL-c2x、pMD18-T或pUC19。所述空载体可以包括多种常用的检测标记(例如荧光标记、抗生素标记等报告基因)和酶切位点。重组载体构建可采用空载体本身多克隆位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可用Sal I、BamH I、EcoR I等，对于pET28a，可用Ndel、XhoI、Nhel、EcoR I、BamH、HindIII等，对于pET28b可用EcoR I、Nde I、BamH、HindIII等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。优选所述重组载体为pET28b-3α-HSD(C61S)或pET30a-3α-HSD(C61S)或pMAL-c2x-3α-HSD(C61S)(见制备实施例1-4)。本发明优选采用NdeI和XhoI双酶切pET28b及与其连接的PCR产物片段，经连接酶连接，构建本发明的重组载体pET28b-3α-HSD(C61S)。
本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。
可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化；所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母(如毕赤酵母)或各种动植物细胞，更优选所述宿主细胞为本领域常用的基因工程菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母。最优选所述宿主细胞为大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rosetta(DE3)或大肠杆菌DH5α。
可以使用本领域常用的方法从重组宿主细胞中分离和纯化3α-羟基类固醇脱氢酶。例如，离心分离培养基和重组宿主细胞，高压匀浆破碎细胞、离心过滤去除细胞碎片，亲和层析纯化3α-羟基类固醇脱氢酶。对于分离纯化所得的3α-羟基类固醇脱氢酶的产物，可以使用本领域常用的方法进行纯度鉴定。例如，考马斯亮蓝法、凯氏定氮法、双缩脲法、lowry法、紫外吸收法、亲和层析、酶活性、抗原抗体法、电泳分析(例如十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)、沉降分析、扩散分析、恒溶度法、蛋白质谱等。
本发明还提供了包括本发明所述的3α-羟基类固醇脱氢酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。优选情况下，本发明的试剂盒包括3α-羟基类固醇脱氢酶，而不包括核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞。更优选本发明的试剂盒包括3α-羟基类固醇脱氢酶的干粉，而不包括核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞。可以用本领域常用的方法制备3α-羟基类固醇脱氢酶的干粉，只要该方法能够得到3α-羟基类固醇脱氢酶的干粉，并且不破坏3α-羟基类固醇脱氢酶的干粉的活性即可。例如使用真空减压浓缩器得到浓缩的酶液，然后使用冷冻干燥机干燥浓缩的酶液；或者使用真空减压干燥器等设备。由于本发明的3α-羟基类固醇脱氢酶耐热性好，还可以使用喷雾干燥的技术得到该酶的干粉。3α-羟基类固醇脱氢酶的干粉在使用时可以通过溶解于pH7.5-10的缓冲液体系(例如三乙醇胺缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选pH为7.6-8)中而转化为液体形式。
本发明的试剂盒还可以包括本领域常用于检测检测胆汁酸浓度的试剂盒的成分。对应于本发明的试剂盒中的3α-羟基类固醇脱氢酶可以是液体形式和/或固体干粉形式，本发明的试剂盒中的其他成分也可以是液体形式和/或固体干粉形式。例如，当本发明的试剂盒为液体形式时，一般可以含有试剂一(R1)和试剂二(R2)；其中，所述试剂一可以包括溶于pH 3.5-4.5的50-200mmol/L2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)中的0.2-5g/L氧化型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)；所述试剂二可以含有溶于pH 9.0-11.0的50-200mmol/L 3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液(CAPSO缓冲液)中的2-10g/L的还原型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)、0.1-10mmol/L的NaN3和2-20KU/L的3α-羟基类固醇脱氢酶。优选情况下，所述试剂一可以包括溶于pH 4的55-75mmol/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中的1-1.5g/L氧化型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；所述试剂二可以含有溶于pH 9.0的55-75mmol/L 3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液中的4-7g/L的还原型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.5-1.0mmol/L的NaN3和5-10KU/L的3α-羟基类固醇脱氢酶。
以上所述的试剂一和试剂二分别都可以通过冷冻干燥技术，结合减压蒸馏技术、反渗透技术及超滤技术等，制备成试剂一干粉(其中包含本发明的G6PDH干粉)和试剂二干粉。所述干粉可以在检测待测标本前用选自去离子水、蒸馏水和双蒸水的溶剂复溶至所述试剂的原有体积。因此本发明的试剂盒可以包括液体形式的试剂一和试剂二，或者可以包括试剂一干粉和液体形式的试剂二，或者可以包括液体形式的试剂一和试剂二干粉，或者可以包括固体形式的试剂一干粉和试剂二干粉。
在检测待测标本中的胆汁酸时，先将体积比为1∶100至1∶10的待测标本(或胆汁酸校准液)与试剂一混合，在37℃下保温300秒后，向混合物中加入试剂二。所述胆汁酸校准液可以是胆汁酸的水溶液。将所得试剂一、试剂二和待测标本(或胆汁酸校准液)的混合液在37℃下保温60秒时，在405nm下通过分光光度计记录吸光度数值A1，在测定A1后的第180秒记录吸光度数值A2。按照以下式二计算胆汁酸的浓度
(式二) 其中，ΔA＝A2-A1，即ΔA标本＝A2标本-A1标本，ΔA校准＝A2校准-A1校准。
通常采用两种校准液即蒸馏水和胆汁酸浓度为40-50μmol/L的高值校准液。所述高值校准液优选可以是44μmol/L的胆汁酸溶液。所述高值校准液的最低值不得低于30μmol/L最高值不得高于60μmol/L。使用本发明的试剂盒时，一般可达到的准确的胆汁酸浓度测量范围为0-200μmol/L，优选5-150μmol/L。本发明的试剂盒可以包括记载有上述各种组分使用方法和用量的说明书。因此，所述标准液也可以不配备在试剂盒中，由使用者在使用前按照试剂盒说明书的记载根据现有技术配制即可。
本发明的试剂盒可以包括记载有上述各种组分使用方法和用量的说明书。因此，所述溶液也可以由使用者在使用前按照试剂盒说明书的记载根据现有技术配制即可。
适于使用本发明所述试剂盒的待测标本可以是动物体(包括人体)血清以及与血清性质类似的其它体液。
下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。
制备实施例1 (1)亲本3α-羟基类固醇脱氢酶基因的合成 将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida ATCC12633)以1×105细胞/毫升的接种量，使用液体LB培养基在26℃以160rpm的转速振荡培养16小时，至恶臭假单胞菌的细胞浓度达1×109细胞/毫升。所述LB培养基包括10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉以及10g/L的NaCl，余量为水，pH为7.0，并且经过在121℃下灭菌20分钟。
取上述所得培养物1.5毫升，在室温下以8000rpm离心5min，弃上清。所得沉淀重新悬浮于1ml pH8.0的TE缓冲液中(TE即Tris-EDTA缓冲液)中。加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃下作用2小时，再加入2mol/L的NaCl 50μl、10％SDS的110μl和20mg/ml的蛋白酶K 3μl，然后在50℃下作用15min。然后将所得菌液全部转到规格为10ml的离心管中，向每个离心管中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)混合液，混匀后放置5min。在12000rpm离心10min，吸取上清。重复以上重悬、加入酚氯仿异戊醇、混匀静置、离心和收集上清的过程两次。合并三次收集的上清，在该合并的上清中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。在12000rpm下离心10min，沉淀用75％的乙醇洗涤、凉干后，得到恶臭假单胞菌基因组DNA，溶于50μlddH2O中。
将以上述步骤得到恶臭假单胞菌的基因组DNA 1μg和0.5μg的质粒pUC19同时分别用Ava I在37℃下酶切1小时，然后在65℃水浴放置10min以灭活Ava I酶。将两者用T4连接酶在37℃下连接12小时，将得到的PCR扩增基因产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，并用QIA快速提取凝胶试剂盒(快而精公司(QIAGEN)，德国)回收负载有外源基因的重组质粒。然后从所得重组质粒转化感受态的大肠杆菌JM109中筛选出具有产3α-羟基类固醇脱氢酶活性的克隆。具体操作如下 挑取在LB固体培养基上37℃培养16小时的大肠杆菌JM109的单菌落，于液体LB培养基中在37℃、150rpm的摇床再培养16小时。取1ml所得液体培养物转接于100ml新鲜液体LB培养基中，在37℃摇床上以250-300rpm的转速剧烈振荡培养2.5小时。吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟后，在4℃、3000g下离心5分钟。弃去上清，加入100μl在冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，重悬细胞，在冰放置20分钟。然后在4℃、3000g下离心5分钟，弃去上清，加入100μl在冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，重悬细胞，得到感受态的宿主细胞。
取200μl上述感受态的大肠杆菌JM109置于1.5ml离心管中，加入体积为10μl的pUC19重组质粒溶液(其中pUC19重组质粒含量为40ng)轻轻摇匀，冰上放置30分钟。然后在42℃水浴中热击90秒，接着迅速置于冰上冷却5分钟。向离心管中加入1ml LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的氨苄青霉素抗生素抗性基因(Ampr)。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含氨苄青霉素、100mg/L雄酮、10mM硫代氧化型辅酶、200U/ml心肌黄酶以及2g/L氯化硝基四氮唑的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养20小时。在筛选平板上出现了大肠杆菌的菌落，即pUC19重组质粒已经转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中；并且存在具有变色圈的克隆，说明得到了包含有3α-羟基类固醇脱氢酶整个基因的重组质粒的大肠杆菌JM109。
挑取具有变色圈的克隆，在37℃下LB培养基中培养18小时后，提取其质粒DNA。本发明的发明人设计了正向引物G1GGAATTCCATATGAGCATCATCGTG，其上附加有NdeI酶切位点；反向引物G2CCGCTCGAGTCAGAACTGGGTC，其上附加有Xho I酶切位点。
以上述提取的质粒DNA为模板，PCR扩增3α-羟基类固醇脱氢酶的亲本基因。PCR扩增条件为20mM Tris-HCl(pH 8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、50μM dATP、50μM dGTP、50μM dTTP、50μMdCTP、400nM引物G1、400nM引物G2、1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng质粒DNA模板加入反应体系，用无菌水调至反应体积达50μL。
PCR扩增反应程序为将上述反应体系在95℃下反应5分钟，然后进行30个循环的“95℃45秒、55℃30秒和72℃1分30秒”，最后在72℃下保持10分钟。将得到的PCR扩增基因产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，并用QIA快速提取凝胶试剂盒(快而精公司(QIAGEN)，德国)回收750-800bp左右单一条带的DNA片段。
将所得DNA用美国应用生物系统公司的310型全自动DNA测序仪测序，测序结果分析得到长度为789bp(起始于起始密码子atg并终止于终止密码子tga)的蛋白编码基因，即SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
(2)3α-HSD突变体(C61S)目的基因的获得 本发明的发明人又涉及了如下的突变引物 FFCATATGAGCACCTACGCCATCAG R61GCCCTTGCTAGACTTGCTC F61CTGAGCAAGTCTAGCAAGGG以及 RRGAGCTATCAGAAGCTGTTGGCGCGC 以(1)得到的亲本3α-HSD为模板，利用引物对FF和R61，PCR扩增出片段FFR61(192bp)。
以(1)得到的亲本3α-HSD为模板，利用引物对RR与F61，PCR扩增出片段F61RR(618bp)。
以上述FFR61(192bp)和F61RR(618bp)的混合物为模板，利用引物对FF和RR，进行PCR扩增。
扩增条件为20mM Tris-HCl(pH 8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mMMgSO4、0.1％Triton X-100、50μM dATP、50μM dGTP、50μM dTTP、50μM dCTP、400nM引物G1和400nM引物240SR(或者400nM引物240SF和400nM引物G2)、1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)、20ng模板片段，用无菌水调至反应体积达50μL。
PCR扩增反应程序为将上述反应体系在95℃下反应5分钟，然后进行30个循环的“95℃45秒、55℃30秒和72℃45秒”，最后在72℃下保持10分钟。
经1％琼脂糖凝胶电泳分离，并用QIAquick Extraction Gel Kit(QIAGEN，German)回收，得到突变体3α-HSD(C61S)的全长基因序列。将突变体3α-HSD(C61S)连接到载体pMD18-T，得质粒pMD18-T-突变体3α-HSD(C61S)，转化宿主大肠杆菌DH5α，用LB培养基培养。在37℃培养18小时后，提取质粒DNA pMD18-T-亲本3α-HSD，经酶切且琼脂糖凝胶电泳分离后获得扩增的DNA片段。
将所得DNA片段用美国应用生物系统公司的310型全自动DNA测序仪测序，测序结果显示所得DNA片段中含有长度为789bp(起始于起始密码子atg并终止于终止密码子taa)的蛋白编码基因，经DNA测序确定引入的突变点无误，详细序列如SEQ ID NO2所示。
(3)构建重组载体 用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切(2)得到的蛋白编码基因，酶切所得大片段通过使用T4DNA连接酶，连接至同样已经用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切过的空载体pET28b(+)上。连接反应产物在琼脂糖凝胶电泳回收纯化出6.0-6.1kb左右的单一条带环状DNA片段，证明获得了重组表达载体pET28b-3α-HSD(C61S)。所述重组表达载体pET28b-3α-HSD(C61S)在pH为7的50mmol/L的tris缓冲液中保存。
(4)重组载体对宿主细胞的转化以及所得重组宿主细胞的培养 挑取在LB固体培养基上37℃培养16小时的大肠杆菌BL21(DE3)的单菌落，于液体LB培养基中在37℃、150rpm的摇床再培养16小时。取1ml所得液体培养物转接于100ml新鲜液体LB培养基中，在37℃摇床上以250-300rpm的转速剧烈振荡培养2.5小时。吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟后，在4℃、3000g下离心5分钟。弃去上清，加入100μl在冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，重悬细胞，在冰放置20分钟。然后在4℃、3000g下离心5分钟，弃去上清，加入100μl在冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，重悬细胞，得到感受态的宿主细胞。
取200μl上述感受态的大肠杆菌BL21(DE3)置于1.5ml离心管中，加入体积为10μl的pET28b-3α-HSD(C61S)溶液(其中pET28b-3α-HSD(C61S)含量为40ng)轻轻摇匀，冰上放置30分钟。然后在42℃水浴中热击90秒，接着迅速置于冰上冷却5分钟。向离心管中加入1ml LB液体培养基(不含卡那霉素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的卡那霉素抗生素抗性基因(Kan Resistant)。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Kan的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养20小时。在筛选平板上出现了大肠杆菌的菌落，即pET28b-3α-HSD(C61S)已经转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到了本实施例的重组宿主细胞——大肠杆菌BL21(DE3)-pET28b3α-HSD(C61S)。
配制3L LB培养基加入到5L发酵罐中，在121℃灭菌15分钟，完全冷却至室温后加入卡那霉素，使其终浓度为50μg/mL。在所得培养基中加入60mL生长至对数生长期的上述大肠杆菌BL21(DE3)-pET28b3α-HSD(C61S)(106细胞/毫升)。在37℃下培养至发酵液取样中的细胞密度达到107细胞/毫升。然后以5％接种量转接到100mL含有1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的LB培养基37℃诱导4小时。
(5)蛋白产物的分离提纯 将(4)得到的发酵液在8000rpm下离心15min，收集重组宿主细胞沉淀。弃去上清，将所得重组宿主细胞重悬于等体积的pH为7.5的50mmol/L的Tris-HCl溶液中。用高压匀浆机破碎重悬的细胞，在10000rpm下离心15min，收集上清粗酶液，弃取细胞碎片沉淀。
将上述所得粗酶液用孔径为0.22μm滤膜过滤后，所得滤液在美国通用电子公司(GE公司)的安克塔纯化者(AKTA Purifier)镍亲和层析柱上进行亲和层析。其中，上样缓冲液为50mmol/L的pH为7.5的Tris-HCl缓冲液。在流过两个柱体积的上样缓冲液后，使用洗脱缓冲液，其为含有0.5mol/L咪唑的50mmol/L的pH为7.5的Trsi-HCl缓冲液。当咪唑浓度达0.3mol/L时开始收集蛋白，收集实时监测到的蛋白单峰结束。
向收集到的蛋白溶液中加入40％(W/V)硫酸铵沉淀，然后在10000rpm的转速下离心10分钟。收集蛋白沉淀，并用0.1mol/L的pH为7.5的Trsi-HCl缓冲液复溶。所得溶液用孔径为0.22μm的滤膜过滤后，所得滤液再用100ml葡聚糖凝胶G-25层析柱(Sephadex G-25)脱盐。所述脱盐缓冲液是0.1mol/L的pH为7.5的Trsi-HCl缓冲液。在用脱盐缓冲液平衡好的层析柱上上样，其中样品溶液(即上述用0.1mol/L的pH为7.5的Trsi-HCl缓冲液复溶的蛋白溶液)的流速为8ml/min，上样量20ml，然后用脱盐缓冲液以10ml/min的流速洗脱5个柱体积。收集洗脱下的液体共500毫升。
所收集的液体在普通冰箱中-10℃下冷冻2小时，然后再-40℃深冷冰箱预冻8小时，在德国科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA 1-4LSC型冷冻干燥机中，以真空度0.04mbar、安全压力0.100mbar且冷阱温度-60℃的条件冻干10小时。然后等物料温度与冻干机隔板温度差为零，并且观察在15秒内压力指示不变时，结束冻干。冻干所得蛋白质的量为8.6克。冻干蛋白在常温干燥器中密封保存。
采用《分子克隆》(Sambrook等，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第三版，2002，下册1713-1722附录8科学出版社)记载的SDS-PAGE电泳的方法测定出本实施例的蛋白质的分子量约为66.2KD。并且根据《生物化学》(王镜岩等，高等教育出版社，2002，见168页)记载的蛋白质一级结构的测定方法(酶解后分肽段测定)，测得本实施例的蛋白质有262个氨基酸残基(参见SEQ ID NO1所示的氨基酸序列)，与由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列编码的蛋白质的结果一致。其中，SEQ ID NO1所示的氨基酸序列与SEQID NO4所示的氨基酸序列区别在于SEQ ID NO4第61位上的Cys被Ser取代。其中，本领域技术人员通过阅读本实施例，可以知晓本发明的核苷酸序列例如SEQ ID NO2，并可以通过化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此可以在得到具有该核苷酸序列的核酸后，无需实施本实施例第(1)-(2)步，而是直接从本实施例第(3)步开始重复本实施例。
(6)酶活的测定 按照如下方法测定酶活 试剂10.2M Tris-HCl PH 8.0 10mM NAD溶液0.05ml 0.25％(W/V)氯化硝基四氮唑(NTB)溶液0.05ml 100U/ml心肌黄酶溶液(DI)0.025ml 2％(W/V)Triton X-100 0.10ml 蒸馏水定容至0.5ml 试剂211.5g/ml雄酮(23mg雄酮溶于2ml无水甲醇)。
酶稀释液10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0) 具体步骤在比色杯中依次加入0.5ml试剂1，20μl酶液，37℃温浴5min分钟，然后加入试剂2，37℃测量5分钟，记录此过程数值的变化。即测定550nm处吸光度的变化。
酶活定义在25℃、pH 8.9且存在NAD时，每分钟转换1μmol雄酮所需的酶量。
酶活计算公式
ΔA吸光度变化 16.7NTBH2(雄酮)在550nm消光系数(cm2/μmole) 5反应时间(min) 3.045终体积(ml) 0.02酶液体积(ml) X酶液中所含酶量(mg/ml)。
测试结果见下表1。
综上，本发明的发明人得到了一种新的3α-羟基类固醇脱氢酶，其分子量约为28KD，具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
制备实施例2 按照SEQ ID NO3对SEQ ID NO2所示的核苷酸序列进行定点突变，得到SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的同义突变核苷酸序列。然后将得到的核苷酸序列按照制备实施例1的方法连接到pET28b(+)空载体上，也转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。在相同条件下培养所得重组宿主细胞，结果本实施例的3α-羟基类固醇脱氢酶产量比制备实施例1提高了14.5％。
制备实施例3 将SEQ ID NO2所示的核苷酸序列按照制备实施例1的方法连接到pET30a空载体上，转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中。在相同条件下培养所得重组宿主细胞，结果得到的3α-羟基类固醇脱氢酶，其3α-羟基类固醇脱氢酶的产量与制备实施例1基本持平。
制备实施例4 将SEQ ID NO3按照制备实施例1的方法连接到pMAL-c2x空载体上，转化入“大肠杆菌DH5α”中。在相同条件下培养所得重组宿主细胞，结果得到的3α-羟基类固醇脱氢酶，其3α-羟基类固醇脱氢酶的产量与制备实施例1基本持平。
对比例1 本对比例为旭化成株式会社生产的3α-羟基类固醇脱氢酶。
测试实施例1 按照制备实施例1记载的方法测试制备实施例2-4和对比例1的3α-羟基类固醇脱氢酶活性 表1 由以上结果可知，制备实施例1-4的3α-羟基类固醇脱氢酶酶活力与对比例1相比在同一数量级上，完全能够满足临床上测定待测标本中胆汁酸浓度的试剂盒的对3α-羟基类固醇脱氢酶的要求。
测试实施例2 按照如下方法测试制备实施例1-4和对比例1的3α-羟基类固醇脱氢酶的热稳定性 将300U酶活单位的3α-羟基类固醇脱氢酶干粉溶于PH值为8.0的20mM磷酸缓冲液中，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下保持15分钟，最后按照制备制备实施例1中的3α-HSD的活性检测方法测定加热处理后3α-HSD的残余比活性。按残存酶活与最大残存酶活的比值百分数为纵坐标，温度为横坐标绘制曲线。制备实施例1(制备实施例2-4编码的得到的氨基酸序列与制备实施例1相同)的热稳定性测试结果如图1所示，对比例1热稳定性测试结果如图3所示。通过比较，制备实施例2-4的热稳定性(图中未示出)测试结果与制备实施例1的基本相同。
从图中可以看出，从图1中可以看出，制备实施例1的3α-羟基类固醇脱氢酶在60℃都具有80％以上的相对活性，明显高于在相同条件下的对比例1(参见图3)的3α-羟基类固醇脱氢酶的相对活性(仅有30％)。
测试实施例3 按照如下方法测试制备实施例1-4和对比例1的3α-羟基类固醇脱氢酶的最适温度 将500U的3α-羟基类固醇脱氢酶干粉溶于PH值为8.0的20mM磷酸缓冲液中，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下放置5分钟，最后按照制备实施例1中的3α-HSD的活性检测方法测定加热处理后3α-HSD的残余比活性。按残存测量酶活与最大残存酶活的比值百分数为纵坐标，温度值为横坐标绘制曲线。制备实施例1(制备实施例2-4编码的得到的氨基酸序列与制备实施例1相同)的最适温度测试结果如图2所示，对比例1最适温度测试结果如图4所示。通过比较，制备实施例2-4的热稳定性(图中未示出)测试结果与制备实施例1的基本相同。
从图中可以看出，从图1中可以看出，制备实施例1-4的最适温度显著高于对比例1，从图中可以看出，制备实施例1-4的最适温度显著大于对比例1，在多种高温恶劣环境中可以保持稳定。并且结合表1的数据可知，即使制备实施例的酶活性在50℃时下降至最适温度的约90％，其活力仍然高于同温度下对比例1的酶活性。
制备实施例5-8 按照表2的配方配制试剂一和试剂二 表2
制备实施例5和6的试剂一和试剂二分别配制成液体形式即可。制备实施例7和8的试剂一和试剂二分别在如下条件下冷冻干燥在普通冰箱中-10℃下冷冻2小时，然后再-40℃深冷冰箱预冻8小时，在德国科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA 1-4LSC型冷冻干燥机中，以真空度0.04mbar、安全压力0.100mbar且冷阱温度-60℃的条件冻干10小时。然后等物料温度与冻干机隔板温度差为零，并且观察在15秒内压力指示不变时，结束冻干。冻干得到的试剂干粉可以在使用前用蒸馏水复溶成原液体形式的体积。冻干得到的试剂干粉，比液体形式的试剂保存的时间更长，包装要求较低，并且体积更小，运输更容易。制备实施例5-8中所用的3α-HSD分别为制备实施例1-4中获得的3α-HSD。制备实施例5-8具有胆汁酸浓度为100mmol/L的高值校准液。
对比例2 按照与制备实施例5相同的配方配制成液体形式的试剂盒。对比例2中所用的3α-HSD为对比例1的3α-HSD。
测试实施例4 本测试实施例测量了两个待测标本一个是配制的90μmol/L的胆汁酸水溶液(化学配制标准底物溶液)；另一个为健康状况良好的26岁男性的血清待测标本，抽取其10ml血液，静置至血细胞沉淀分层，取上层血清5ml用于对制备实施例5-8和对比例2的试剂盒进行检验。
试剂盒使用方法如下 血清胆汁酸测定(TBA)试剂盒说明书记载试剂1(R1)270μl，试剂2(R2)90μl，标本量(S)4μl。S+R1在37℃保温5分钟，加入R2；S+R1+R2在37℃保温60秒，记录吸光度值A1后，180秒后记录吸光度值A2。主波长405nm，副波长660nm。其中，空白样品为蒸馏水，高值校准液是44μmol/L的胆汁酸溶液。按照式二计算胆汁酸的浓度，测试结果见表3。
表3
由表3可以看出，制备实施例5-8的试剂盒测试结果比对比例2更接近真 实值；并且制备实施例5-8的试剂盒测试结果标准偏差明显小于对比例2，说明本发明的试剂盒性能更稳定，测量更准确。
序列表
<110>北京利德曼生化股份有限公司
<120>3-羟基类固醇脱氢酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞和试剂盒
<130>OICN093789
<160>5
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>262
<212>PRT
<213>Pseudomonas putida
<400>1
Met Ser Thr Tyr Ala Ile Ser Gly Ser Ala Thr Gly Ile Gly Ala Ala
1 5 10 15
Val Arg Gln Lys Leu Glu Ala Ala Gly His Thr Ile Val Thr Ile Asp
20 25 30
Ile Arg Asp Ala Glu Lys Phe Ile Leu Ala Asp Leu Ser Thr Ala Glu
35 40 45
Gly Arg Ala Gln Ala Ile Ala Arg Val Leu Ser Lys Ser Ser Lys Gly
50 55 60
Leu Asp Gly Ala Val Leu Cys Ala Gly Leu Gly Pro Ser Pro Gln Arg
65 70 75 80
Lys Val Leu Gly Asn Ile Val Ala Val Asn Tyr Phe Gly Val Val Glu
85 90 95
Leu Leu Thr Ala Trp Leu Pro Ala Leu Ala Ala Ala His Gln Pro Ala
100 105 110
Ala Val Val Ile Ser Ser Val Ala Ala Thr Gln Leu Ala Ala Asp Pro
115 120 125
Asn Pro Ile Ile Asn Ala Leu Leu Ala His Asp Glu Ala Ala Lys Ala
130 135 140
Arg Ala Ile Val Glu Leu Ala Gly Pro Gln Gln Ile Ala Tyr Ala Gly
145 150 155 160
Ser Lys Asn Ala Leu Ser Arg Trp Val Arg Lys Arg Ala Val Leu Ala
165 170 175
Ala Trp Gly Gly Ser Gly Val Arg Leu Asn Ala Ile Ala Pro Gly Ala
180 185 190
Ile Met Thr Pro Leu Leu Gln Ala Gln Leu Ser Asp Pro Arg Tyr Gly
195 200 205
Glu Ala Ile Arg Lys Phe Val Pro Pro Met Gly Arg Glu Phe Arg Ala
210 215 220
Glu Pro Ser Glu Leu Ala Ser Val Ile Ala Phe Leu Leu Ser Pro Ala
225 230 235 240
Ala Ser Tyr Val His Gly Ile Phe Val Asp Gly Gly Met Asp Ala Met
245 250 255
Met Arg Ala Asn Ser Phe
260
<210>2
<211>789
<212>DNA
<213>Pseudomonas putida
<400>2
atgagcacct acgccatcag cggcagcgcc accggcatcg gcgccgccgt gcgccagaag 60
ctggaggccg ccggccacac catcgtgaec atcgacatcc gcgacgccga gaagttcatc120
ctggccgacc tgagcaccgc cgagggccgc gcccaggcca tcgcccgcgt gctgagcaag180
tctagcaagg gcctggacgg cgccgtgctg tgcgccggcc tgggcccgag cccgcagcgc240
aaggtgctgg gcaacatcgt ggccgtgaac tacttcggcg tggtggagct gctgaccgcc300
tggctgccgg ccctggccgc cgcccaccag ccggccgccg tggtgatcag cagcgtggcc360
gccacccagc tggccgccga cccgaacccg atcatcaacg ccctgctggc ccacgacgag420
gccgccaagg cccgcgccat cgtggagctg gccggcccgc agcagatcgc ctacgccggc480
agcaagaacg ccctgagccg ctgggtgcgc aagcgcgccg tgctggccgc ctggggcggc540
agcggcgtgc gcctgaacgc catcgccccg ggcgccatca tgaccccgct gctgcaggcc600
cagctgagcg acccgcgcta cggcgaggcc atccgcaagt tcgtgccgcc gatgggccgc660
gagttccgcg ccgagccgag cgagctggcc agcgtgatcg ccttcctgct gagcccggcc720
gccagctacg tgcacggcat cttcgtggac ggcggcatgg acgccatgat gcgcgccaac780
agcttctga789
<210>3
<211>789
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<213>Pseudomonas putida
<400>3
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权利要求
1.一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其特征在于，所述3α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2.一种编码3α-羟基类固醇脱氢酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为编码权利要求1所述的3α-羟基类固醇脱氢酶的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为
(1)SEQ ID NO2所示的核苷酸序列；或者
(2)对SEQ ID NO2所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为
(1)SEQ ID NO2所示的核苷酸序列；或者
(1)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为权利要求2-3中任意一项所述的3α-羟基类固醇脱氢酶的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pET28b(+)。
7.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞含有权利要求5或6所述的重组载体。
8.根据权利要求7所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rosetta(DE3)或大肠杆菌DH5α。
9.一种检测胆汁酸浓度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下(a)-(d)中的至少一种
(a)权利要求1所述的3α-羟基类固醇脱氢酶；
(b)权利要求2-4中任意一项所述的3α-羟基类固醇脱氢酶的核苷酸序列；
(c)权利要求5或6所述的重组载体；
(d)权利要求7或8所述的重组宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括溶于pH 3.5-4.5的50-200mmol/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中的0.2-5g/L氧化型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；以及溶于pH 9.0-11.0的50-200mmol/L3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液中的2-10g/L的还原型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.1-10mmol/L的NaN3和2-20KU/L的3α-羟基类固醇脱氢酶。
全文摘要
本发明公开了一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。本发明还公开了编码所述3α-羟基类固醇脱氢酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，以及包括上述3α-羟基类固醇脱氢酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。本发明的3α-羟基类固醇脱氢酶最适温度高，耐热性好。
文档编号C12N15/63GK101698834SQ200910090688
公开日2010年4月28日 申请日期2009年9月8日 优先权日2009年9月8日
发明者不公告发明人 申请人:北京利德曼生化股份有限公司