专利名称：：一种血清总胆汁酸的测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种测定血清中总胆汁酸的方法，具体涉及一种采用电化学发光测定血清中总胆汁酸的分析方法，属于临床生化分析领域。
背景技术：
：胆汁酸(bileacid，BA)是内源性胆固醇在肝脏内的主要代谢产物，是胆汁中存在的一类胆烷酸的总称，以钠盐或钾盐的形式存在，目前认为血清总胆汁酸水平是唯一可同时反映肝脏分泌，肝脏合成与代谢以及肝细胞损伤三方面的血清学指标。肝脏疾病时肝细胞受损可引起胆汁酸合成及排泄障碍，肝细胞内胆固醇7a-羟化酶及12a_羟化酶活力降低，胆汁酸的合成明显减少。肝细胞摄取胆汁酸功能障碍，使胆汁酸从血中的清除速率减慢，导致血中胆汁酸的浓度升高，尿中胆汁酸的排出量可达正常人的10倍以上。胆汁酸的毒性作用又加重肝细胞损害，使肝功能进一步恶化。体内胆汁酸盐不足，影响脂类和脂溶性维生素的吸收和代谢，可发生乳糜泻及暗适应障碍等。在淤胆时，小肠和肾脏上皮转运体通过调整，减少对胆汁酸的吸收，而在尿液中的排泄增加；同时，肝细胞通过核受体调节，使胆盐转运体改变，同时产生细胞因子，减少肝内胆盐的积蓄，减轻肝损伤。临床发现，总胆汁酸的测定与谷草转氨酶，谷丙转氨酶等生化检查项目有同等的诊断效率，且体内总胆汁酸在反映肝功能改变上早于其它生化检查的变化，更具有特异性和灵敏性，是反映肝胆功能的重要指标。目前检测总胆汁酸的方法有气相色谱、高效液相色谱、毛细管电泳(CE)和酶循环放大法。不管是气相或液相色谱法测定总胆汁酸都需要衍生和水解，较为繁琐，不适合临床检测。目前有关胆汁酸的CE检测大都采用紫外检测，检测灵敏度较低，使其应用受到限制。而临床使用的酶循环放大法测定总胆汁酸成本较高，且灵敏度也有待进一步提高。
发明内容本发明的目的是提供一种血清总胆汁酸的测定方法，本发明方法是采用毛细管电泳_酶促电化学发光测定总胆汁酸，本发明测定方法可达到快速简便地测定血清中的总胆汁酸，适合用于临床诊断与监测；且灵敏度高，可实现微量样品的痕量测定分析；同时可实现酶和试剂的多次重复使用、成本低。本发明的目的是这样实现的—种血清总胆汁酸的测定方法，其特征在于毛细管电泳血清样品聚集胆汁酸，进入柱端检测池的胆汁酸在氧化型辅酶I(NAD)+共存下经3a-类固醇脱氢酶(3a-HSD)催化脱氢，同时NAD+被还原为还原型辅酶I(NADH)；而生成的NADH在恒电位作用下被三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)氧化为NAD+，同时释放出光子被记录，从而按常规定量总胆汁酸。上述检测池为柱端检测池，上述三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)的浓度为35mmol/L，上述3a类固醇脱氢酶(3a-HSD)活性为150200U/L，上述氧化型辅酶I(NAD+)存在于7075mmol/LpH7.88.0的磷酸盐缓冲液中，其在所述缓冲液中的浓度为603150nmol/L。上述检测池采用三电极工作体系，其中工作电极为直径500iim的钼圆盘电极，辅助电极为直径1mm的钼丝对电极，参比电极为直径300iim的Ag/AgCl参比电极(内充饱和KC1溶液)，检测电压1.171.18V，光电倍增管高压为-700V。上述血清样品是将血清用水稀释后采用电动进样至毛细管内，其进样电压为10KV，进样时间为60s。上述毛细管为开口石英毛细管，其内径为25iim，外径为365iim，总长度50cm，有效长度为45cm。胆汁酸通过毛细管电泳聚集，所述毛细管电泳的运行缓冲液为含5lOnmol/LNAD+的46mmol/LpH7.07.2的磷酸盐缓冲液，运行电压15KV，运行时间400s。具体地说上述柱端检测池采用传统的三电极体系工作电极为直径为500iim的钼圆盘电极，辅助电极为直径为1mm的钼电极，参比电极为直径为300ym的Ag/AgCl电极(内充饱和KC1溶液)，通过检测池的定位螺丝将毛细管和工作电极准直，调节毛细管与电极之间的距离约150ym。将电化学发光检测池放入发光检测仪的暗盒中，使透光窗正对光电倍增管，Ru(bpy)32+的电化学发光被光电倍增管收集并转换为电信号记录下来。检测池中为7075mmol/L,pH7.88.0的磷酸盐缓冲液，内含35mmol/L的Ru(bpy)32+，150200U/L的3a-HSD，60150nmol/L的NAD+。检测池内容物每3h更换一次，以减小溶液蒸发和反应产物对检测的影响。开口石英毛细管内径为25iim，外径为365iim，总长度50cm，有效长度为45cm。毛细管电泳的运行缓冲液为含510nmol/L的NAD+的46mmol/LpH7.07.2的磷酸盐缓冲液。每次实验前分别用0.lmol/LNaOH、纯水、运行缓冲液冲洗20min，毛细管进样端放入运行缓冲液中，打开电化学分析仪和发光分析仪，待发光信号基线稳定后采用电动进样方式在10KV电压下进样60s，然后施加15KV的电泳高压400s进行分离检测，光电倍增管负高压为700V。恒电位设为1.171.18V。实验室恒温25°C。两次进样电泳间依次用纯水、运行缓冲液冲洗毛细管3min。本发明的各种特征如下本发明采用已商品化的多参数电化学发光测定分析装置，实施总胆汁酸的测定和研究。本发明使用的酶类3a-HSD、NAD+，Ru(bpy)32+均已商品化。本发明的有益效果是(1)本发明显著降低了贵重酶试剂，化学试剂和生物样本用量，减少废液，显著提高灵敏度，实现不连续的批量临床样品快速测定。(2)本发明将CE技术的分离能力和Ru(bpy)32+电化学发光(ECL)的高灵敏度检测相结合，以酶促反应和进行胆汁酸的柱后衍生，建立了CE-ECL定量总胆汁酸的新方法，本发明兼备了ECL分析高灵敏度和CE分离能力强的特点，具有检测限低、分离速度快、取样体积小、溶剂消耗少和样品预处理简单等优点，无疑是一种更理想的总胆汁酸测定方法。(3)用电化学发光代替常规的可见光测定，实现微量样品酶促电化学发光分析；(4)酶在三电极体系中可以重复使用多次，克服了常规情况下酶被进样量稀释后不稳定的弱点，能大大节约酶、辅酶和其它化学试剂的用量，显著降低了实验成本和化学废4液，有利于临床推广；(5)本发明无须对样品进行前处理，可以实现直接测定，操作简便；(6)本发明试剂种类少，可以进行不连续的批量的临床样品测定；本发明可用于生物样品的总胆汁酸测定，适用于临床肝胆疾病的快速筛查和诊断。图1为本发明使用的多功能发光检测器的暗盒示意中1毛细管、2光电倍增管、3参比电极、4工作电极、5检测池、6辅助电极图2为本发明考察检测池中缓冲溶液的pH对ECL强度影响的曲线3为本发明考察检测池中缓冲溶液浓度对ECL强度影响的曲线4为本发明考察检测池中Ru(bpy)32+浓度对ECL强度影响的曲线5为本发明考察检测电压对ECL强度影响的曲线6为本发明考察检测池中3a-HSD酶活性对ECL强度影响的曲线7为本发明考察检测池中NAD+浓度对ECL强度影响的曲线8为本发明考察运行缓冲液pH对ECL强度影响的曲线9为本发明考察运行缓冲液浓度对ECL强度影响的曲线10为本发明考察运行缓冲液中NAD+的浓度对ECL强度的影响图11为本发明胆汁酸标准品与血清CE电泳图谱具体实施例方式结合附图对本发明的实施例作进一步描述实施例1本实施例是考察检测池中缓冲溶液pH对ECL信号的影响。实验条件将电化学发光检测池放入发光检测仪的暗盒中，使透光窗正对光电倍增管(如图1)，光电倍增管高压为-700V。该电化学发光检测池采用三电极体系工作电极为直径为500um的钼圆盘电极，辅助电极为直径为1mm的钼电极，参比电极为直径为300iim的Ag/AgCl电极(内充饱和KC1溶液)，检测电压1.17V。开口石英毛细管内径为25iim，外径为365iim，总长度50cm，有效长度为45cm。运行缓冲液为含5nmol/LNAD+的5mmol/LpH7.0的PBS。毛细管进样端放入运行缓冲溶液中，打开电化学分析仪和发光检测仪，待发光信号基线稳定后采用电动进样方式，在10KV电压下进样60s，分离电压15KV。检测池中为75mmol/L的PBS，含5mmol/LRu(bpy)32+,167U/L3a-HSD,70nmol/LNAD+。在5.59.0范围内改变PBS的pH值，结果见图2。PBS的pH7.88.0时，可获得最大的ECL强度。实施例2本实施例是考察检测池中PBS浓度对ECL信号的影响。基于以上条件，缓冲溶液pH值设定为8.0，在25lOOmmol/L范围内改变缓冲溶液的浓度，考察其对ECL强度的影响，结果如图3。当磷酸盐浓度不超过75mmol/L时体系ECL强度随缓冲溶液浓度增加而增大，并且信号稳定性良好；浓度过大时，焦耳热效应加剧，ECL强度虽增加，但峰形明显展宽、信噪比变小。因此实验选择检测池中磷酸盐缓冲液的浓度为7075mmol/L。实施例3本实施例是考察检测池中Ru(bpy)32+浓度对ECL强度的影响。基于以上条件，在120mmol/L范围内改变Ru(bpy)32+浓度，考察Ru(bpy)32+浓度对本发明灵敏度的影响，如图4所示。ECL强度随着Ru(bpy)32+浓度的增加而增强，当浓度超过5mmol/L时，发光信号强度降低。检测池中Ru(bpy)32+设定为35mmol/L。实施例4本实施例是考察检测电压对ECL强度的影响。其它实验条件同实施例1，检测电压在1.053.0V范围变化，考察检测电压对ECL强度的影响，结果如图5所示。当检测电压在1.151.20V之间时，电化学发光强度达到较大值，且噪音也较低，设定恒电压为1.171.18V。实施例5本实施例是考察检测池中3a-HSD酶活性对ECL强度的影响。其它实验条件同实施例1。在20850U/L范围内改变3a-HSD酶浓度，考察3a-HSD酶对本发明灵敏度的影响，结果见图6。在100400U/L范围内ECL信号都较高且稳定，但考虑到进样后溶液的稀释和蒸发，应该适当增加酶浓度，故选择3a-HSD酶用量为150200U/L。实施例6本实施例是考察检测池中NAD+浓度对ECL强度的影响。在10500nmol/L范围内改变NAD+浓度，考察NAD+浓度对本发明灵敏度的影响，结果如图7所示。NAD+的浓度在50500nmol/L范围内均可以保证反应的进行，过多的NAD+会降低ECL强度。故NAD+的用量选择60150nmol/L。实施例7本实施例是考察运行缓冲液的pH对ECL强度的影响。运行PBS的pH值在4.010.0范围内对毛细管电泳分离和ECL检测强度的影响，结果如图8所示。当磷酸盐pH值为7.0时，体系的ECL信号最强，电泳峰形状好，pH值低于6.0时没有ECL信号。本发明选择运行缓冲液的pH为7.07.2。实施例8本实施例是考察运行缓冲液浓度对ECL强度的影响。在175mmol/L范围内改变运行缓冲液即磷酸盐浓度，考察缓冲液浓度对本发明灵敏度的影响，结果如图9所示。保持pH值不变的条件下，浓度较高时，电泳峰略高，但峰形变差且噪音较大。随着缓冲液浓度降低，峰形变好且噪音变弱。故本实验运行缓冲液即磷酸盐浓度为5lOmmol/L。实施例9本实施例是考察运行缓冲液中NAD+的浓度对ECL强度的影响。在运行缓冲液中添加NAD+是为了胆汁酸在柱端发生酶促反应时与辅酶NAD+已充分混合，利于反应的完成。实验表明NAD+会出现过载或不足的情况。NAD+过载时易引起毛细管的堵塞，而NAD+不足反应又不能进行完全，其结果见图10，选择运行缓冲液中NAD+为46nmol/L。实施例10本实施例是考察本发明的回收率，取含胆汁酸浓度为低值和高值的二份血清样品，按样品标准=91的体积比，在二份血清中分别加入高、中、低浓度的甘氨胆酸(glycocholicacid,GCA)标准溶液，进行回收率实验，结果见表1。本发明的加标回收率在91.5%102.3%之间，表明本发明测定血清的胆汁酸浓度是准确可靠的。表1回收率(n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例11本实施例是为了考察本发明的抗干扰能力，干扰物质为血清标本中常见的溶血和黄疸。按照美国国家临床实验室标准委员会制定的干扰试验的评价方案进行，即测定未加胆红素标准品的血清总胆汁酸浓度(Xc)和加入胆红素标准品后的胆汁酸浓度(XT)，干扰值(=XT-Xc)在本发明方法的1.96S(即95%可信度)范围内为无显著干扰(用N表示)，如干扰值超过1.96S，即为有显著干扰(用I表示)。得到20i!mOl/L胆汁酸所能容忍的干扰浓度为850iimol/L胆红素和16.3g/L血红蛋白，结果见表2。表2干扰物质对总胆汁酸测定的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求一种血清总胆汁酸的测定方法，其特征在于毛细管电泳血清样品聚集胆汁酸，进入柱端检测池的胆汁酸在氧化型辅酶I(NAD+)共存下经3α-类固醇脱氢酶(3α-HSD)催化脱氢，同时NAD+被还原为还原型辅酶I(NADH)；而生成的NADH在恒电位作用下被三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)氧化为NAD+，同时释放出光子被记录，从而按常规定量总胆汁酸。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述检测池为柱端检测池，所述三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)的浓度为35mmol/L，所述3α-类固醇脱氢酶(3α-HSD)活性为150200U/L，所述氧化型辅酶I(NAD+)存在于7075mmol/LpH7.88.0的磷酸盐缓冲液中，其在所述缓冲液中的浓度为60150nmol/L。3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述检测池采用三电极工作体系，其中工作电极为直径500μm的钼圆盘电极，辅助电极为直径Imm的钼丝对电极，参比电极为直径300μm的Ag/AgCl参比电极(内充饱和KCl溶液)，检测电压1.171.18V，光电倍增管高压为-700V。4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述血清样品是将血清用水稀释后采用电动进样至毛细管内，其进样电压为10KV，进样时间为60s。5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述毛细管为开口石英毛细管，其内径为25μm,外径为365μm,总长度50cm，有效长度为45cm。6.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于胆汁酸通过毛细管电泳聚集，所述毛细管电泳的运行缓冲液为含510nmol/LNAD+的46mmol/LpH7.07.2的磷酸盐缓冲液，运行电压15KV，运行时间400s。全文摘要一种血清总胆汁酸的测定方法，其特征在于毛细管电泳血清样品聚集胆汁酸，进入柱端检测池的胆汁酸在氧化型辅酶I(NAD)+共存下经3α-类固醇脱氢酶(3α-HSD)催化脱氢，同时NAD+被还原为还原型辅酶I(NADH)；而生成的NADH在恒电位作用下被三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)氧化为NAD+，同时释放出光子被记录，从而按常规定量总胆汁酸。本发明方法显著降低了贵重酶试剂，化学试剂和生物样本用量，减少废液，显著提高灵敏度，实现不连续的批量临床样品快速测定。文档编号G01N27/447GK101825609SQ201010145678公开日2010年9月8日申请日期2010年4月14日优先权日2010年4月14日发明者丁敏,张晓清,王箭,邓文平申请人:重庆医科大学