一种总胆汁酸测定试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生化检测领域，具体的，涉及一种总胆汁酸测定试剂盒。
【背景技术】
[0002] 1974年挪威科明公司采用提纯的3a-羟类固醇脱氢酶（3a-HSD)成功地生产出 第一代胆汁酸酶法试剂，使胆汁酸的测定真正进入临床领域。此后，挪威科明和日本第一化 学将第一代试剂改进试剂组分，采用启动试剂，发展了第二代胆汁酸测定试剂，之后，日本 第一化学从假单胞菌属中提纯出的3-氧-5P-类留醇-A 4脱氢酶（A 4DH)与3a-HSD偶 联开发出第三代胆汁酸测定试剂盒。
[0003] 中国专利CN1281983申请公开了一种血清总胆汁酸测定试剂，该试剂是由含有硝 基四氮唑蓝、氧化型辅酶I、黄递酶、丙酮酸钠、磷酸盐的缓冲液构成的试剂I;和由含有 3a-HSD、人血清白蛋白、EDTA、磷酸盐缓冲液的溶液构成的试剂II组成。其测试原理是利用 3a-HSD，黄递酶将胆汁酸分子脱下的氢传递到硝基四氮唑蓝，后者还原后生成蓝色的化合 物，供比色检测分析。该专利中提供的试剂，采用黄递酶和硝基四氮唑蓝组合，易污染比色 杯及堵塞生化分析仪管道，其测定灵敏度也偏低，受血液中还原性物质及酶类的干扰严重； 且试剂为冻干粉制剂，试剂复溶后的稳定时间短，临床使用不方便。
[0004] 中国专利申请CN1378077A公开了 一种总胆汁酸测定方法和测定试剂，提供了 一种总胆汁酸测定的方法即酶循环法，其反应原理是利用3a-HSD和硫代氧化型辅酶 (Thio-NAD)特异性氧化胆汁酸，生成3-酮类固醇和还原性硫代氧化型辅酶（Thio-NADH); 在3a-HSD存在的条件下，3-酮类固醇和还原型辅酶I(NADH)又生成胆汁酸和氧化型 辅酶（NAD)每一次循环比原来的反应提高一倍的灵敏度，如此往复循环，从而放大微量 的胆汁酸，产生大量的水溶性非染料的硫代还原型辅酶I(Thio-NADH)，最后测定生成的 Thio-NADH的吸光度变化，测得胆汁酸的含量。
[0005] 该发明使用方便、消除干扰明显、灵敏度高，对生化仪器管道无污染，使其在胆汁 酸的准确、快速测定中有重要的意义。该发明中提供的试剂，在2_8°C开盖使用状态下，试剂 稳定的时间较短；在2-8°C度密闭避光存储的过程中，试剂稳定性不理想，随着放置时间的 延长，反应度会下降，试剂颜色由无色或淡黄色逐渐变成红色。
[0006] 因此有必要开发一种新的具有良好稳定性和检测准确性的总胆汁酸测定试剂盒。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有的总胆汁酸测定试剂存在的稳定性差的缺陷，提供一 种在2_8°C开盖使用状态下和在2_8°C度密闭避光存储条件下持续稳定的总胆汁酸测定试 剂盒。
[0008] 为达到以上目的，本发明提供了一种总胆汁酸测定试剂盒，所述试剂盒包括剂A 和试剂B，其中，试剂A的组成成分包括：Thio-NAD、缓冲液A、表面活性剂和稳定剂A;试剂 B的组成成分包括：3a-HSD、还原型辅酶I、表面活性剂、缓冲液B和稳定剂B;
[0009] 其中，所述缓冲液A选自由磷酸盐缓冲液、焦磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸 缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸缓冲液、2-N-吗啡乙磺酸缓冲液、咪唑缓冲液所组成的组中的 一种；
[0010] 所述缓冲液B选自由2-(环己胺）乙磺酸缓冲液、3-(环己胺）-1-丙磺酸缓冲液、 3-(环己胺）-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）-3-氨基丙烷磺酸缓冲液、3-三 羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液和三乙醇胺缓冲液所组成的组中的一种。
[0011] 可选的，所述表面活性剂选自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚、 聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙 二醇醚所组成的组中的一种或两种；所述稳定剂A选自由NaCl、KC1、MgCl2、EDTA. 2Na和 EDTA. 2K所组成的组中的一种或多种。
[0012] 可选的，所述稳定剂B选自半胱氨酸、L-还原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽、 L-氧化型谷胱甘肽二钠盐、巯基乙醇、腺苷酸、鸟苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、腺苷 5' -二磷酸钠盐、腺苷5' -二磷酸钾盐、腺苷-3'，5' -环单磷酸钠盐、鸟苷-3'，5' -环单磷酸 钠盐、鸟嘌呤核苷-5' -二磷酸二钠、胞嘧啶核苷酸二钠、尿苷二磷酸二钠和牛血清白蛋白 所组成的组中的一种或多种。
[0013] 可选的，在所述试剂A中，Thio-NAD的浓度为0.01-10mmol/L，优选为0.5-5mmol/ L;缓冲液A的终浓度为5-500mmol/L，优选为10-100mm〇l/L;表面活性剂的浓度按质量体 积百分含量计为0. 05-20 %，优选为2-10% ;稳定剂A的浓度为0.l-20g/L，优选为I-IOg/ L0
[0014] 可选的，在所述试剂B中，3a-HSD的浓度为0.5-100KU/L，优选为5-20KU/L;还原 型辅酶I的浓度为〇. 〇l-l〇g/L，优选为0. 5-6g/L;缓冲液B的终浓度为5-500mmol/L，优选 为10-100_〇1/1;表面活性剂的浓度以质量体积百分含量计为0.05-20%，优选为1-15%; 稳定剂B的浓度为l-20g/L，优选为3-15g/L。
[0015] 可选的，所述试剂A的pH为3. 0-5. 5,试剂B的pH为8. 5-10. 0。
[0016] 可选的，缓冲液A为甘氨酸缓冲液和2-N-吗啡乙磺酸中的至少一种；表面活性 剂为聚氧乙烯十二烷基醚和聚乙二醇对异辛基苯基醚中的至少一种；稳定剂A为MgCljP EDTA. 2Na中的至少一种；
[0017] 可选的，所述缓冲液B为N-三（羟甲基）-3_氨基丙烷磺酸或3-三羟甲基甲 胺-2-羟基丙磺酸，所述稳定剂B为腺苷-3'，5' -环单磷酸钠盐、鸟苷-3'，5' -环单磷酸 钠盐和半胱氨酸中的至少一种。
[0018] 可选的，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品的组成成分包括基质、纯品及稳定 剂C;其中，所述基质为缓冲液A、缓冲液B、人血清、牛血清、牛血清白蛋白中的一种或多种； 所述纯品为胆酸钠、脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、甘氨脱氧胆酸钠、甘氨鹅脱氧 胆酸钠、牛黄胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠和牛黄鹅脱氧胆酸钠中的一种或多种；所述稳定剂C 为MgCl2、NaCl、KCl、CaCl2、螯合剂EDTA类、聚乙二醇类、二糖类和多元醇中的一种或多种。
[0019] 可选的，在所述校准品中，纯品的浓度为40-60ymol/L;稳定剂C的浓度为 1-lOOmmol/L;当所述基质中含有缓冲液时，缓冲液的浓度为5-500mmol/L;当所述基质中 含有人血清时，人血清的浓度按质量体积百分含量计为0. 5-90%;当所述基质中含有牛血 清时，牛血清的浓度按质量体积百分含量计为0. 5-90%;当所述基质中含有牛血清白蛋白 时，牛血清白蛋白的浓度按质量体积百分含量计为0. 5-60 %。
[0020] 可选的，所述校准品的pH为6. 0-10. 0,优选为6. 5-8. 5。
[0021] 可选的，所述试剂A和试剂B中还包括去干扰剂、抗氧化剂和防腐剂中的至少一 种。
[0022] 本发明还提供了所述的试剂盒在总胆汁酸的测定中的应用，包括，将待测样本、试 剂A、试剂B按照3yL:210yL:70yL的体积比（可根据试剂中主要成分的浓度和检测仪器 的不同，按比例进行用量的调整）混匀后静置60-120秒，在测试温度37°C、主波长405nm、 副波长660nm下，使用纯化水和校准品进行线性校准，测量待测样本中总胆汁酸的浓度。
[0023] 通过上述技术方案，本发明所提供的总胆汁酸测定试剂在2_8°C开盖使用状态下 的稳定时间可以达到20-30天。在2-8°C密闭避光存储过程中的稳定时间可以达到10-15 个月。
【具体实施方式】
[0024] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给 出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在 不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0025] 本发明提供了一种总胆汁酸测定试剂盒，所述试剂盒包括：试剂A和试剂B，其中， 试剂A的组成成分包括：Thio-NAD、缓冲液A、表面活性剂和稳定剂A;试剂B的组成成分包 括：3a-HSD、还原型辅酶I、表面活性剂、缓冲液B和稳定剂B;
[0026] 其中，所述缓冲液A选自由磷酸盐缓冲液、焦磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸 缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸缓冲液、2-N-吗啡乙磺酸缓冲液、咪唑缓冲液所组成的组中的 一种；
[0027] 所述缓冲液B选自由2-(环己胺）乙磺酸缓冲液、3-(环己胺）-1-丙磺酸缓冲液、 3-(环己胺）-2_羟基-1-丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）-3_氨基丙烷磺酸缓冲液、3-三 羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液和三乙醇胺缓冲液所组成的组中的一种。
[0028] 在本发明的一种优选的实施方式中，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品的组 成成分包括基质、纯品及稳定剂C;其中，所述基质为缓冲液A、缓冲液B、人血清、牛血清、牛 血清白蛋白中的一种或多种；所述纯品为胆酸钠、脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、 甘氨脱氧胆酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸钠、牛黄胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠和牛黄鹅脱氧胆酸钠中 的一种或多种；所述稳定剂C为MgCl2、NaCl、KCl、CaCl2、螯合剂EDTA类、聚乙二醇类、二糖 类（例如：山梨