专利名称：胆汁酸结合剂、血清胆固醇量降低剂以及使血清胆固醇量降低的方法
技术领域：
本发明涉及以具有胆汁酸结合能力的来源于蜂王浆的蛋白质作为有效成分的胆汁酸结合剂以及血清胆固醇量降低剂，还涉及使用该蛋白质降低血清胆固醇量的方法。
背景技术：
据世界卫生组织(WHO)统计，世界上排在第一位的死因是动脉硬化症等心血管疾病。认为血液中的LDL-胆固醇浓度过高是动脉硬化症的主要原因，为了改善胆固醇代谢， 急需研发出更有效的医药品以及功能性食品。近年来，有报道称通过摄取蜂王浆，可以改善高胆固醇血症(例如，参考非专利文献1 4)。此外，还有报道称蜂王浆中除了含有12 15%的一般性成分粗蛋白质以夕卜，还含有特殊成分10-羟基癸烯酸和蜂王浆抗菌蛋白(royalisin)，所述10-羟基癸烯酸可以使高脂血症大鼠血液中的甘油三酯、总胆固醇的量减少(例如，参考非专利文献5)。另一方面，公开了如下方法使用填充了结合有胆酸的载体的柱子作为胆汁酸结合型亲和色谱柱(用于具有胆汁酸结合能力的成分的亲和色谱柱)，将血清白蛋白分离的方法(例如，参考非专利文献6)；使用胆汁酸结合型亲和色谱柱，从大豆蛋白质中分离并鉴定具有胆汁酸结合能力的蛋白质的方法(例如，参考非专利文献7和8)等。现有技术文献非专利文献非专利文献1 =Nakajin,其他4人，生药学杂志，1982年，第36卷，第65-69页。非专利文献2 =Vittek, Experientia, 1995 年，第 51 卷，第 927-935 页。非专利文献 3 :Guo,其他 6 人，Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 2007 年，第 53 卷，第 345-348 页。4 :Kamakura, ^ftk 2 Α Journal of pharmacy and pharmacology, 2006 年，第 58 卷，第 1683-1689 页。非专利文献5 :Xu，其他 2 人，Zhong Yao Cai (Journal of Chinese medicinal materials)，2002 年，第 25 卷，第 346-347 页。非专利文献6 :Pattinson，其他2人，Journal of Chromatography，1980年，第 187 卷，第409-412页。非专利文献7 :Makino，其他4人，Agricultural and Biological Chemistry, 1988 年，第52卷，第803-809页。非专利文献8 :Minami，其他3人，Agricultural and Biological Chemistry, 1990 年，第M卷，第511-517页。
发明内容
发明要解决的问题
此外，蜂王浆(以下称作RJ)是从工蜂的下咽头腺和大颚腺分泌的乳白色胶状营养物质。蜂王浆是女王蜂幼虫的唯一食粮，含有各种维生素类、矿物质、糖类、氨基酸、蛋白质成分，营养价值非常高。此外，虽然未经科学证明，但一直以来被认为具有疲劳恢复作用、 抗过敏作用、抗癌作用、增强免疫力作用等多种药理作用，被广泛用作营养补品、医药品原料等。因此，通过将RJ来源的成分作为有效成分，期待能够研发出用于预防/改善高胆固醇血症的安全的新食品、医药品。RJ中含有各种成分，因此，为了研发新的医药品、功能性食品，RJ中有效成分的确定是不可或缺的。然而，在非专利文献1 4中，可以明确RJ本身对胆固醇血症具有改善效果，但对于其有效成分却完全不明确，其作用机制也是未知的。本发明的目的在于提供一种以RJ中含有的特定成分作为有效成分的胆汁酸结合剂以及使用该特定成分使血清胆固醇量降低的方法，所述特定成分具备胆汁酸结合能力、 高胆固醇血症改善能力。解决问题的方法为了解决上述问题，本发明人等进行了深入的研究，使用胆汁酸结合型亲和色谱柱从RJ中确定了多个具有胆汁酸结合能力的成分，并对这些成分的胆汁酸结合能力、对血清胆固醇的影响进行了研究，从而完成了本发明。gp，本发明提供(1) 一种胆汁酸结合剂，其特征在于，以选自MRJPl、MRJP2和MRJP3中的一种以上作为有效成分。(2) 一种血清胆固醇量降低剂，其特征在于，以MRJPl作为有效成分。(3) 一种胆固醇胶束的溶解抑制剂，其特征在于，以MRJPl作为有效成分。(4) 一种使血清胆固醇量降低的方法，其特征在于，口服摄取MRJP1。发明的效果对于本发明的胆汁酸结合剂、使血清胆固醇量降低的方法，可以通过口服RJ来源的胆汁酸结合剂，安全地使血清胆固醇量降低。因此，期待本发明的胆汁酸结等，对于血清中胆固醇量增加引起的疾病，特别是高胆固醇血症、动脉硬化症等具有预防/治疗效^ ο
图1为图表，表示的是在参考例1中，通过使用了胆汁酸结合型亲和色谱柱的柱色谱对BSA溶液和卵清蛋白(Ovalbumin)溶液进行分级时，各级分的迁移率和280nm的吸光度之间的关系。图2为图表，表示的是在实施例1中，通过使用了胆汁酸结合型亲和色谱柱的柱色谱对RJ蛋白质溶液进行分级时，各级分的迁移率和^Onm的吸光度之间的关系。图3表示的是在实施例1中，通过使用了胆汁酸结合型亲和色谱柱的柱色谱对 RJ蛋白质溶液进行分级，并将所得各级分进行10%的SDS-PAGE后得到的CBB染色图像。
图4为图表，表示的是在实施例2中，通过凝胶过滤色谱对RJ蛋白质溶液进行分级时，各级分的迁移率和^Onm的吸光度之间的关系。 图5表示的是在实施例2中，由标准品的迁移率和分子量得到的校正曲线的图。
图6表示的是在实施例2中，通过将分子量约为290kDa的级分进行15%的 SDS-PAGE后得到的CBB染色图像。图7表示的是在实施例2中，通过将分子量约为51kDa的级分进行15 %的 SDS-PAGE后得到的CBB染色像图。图8为图表，表示的是在实施例2中，通过阴离子色谱对分子量约为51kDa的级分进行分级时，各级分的迁移率和^Onm的吸光度之间的关系。图9表示的是在实施例2中，对通过阴离子色谱得到的峰1 4进行15%的 SDS-PAGE后得到的CBB染色图像。图10表示的是在实施例2中，通过胆汁酸结合能力试验计算出的与各分子结合的胆汁酸的比例。图11表示的是在实施例3中，胆固醇在胶束中的溶解比例。图12表示的是在实施例4中，向大鼠口服给药MRJPl的试验概要图。图13表示的是在实施例4中，向大鼠口服给药MRJPl的试验中，各大鼠组的体重变化图。 图14表示的是在实施例4中，向大鼠口服给药MRJPl的试验中，各大鼠组每日摄食量的图。图15表示的是在实施例4中，向大鼠口服给药MRJPl的试验中，各大鼠组的肝脏
重量的图。图16表示的是在实施例4中，向大鼠口服给药MRJPl的试验中，各大鼠组的血清总胆固醇量的图。图17表示的是在实施例5中，向大鼠口服给药MRJPl的试验中，各大鼠组的体重变化的图。图18表示的是在实施例5中，向大鼠口服给药MRJPl的试验中，各大鼠组每日摄食量的图。图19表示的是在实施例5中，向大鼠口服给药MRJPl的试验中，各大鼠组的肝脏
重量的图。图20表示的是在实施例5中，向大鼠口服给药MRJPl的试验中，各大鼠组的血清总胆固醇量的图。
具体实施例方式本发明的胆汁酸结合剂以选自MRJPl (Major royal jelly protein 1)、MRJP2和 MRJP3中的一种以上作为有效成分。如后文实施例所示，MRJPl、MRJP2和MRJP3是通过使用胆汁酸结合型亲和色谱柱，从RJ中首次分离/鉴定的胆汁酸结合蛋白质。使用了胆汁酸结合亲和色谱的胆汁酸结合蛋白质的分离/鉴定法，是本发明人首次应用于RJ的。MRJPl是占RJ中所含全部蛋白质的约39. 4%的蛋白质，MRJP2是占RJ中所含全部蛋白质的约21. 5%的蛋白质，MRJP3是占RJ中所含全部蛋白质的约21. 2%的蛋白质(泉宏树、米仓政实著。「α —〗J 一夕> /、1質Θ α歹才一 A解析」(“蜂王浆蛋白质的蛋白质组解析”)社团法人全国蜂王浆公平交易协会、平成20年度报告书(2008年)、 第21页)。公知MRJPl是由432个氨基酸形成的蛋白质，通常在SDS-PAGE中，其分子量约为 55kDa(J. khmitozova et.al，Cell. Mol. Life Sci.，vol54, pl020_1030 (1998))。 此外，在美利坚合众国的NCBI (国立生物工学信息中心)的序列数据库中，MRJPl注册为Accession编号NP_001011579。公知MRJP2是由452个氨基酸形成的蛋白质，通常在 SDS-PAGE 中，其分子量约为 49kDa(J. Schmitozova et. al, Cell. Mol. Life Sci.，vol54, P1020-1030 (1998)) ο 此外，MRJP2 在 NCBI 的 Accession 编号为 NP_001011580。MRJP3 是由 544个氨基酸形成的蛋白质，通常在SDS-PAGE中，其分子量为60 70kDa(J. Schmitozova et. al, Cell. Mol. Life Sci.，vol54，pl020_1030 (1998))。此外，MRJP3 在NCBI 的 Accession 编号为 NP_001011601。 以下，将上述蛋白质统称为“本发明的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质”。
进一步地，在本发明中，只要不损害MRJPl、MRJP2或MRJP3所具有的胆汁酸结合能力，MRJP1、MRJP2或MRJP3中的1 数个氨基酸可以缺失、被取代或被加成。上述氨基酸被加成等的蛋白质，也可以作为本发明胆汁酸结合剂的有效成分。例如，可以在MRJP1、MRJP2 或MRJP3的N末端、C末端分别加成1 10个，优选1 5个氨基酸。作为加成于本发明的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质的N末端、C末端的氨基酸序列，可以列举His-Tag等常规的用于生成重组蛋白的Tag序列等。在本发明的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质中，MRJPl除了具有胆汁酸结合能力以夕卜，还具有降低对胆固醇胶束的溶解作用，和降低血清胆固醇量的作用。即，本发明的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质适合用作胆固醇胶束的溶解抑制剂和血清胆固醇量的降低剂的有效成分。需要说明的是，由MRJPl中1 数个氨基酸缺失、被取代或被加成的氨基酸序列形成且具有胆固醇胶束的溶解抑制能力、血清胆固醇量降低能力的蛋白质，与MRJPl相同，也适合用作胆固醇胶束的溶解抑制剂和血清胆固醇量的降低剂的有效成分。食物来源的胆固醇，与卵磷脂、脂肪酸、胆汁酸等形成胶束，变为水溶性的，通过非搅拌水层(UWL)被小肠吸收。由所述胆固醇在小肠中的吸收机制，推测本发明的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质通过在小肠内与胆汁酸结合，可以抑制胆固醇胶束的形成，其结果，抑制胆固醇的吸收。作为本发明的胆汁酸结合剂、胆固醇胶束的溶解抑制剂以及血清胆固醇量降低剂 (以下，胆汁酸结合剂等)的有效成分的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质，可以是由RJ纯化的物质，也可以是通过基因重组技术在公知的表达体系中合成的重组蛋白，还可以是通过肽合成得到的合成品。例如，通过胆汁酸结合型亲和色谱对RJ蛋白质溶液进行分级时，回收含有RJ来源的胆汁酸结合蛋白质的级分。可以将上述回收的级分作为本发明的胆汁酸结合剂等有效成分。此外，通过凝胶过滤色谱对RJ蛋白质溶液进行分级时，回收含有MRJP1、 MRJP2或MRJP3的级分。可以将上述回收的级分作为本发明的胆汁酸结合剂等的有效成分。本发明的胆汁酸结合剂等，可以作为医药品、补充剂等饮食品单独摄入，也可以像其他的饮食用组合物、医药用组合物那样，作为饮食品、医药品的添加剂使用。本发明的胆汁酸结合剂等的剂型，没有特别的限定。可以是例如软胶囊剂、硬胶囊齐U、片剂、颗粒剂、散剂、液剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂等。用于细胞培养等时，优选干燥粉末、溶解在水、缓冲液等适当溶液中形成的液剂。另一方面，用于生物个体时，优选适于口服给药的剂型，进一步优选肠溶剂。本发明的胆汁酸结合剂等中含有的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质，可以仅是1种，
6也可以是2种以上的组合。此外，上述胆汁酸结合剂等中含有的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质的量，只要是能够发挥出该RJ来源的胆汁酸结合蛋白质的胆汁酸结合能力、胆固醇胶束溶解抑制能力或者血清胆固醇降低能力即可，并无特别限定，可以考虑RJ来源的胆汁酸结合蛋白质的种类、剂型等适当进行决定。本发明的胆汁酸结合剂等，可以仅由本发明的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质形成， 也可以含有其他成分。作为其他成分，只要不损害本发明的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质的活性即可，可以是任何成分，例如，可以含有除本发明RJ来源胆汁酸结合蛋白质以外的RJ 来源的成分，也可以含有具备胆汁酸结合能力、血清胆固醇降低能力的功能性肽。此外，本发明的胆汁酸结合剂等可以含有医药品、饮食品中可添加的成分，例如赋形剂、粘合剂、表面活性剂、抗氧化剂、PH调节剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、杀菌剂、着色剂、矫味矫臭剂等。例如，以选自MRJP1、MRJP2和MRJP3的1种以上作为有效成分的血清胆固醇量降低剂，优选进一步含有10-羟基癸烯酸作为有效成分。其中，优选以MRJPl和10-羟基癸烯酸作为有效成分的血清胆固醇量降低剂。如上所述，10-羟基癸烯酸具有降低高脂血症大鼠血液中的甘油三酯、总胆固醇的效果，通过与MRJPl等组合使用，可以实现更加显著地降低血清胆固醇的作用。对于血清胆固醇量降低剂中的MRJPl和10-羟基癸烯酸的含量，只要两者是能够各自发挥降低血清胆固醇作用的量即可，没有特别的限定，可以根据一天的摄取量等来确定。本发明的胆汁酸结合剂等的制造方法，只要是不损害含有的本发明的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质活性即可，没有特别的限定，通常，可以使用在制造含有功能性蛋白质的饮食用组合物或医药用组合物时所使用的方法。本发明的胆汁酸结合剂等的给药量，只要可以发挥出RJ来源的胆汁酸结合蛋白质的胆汁酸结合等活性即可，没有特别的限定，可以考虑RJ来源的胆汁酸结合蛋白质的种类、对象细胞的种类及状态、剂型、给药方法等适当进行确定。例如，用于培养细胞等生物个体外的细胞时，可以向培养液中添加本发明的胆汁酸结合剂或胆固醇胶束溶解抑制剂，使得培养液中的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质含量为IOmg 100mg/mL。在生物个体摄取时，本发明的胆汁酸结合剂等的摄取量，只要是可以发挥出该RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质的胆汁酸结合等活性的量即可，没有特别限定，可以根据摄取的人、动物的体重、年龄、性别、剂型等适当进行确定。例如，优选分为1次或数次来摄取，使得 RJ来源的胆汁酸结合蛋白质每天的摄取量为300mg lg/kg。通过口服摄取，本发明的胆汁酸结合剂等在生物体内与胆汁酸结合，进一步地使摄取的饮食中的胆固醇胶束溶解性降低，其结果，使血清胆固醇的量降低。因此，本发明的胆汁酸结合剂等，适宜对高胆固醇血症、动脉硬化症等由于血清的胆固醇量过剩等原因造成的疾病进行治疗、预防。本发明的降低血清胆固醇量的方法(以下叫做血清胆固醇量的降低方法)，其特征在于通过口服摄取选自MRJPl、MRJP2和MRJP3中的1种以上。口服摄取RJ来源的胆汁酸结合蛋白质的生物，只要是具有小肠、胆管等组织的动物即可，可以是人，也可以是小鼠、 大鼠、狗、猫、猿、牛等的除人以外的动物。实施例下文将通过实施例等对本发明进行更加详细的说明，本发明并不限定于以下的实施例。参考例1<胆汁酸结合型亲和色谱柱的制造>胆汁酸结合型亲和色谱柱，是以碳二亚胺作为间隔臂，将胆酸结合在作为柱载体的EAH-kpharose 4B上来制造的。胆汁酸结合型亲和色谱柱的制造方法，按照I^attinson 等的方法(非专利文献6)进行。具体而言，首先，使625mL的胆汁酸溶液(含作为间隔臂的33. 4mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(l-Ethyl-3-(3' -dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl)和3. 7mM的胆酸的50%乙醇溶液)在pH6. 4条件下相对于容量为50mL 的EAH-kpharose 4B载体反应16小时，使胆酸结合在载体上。然后，将用含有0. 5MNaCl 的50%乙醇对未吸附的过量的胆酸溶液进行洗涤后得到的物质填充至色谱柱内，制造胆汁酸结合型亲和色谱柱(色谱柱的柱床容量50mL)。需要说明的是，使用前，使用0. 02% NaN3 溶液对色谱柱进行平衡化。 <通过胆汁酸结合型亲和色谱柱进行分级>接着，通过使用BSA和卵清蛋白来确认制造的色谱柱对于具有胆汁酸结合能的化合物是否实际具备亲和性。从色谱柱洗脱的条件，按照7 ^ 7等的方法(非专利文献7)进行。首先，将1.5mg/mL的BSA溶液和卵清蛋白溶液应用于制造的胆汁酸结合型亲和色谱柱上。接着，使第1次洗涤液(0. 5M NaClUOmM Tris-HCl, pH 8. 0)通过该色谱柱，洗涤除去未吸附在该柱中的载体上的物质。接着，使洗脱液(0. 5%脱氧胆酸钠、IOmM Tris-HCl, PH8. 0)通过该柱，将与胆酸结合的蛋白质即具有胆汁酸结合能力的蛋白质洗脱。最后，使第 2次洗涤液(8M尿素、IOmM Tris-HCl,pH8. 0)通过该色谱柱，将非特异性地结合于该色谱柱上的物质洗脱。各级分的迁移率和^Onm的吸光度之间的关系如图1所示。在图1中，“⑴”为第1次洗涤液的级分，“ (2) ”为洗脱液的级分，“ (3) ”为第2次洗涤液的级分。其结果，卵清蛋白在第1次洗涤液级分中被洗脱，BSA在洗脱液的级分中被洗脱。由上述结果可知，制造的胆汁酸结合型亲和色谱柱与非专利文献7中记载的胆汁酸结合型亲和色谱柱相同，不吸附卵清蛋白，吸附BSA。[实施例1]<通过胆汁酸结合型亲和色谱柱对RJ蛋白质进行分级>使用参考例1中制造的胆汁酸结合型亲和色谱柱，对RJ蛋白质进行分级时，对具有胆汁酸结合能力的蛋白质进行分离、纯化。关于使用该胆汁酸结合型亲和色谱柱对RJ来源的胆汁酸结合蛋白质的分离纯化，目前为止还没有报道，其是一种非常高效的纯化方法。首先，制备RJ蛋白质溶液。具体而言，使用孔径为IOkDa的透析膜，对向RJ(中国产)中加入纯水得到的悬浊物通过纯水透析72小时。回收透析膜内液体，冷冻干燥后，再将其悬浊于含有NaR的Tris缓冲液(0. 2% NaN3^lOmM Tris-HCl (pH8. 0))中，制备 117mg/25mL的RJ蛋白质溶液(RJ的截断值为IOkDa)。接着，将RJ蛋白质溶液应用于参考例1中制造的胆汁酸结合型亲和色谱柱上以后，按照与参考例1相同的方式，依次使第1次洗涤液、洗脱液、第2次洗涤液通过该色谱柱。各级分的迁移率和^Onm的吸光度之间的关系如图2所示。在图2中，“(1)”、“(2)” 和“⑶”与图1相同。进一步地，回收由洗脱液洗脱的级分(图2中的“A”，以下称作“级分A”)。<通过胆汁酸结合型亲和色谱柱分离、纯化的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质的鉴定
>对通过胆汁酸结合型亲和色谱柱分离、纯化的RJ来源的胆汁酸结合蛋白质进行鉴定。首先，使用孔径为IOkDa的透析膜，在4°C条件下，以纯水对级分A进行透析、脱盐 72小时。回收透析膜内的液体，通过冷冻干燥，制备脱盐级分A。接着，将脱盐级分A提供至10 %的SDS-PAGE，分离出其中含有的蛋白质。SDS-PAGE 的结果如图3所示。在图3中，“std”意指分子量标准，“A”意指脱盐级分A，上述为分别使用的物质。在该结果的A栏中，在约49 75kDa范围内检测到3个条带(图3中(1) (3))。由该结果可知，脱盐级分A溶液中含有与胆汁酸结合的3种RJ来源的蛋白质。从SDS-PAGE的凝胶上将各条带切下来，还原烷基化以后，通过胰蛋白酶处理进行蛋白胶内酶解(In-gel digestion)。然后，对通过凝胶提取的肽片段进行脱盐纯化，使用 MALDI-T0F/MS进行质量分析。由该结果可以鉴定在图3中，条带(1)为MRJP3，条带O) 为MRJP1，条带(3)为MRJP2。对得到的SDS-PAGE的结果中的CBB染色图像进行图像解析 (Image J分析)时，上述3种蛋白质的比例为MRJP1为76%，MRJP2为22%，MRJP3为2%。[实施例2]测定由RJ分离纯化的MRJPl和MRJP2的胆汁酸结合能力。<将MRJPl从RJ分离纯化>首先，使用凝胶过滤色谱法从RJ中对MRJPl进行分离纯化。具体而言，首先，将5mL 的按照与实施例1相同方式制备的23. 5mg/5mL的RJ蛋白质溶液(RJ的截断值为IOkDa) 应用于HiLoad superdex 200p. g(GEhealthcare公司制造)上。然后，将洗脱液QOmM Na2HPO4. 20mM NaH2PO4150mM NaCl、pH7. 5)以洗脱速度 1. 5mL/min通过该色谱柱，以每5mL为一个级分进行回收。各级分的迁移率和^Onm的吸光度的关系如图4所示。此外，使用RJ 蛋白质溶液的同时，将36mg/ml的凝胶过滤标准品(Gel Filtration Standard) (BIO-RAD 公司制造)应用至该色谱柱上，研究迁移率(从洗脱开始的总洗脱量)和该级分中含有的分子的大小之间的关系，制作校正曲线。制作的校正曲线如图5所示。本发明人对从上述的胆汁酸结合型亲和色谱柱洗脱的复合体进行凝胶解析时发现，含量最多的是MRJPl级分。由图5中所示标准品的迁移率和分子量得到的校正曲线可知，图4中所示的凝胶过滤色谱中的级分B(级分B 图4中的虚线所包围的级分)的分子量接近于约290kDa。将该级分提供至15%的SDS-PAGE，如图6所示，在约55kDa的位置检测出单一的条带。此外，使用MALDI-T0F/MS对该级分中含有的分子进行质量分析，可以判定其为含有MRJPl的级分。由上述结果可以确认MRJP1约为55kDa，RJ中存在5 6聚体。 以下将该级分称作MRJPl级分。需要说明的是，通过定量可知在该MRJPl级分中不含有非专利文献5中所报道的可以降低高血脂症大鼠的血液中的甘油三酯、总胆固醇的10-羟基癸烯酸。<将MRJP2从RJ分离纯化>
本发明人对从上述的胆汁酸结合型亲和色谱柱洗脱的复合体进行凝胶解析时发现，其含量仅次于含量最多的MRJPl级分的级分是MRJP2级分。对图4中所示的凝胶过滤色谱中的级分E(级分E 图4中的点虚线所包围的级分)中所含有的蛋白质进行研究。由图5 中所示标准品的迁移率和分子量得到的校正曲线可知，该级分E的分子量接近于约51kDa。 将该级分E提供至15%的SDS-PAGE时，如图7所示，在约46 66kDa的位置检测出2条条
市ο此外，将该级分E提供至阴离子色谱，对单一的蛋白质进行纯化。具体而言，使用结合用溶液OOmM Tris-HCl、pH8. 0)将级分E稀释为125mg/5mL，然后将5mL应用于Hift^p Q FF(GE Healthcare 公司制造)。接着，使用洗脱液(20mM Tris-HCl、0· 5M NaCl、pH8.0)， 以图8中虚线所示的流动相中氯化钠浓度为0 0. 5M范围的梯度浓度施加流动相，使蛋白质洗脱。需要说明的是，流动相的流动速度为1.5mL/min。各级分的迁移率和280nm的吸光度之间的关系如图8所示。将图8中所示的峰 1 4分别提供至15%的SDS-PAGE时，如图9所示，检测出峰1至峰2为单一的条带。因此，将峰1和峰2合并回收，使用MALDI-T0F/MS对该级分中含有的分子进行质量分析，可以判定其为含有MRJP2的级分。以下将该级分称作MRJP2级分。<利用透析法进行胆汁酸结合试验>通过透析法对上述纯化了的MRJPl和MRJP2的胆汁酸结合能力进行评价。分别使用抗高胆固醇剂消胆胺作为阳性对照，使用酪蛋白作为阴性对照。具体而言，向含有牛磺胆酸的磷酸缓冲液(50mM牛磺胆酸、IOOmM磷酸缓冲液、 PH7. 4)中分别添加消胆胺、酪蛋白、MRJPl级分、MRJP2级分、或者将未经处理的RJ(生RJ) 冷冻干燥得到的物质，使其浓度分别为100mg/mL，将其作为反应溶液。将这些反应溶液于 37°C培养2小时后，在室温下透析72小时。通过测定透析膜外液中含有的总胆汁酸量，可以计算出透析膜内液体中含有(即，与各分子结合)的胆汁酸的比例。计算出的与各分子结合的胆汁酸的比例如图10所示。图10中的“htactRJ”是添加了将未经处理的RJ冷冻干燥后得到的物质的反应溶液的结果。其结果为与阴性对照组的酪蛋白(33% )相比，MRJPl的胆汁酸结合能力为46%，MRJP2的胆汁酸结合能力为 37%。S卩，MRJPl显示出比MRJP2更高的胆汁酸结合能力。[实施例3]〈胆固醇胶束溶解性试验>测定由RJ分离纯化的MRJPl和MRJP2对胆固醇胶束溶解的抑制能力。MRJPl和 MRJP2分别使用实施例2中制备的MRJPl级分和MRJP2级分。此外，使用酪蛋白作为阴性对照。首先，在20mL的玻璃管内取以下级分[4_14C]胆固醇/氯仿(Perkin Elmer Life Science公司制造)并使其最终浓度为3. 7kBq/mL(2. lGbq/mmol, NEN)，胆固醇(片山化学工业公司制造)/氯仿并使其最终浓度为2 μ M，油酸(SIGMA公司制造)/氯仿并使其最终浓度为20 μ Μ,单油酰反式甘油(MONO 0LE0YL-RAC GLYCEROL) (SIGMA公司制造)/氯仿并使其最终浓度为5 μ M，L- α -卵磷脂(SIGMA公司制造)/氯仿并使其最终浓度为0. 6mM,将其充分混合后，吹入氮气使其干燥。然后，将得到的干燥固体物溶解在含有6. 6mM的牛磺胆酸(SIGMA公司制造)和132mM的NaCl的15mM磷酸缓冲液(pH7. 4)中。使用旋涡混合器
10(vortex mixer)搅拌2分钟后，进行超声波处理(25W，输出功率6，3分钟)，然后在37°C — 边振荡一边进行培养M小时，制备[14C]胆固醇胶束溶液。在胆固醇胶束溶解性试验中，具体而言，向[14C]胆固醇胶束溶液中添加酪蛋白、 MRJP1、或MRJP2使其最终浓度为10mg/mL，并将其作为反应溶液。使用旋涡混合器对各反应溶液搅拌2分钟后，进行超声波处理(25W，输出功率6，3分钟)，然后在37°C培养1小时，接着，在37°C、100，000 Xg条件下，对380 μ L溶液进行离心分离1小时，并回收上清液。向回收的50 μ L上清液中加入IOmL乳化闪烁剂(乳化〉> f > 一夕一)，通过液体闪烁计数器测定上清液中的[14C]胆固醇。上清液中存在着在水溶液中稳定溶解的胆固醇胶束。因此， 通过上清液中的[14C]胆固醇量占反应溶液中预先添加的[14C]胆固醇量的比例，可以计算出在水溶液中稳定溶解的胆固醇胶束的比例。胆固醇在胶束中的溶解比例如图11中所示。通过Duncan多范围检验，以ρ <0. 05 对各试验区域进行统计学上的显著性差异检验处理。与阴性对照组的酪蛋白(79%)相比， MRJPl为46%，显著降低。与其相比，MRJP2为93%，显著增加。即，可以明确MRJPl具有胆固醇胶束溶解抑制能力。[实施例4]〈大鼠口服给药试验〉对作为高脂血症模型的摄取胆固醇的大鼠，口服给药从RJ分离纯化的MRJP1， 研究其对血清胆固醇带来的影响。MRJPl使用实施例2中制备的MRJPl级分。此外，使用酪蛋白作为阴性对照。如图12所示，在试验的3天时间里，向摄取含有胆固醇的食物的大鼠一天一次地口服给药MRJPl或酪蛋白。在第三次给药开始经过M小时后，禁食4小时，然后通过心脏采血将大鼠处死。使用采集的血液，测定血清胆固醇。进一步解剖，测定肝脏重量。其他的具体试验条件如下所示。试验组4周龄的Wistar系雄性大鼠(70g)试验组数η = 9开始给药时间AM8 00试验饲养时间3天(预饲养3天)禁食时间4小时试验样品酪蛋白钠(CS)或MRJPl (MR)给药量300mg/kg(B. W. ) / 天或 600mg/kg (B. W. ) / 天食物组成20%酪蛋白+1%胆固醇通过在3000rpm条件下进行离心分离15分钟来制备血清。使用酶法，具体而言使用市售的试剂盒(胆固醇Ε-test worker ；和光纯药工业公司制造)对血清胆固醇进行定量测定。同样地，使用HDL-胆固醇Ε-test worker (和光纯药工业公司制造)测定HDL-胆固醇。通过计算求出LDL+VLDL-胆固醇。各种测定结果等如图13 16所示。需要说明的是，各数值为1组9只的平均值士标准偏差，在试验结果的统计学分析中，使用Duncan多范围检验和Mudent’ s t检验。分别将各试验组的体重变化示于图13中，将每天的食物摄取量示于图14中，将肝脏重量示于图15中。其结果，在各组中，酪蛋白钠(CS)给药组和MRJPl (MR)给药组之间并未发现有显著性差异。另一方面，如图16所示，在300mg/kg(B. W.)/天的给药组和600mg/kg (B. W.) /天的给药组的任意给药组中，与酪蛋白钠(⑶)给药组相比，MRJPl(MR)给药组观察到了血清总胆固醇量降低的倾向。特别是600mg/kg(B.W.)/天的给药组，与酪蛋白钠(CS)给药组相比，MRJPl(MR)给药组的血清总胆固醇量显著(Duncan多范围检验和Mudent’ s t检验两者中的P < 0. 05)降低。由上述结果可知，通过口服给药分离纯化的MRJP1，可以使血清总胆固醇量降低。[实施例5]〈大鼠口服给药试验〉除了将试验组数设定为10只(n = 10)、试验饲养时间设定为7天(预饲养3天)、 给药量设定为600mg/kg(B. W.)/天以外，其它和实施例4相同，向高胆固醇血症的模型，即摄取1 %胆固醇的大鼠口服给药从MR分离纯化的MRJPl持续7天。研究对其血清胆固醇带来的影响。分别将各试验组的体重变化示于图17中，将每天的食物摄取量示于图18中，将肝脏重量示于图19中，将血清总胆固醇量示于图20中。需要说明的是，各数值为1组10只的平均值士标准偏差，在试验结果的统计学分析中，使用Mudent’ s t检验。其结果，在体重的变化、每天的食物摄取量、以及肝脏重量方面，酪蛋白钠(CS)给药组和MRJPl(MR)给药组未见明显差异。另一方面，与酪蛋白钠(CS)给药组相比，MRJPl (MR)给药组的血清总胆固醇量显著(约)降低(Student's t检验中，ρ < 0. 05)。特别是血清LDL胆固醇和血清VLDL 胆固醇的总量显著降低。由上述结果可知，通过口服给药分离纯化的MRJPl持续7天，可以使血清总胆固醇量降低。工业实用性降低本发明的胆汁酸结合剂、血清胆固醇量的方法，可通过口服给药RJ来源的胆汁酸结合剂，使血清胆固醇的量安全地降低。因此，本发明的胆汁酸结合剂等，可以作为治疗、预防特别是高胆固醇血症、动脉硬化症的医药、功能性食品等的有效成分。
权利要求
1.一种胆汁酸结合剂，其以选自MRJPl、MRJP2和MRJP3中的一种以上作为有效成分。
2.一种血清胆固醇量降低剂，其以MRJPl作为有效成分。
3.—种胆固醇量胶束的溶解抑制剂，其以MRJPl作为有效成分。
4.一种使血清胆固醇量降低的方法，该方法包括口服摄取MRJP1。
全文摘要
本发明提供一种以RJ中含有的特定成分作为有效成分的胆汁酸结合剂以及使用该特定成分使血清胆固醇量降低的方法，所述特定成分具备胆汁酸结合能力、高胆固醇血症改善能力。本发明提供一种胆汁酸结合剂，其特征在于，以选自MRJP1、MRJP2和MRJP3中的一种以上作为有效成分；本发明提供一种血清胆固醇量降低剂，其特征在于，以MRJP1作为有效成分；本发明提供一种胆固醇量胶束的溶解性降低剂，其特征在于，以MRJP1作为有效成分；本发明提供一种使血清胆固醇量降低的方法，其特征在于，口服摄取MRJP1。
文档编号A23L1/305GK102451464SQ20111032543
公开日2012年5月16日 申请日期2011年10月24日 优先权日2010年10月26日
发明者中村正, 兼松智, 加岛优里, 后藤刚, 川岛拓司, 渡边铃代, 草田未央, 长冈利 申请人:国立大学法人岐阜大学, 株式会社秋田屋本店