专利名称：总胆汁酸的定量测定及测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及总胆汁酸(TBA)的定量测定方法、试剂及试剂盒。
背景技术：
胆汁酸是在肝脏从胆固醇生成的24-碳类固醇化合物，在人体液中的胆汁酸主要有五种形式胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、和熊脱氧胆酸。这些胆酸合起来称为总胆汁酸(TBA)。血清胆汁酸水平是反映肝实质损伤的一个重要指标。餐后TBA测定对检出轻度肝脏病变的灵敏度优于所有其他肝功能试验。对检测酒精或工业化学品引起的肝细胞损伤的灵敏度优于其它肝功能试验。大多数胆汁酸测定方法在测定前需有分离提取步骤，这是因为胆汁酸的不溶性、 多型性和以多种结合状态存在于体液中等因素。常用的分离方法包括采用有机溶剂和中性树脂提取，阴离子交换层析方法等，但这些方法都有较多的缺陷，如不易将所有各种不同形式的胆汁酸同时全部提取与分离，实验费时，操作繁琐，而且无法进行自动化测定因而不适合在临床实验室应用。而且由于一般情况下血清中的胆汁酸含量较低，上述方法重复性与准确性也往往达不到要求。胆汁酸作为从胆固醇转化形成的类固醇，其分子上3 α -羟基对3 α -羟类固醇脱氢酶(3 α -HSD)的酶催化作用比较敏感，胆汁酸C3上α位的羟基在3 α -HSD的作用下脱氢形成羰基，此酶促反应的辅酶是氧化型辅酶I (NAD+)，反应后NAD+作为受氢体转化成还原型辅酶I (NADH)。根据这一酶法反应的原理发展出几种可以适合临床实验室进行胆汁酸分析的方法，其一是直接检测NAD+向NADH的转变，但因血清样品中胆汁酸的含量较低而不易准确测定；其二是在上述单一酶促反应基础上增加另一电子受体如刃天青，刃天青接受 NADH的递氢作用后可被激发出荧光，但此法需要特殊的荧光分光光度计且不能进行自动分析；其三是在上述单一酶促反应基础上增加另一个酶(黄递酶)和另一个受氢体(硝基四氮唑蓝ΝΒΤ)，NBT受氢后生成有色物质，可以用比色法测定，但也存在检测灵敏度与准确性的问题，且因需要用磷酸或盐酸中止反应，所以也难以自动化分析；虽然后来对上述第三种方法作了改进后也发展出可以进行自动分析的方法，但由于血清中总胆汁酸(TBA)的浓度较低，而且血清中存在的干扰物质对测定结果的影响相对较大，例如一个主要的干扰因素是血清中存在的乳酸脱氢酶(LDH)，由于LDH催化的反应生成的NADH往往比TBA生成的量要大得多，对测定结果有明显的正干扰，导致测定结果偏高。血清样品中存在的其他脱氢酶和还原性物质也会产生正干扰，同样导致测定结果偏高。后来发展了测定TBA的第五代循环酶法。此法的反应体系中引入辅酶I的一种硫代衍生物，也有氧化型和还原型，即氧化型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)和还原型β -硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)。所谓循环酶法，其反应过程的原理如下胆汁酸被3 α -羟类固醇脱氢酶(3 α -HSD)氧化，生成3_酮类固醇，脱下的氢被 Thio-NAD接受，使Thio-NAD转化为Thio-NADH ；同时在反应体系中还存在NADH时，3 α -HSD又催化逆向反应，使正反应生成的3-酮类固醇又氧化成为胆汁酸，完成一个循环。经如此反复循环的酶反应，Thio-NADH的生成量不断增大，在一定时间内，酶循环产生的β -硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(Thio-NADH)量与样品中胆汁酸浓度成正比。Thio-NADH在 395nm 415nm波长处有光吸收峰，可在自动生化分析仪器内连续监测410nm的吸光度变化，求得胆汁酸的浓度。目前，以第五代酶循环法测定TBA的市售试剂多为进口产品，价格偏高。经相关专利的检索，未检索到第五代酶循环法测定TBA的试剂(盒)的专利。因此，研制发明适用于自动分析的以第五代酶循环法测定TBA的方法，和性能更为优良，能有效抗干扰能力，价格更为低廉的试剂是值得所属领域技术人员努力的目标。
发明内容
在对酶循环法测定TBA的方法进行多年研究以及反复实验后，在以下几方面有了重大突破试剂中Thio-NAD、NADH来源的选择非常重要，对循环酶反应的效率、速度、和稳定性有直接影响。1、试剂中Thio-NAD、NADH的浓度与相对比例的选择直接影响酶反应的速度，是准确测定样品TBA浓度的一个关键因素。2、为使血清中各种胆汁酸(包括一级、二级和三级胆汁酸)都能通过循环酶反应而测定，在试剂中除了加入3 α -羟类固醇脱氢酶之外，还加入了 7 α -羟类固醇脱氢酶。3、一种或多种特殊的稳定剂对保持试剂的长期稳定，和抵抗多种明确的和不明确的干扰因素的影响发挥重要的作用。4、选择合适的缓冲液的ρΗ，以保证循环酶反应的正向反应与逆向反应有相同的反应速度，实现酶反应的良好循环。本发明的目的之一是，提供一种以循环酶法自动分析测定样品中TBA含量的试剂，所述试剂由分别放置的试剂1和试剂2组成，其中，所述试剂1中含有氧化型β -硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)，缓冲剂，表面活性剂、稳定剂和防腐剂；所述试剂2中含有还原型辅酶I (NADH)，和羟类固醇脱氢酶(HSD)，缓冲剂，表面活性剂、稳定剂以及防腐剂。本发明的另一个目的是，提供一种定量测定血清样品中TBA的试剂盒，其特征在于其中装有分别放置的前述试剂1和试剂2。本发明的再一个目的是提供一种定量测定血清样品中TBA含量的方法。具体而言，本发明用于定量测定血清样品中TBA含量的试剂盒由分别放置的试剂 1和试剂2组成。其中，所述试剂1中含有氧化型β -硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)，缓冲剂，表面活性剂、稳定剂和防腐剂；所述试剂2中含有还原型辅酶I (NADH)，羟类固醇脱氢酶 (HSD)，缓冲剂，表面活性剂、稳定剂以及防腐剂。如本文中使用的，术语“高纯度”是指产品的纯度大于95%。所述试剂1的作用在于提供循环酶法正向反应所需的受氢体Thio-NAD，由于试剂 1中不含羟类固醇脱氢酶，并且有稳定剂的保护，所以试剂1在单独放置时是稳定的。
所述的氧化型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)在试剂溶液中的浓度范围为500mg/L 2000mg/L ；表面活性剂的浓度范围为100mg/L 5000mg/L。所述的表面活性剂选自一种或多种表面活性剂，其具体实例可以包括吐温-20、 曲拉通X-100、Brij ；35等的一种或几种。所述的稳定剂选自一种或多种试剂，其具体实例可以包括海藻糖、甘露醇、聚乙二醇等的一种或几种。所述的维持反应环境pH稳定的缓冲剂，其具体实例可以包括GOODS缓冲液、 Tris (三羟甲基氨基甲烷)缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种。缓冲液的pH范围为pH 3. 5 6. O0所述试剂2中含有还原型辅酶I (NADH)和羟类固醇脱氢酶(HSD)，缓冲剂，表面活性齐 、稳定剂以及防腐剂。所述试剂2的作用在于提供循环酶法反应所需的羟类固醇脱氢酶(HSD)，这种酶选自3α-羟类固醇脱氢酶和7 α-羟类固醇脱氢酶。其在试剂中的浓度没有特别的限制， 其具体实例中优选的浓度范围为500U/L 50000U/L。保证酶在试剂中足够的浓度从而保证用连续监测方法的自动分析得以顺利进行。所述试剂2的另一作用在于提供循环酶法逆向反应所需的供氢体还原型NADH，其具体实例中的浓度范围为1. Og/L 20. Og/L。所述的表面活性剂选自一种或多种表面活性剂，其具体实例可以包括吐温-20、 曲拉通X-100、Brij ；35等的一种或几种。所述的稳定剂选自一种或多种试剂，其具体实例可以包括海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、EDTA等的一种或几种。所述试剂2还含有下述物质维持反应体系pH的缓冲剂，其具体实例可以包括 如GOODS系列的缓冲液、AMPS0;防腐剂，如叠氮化钠等。这些物质也可同时存在于试剂1中。本发明所述定量测定人血清样品中TBA试剂盒是将分别放置的上述试剂1和试剂 2以不同的规格(ml)装入试剂盒包装中。该试剂盒具有多种不同的规格，可以分别适用于目前在临床实验室普遍使用的各种国内外品牌的自动生化分析仪器。本发明所述定量测定血清样品中TBA含量的方法包括 规定血清样品与试剂1和试剂2的容积比例，其比例为样品试剂1 试剂2 =3 210 70。 测定操作的步骤为在反应容器中(一般为分析仪器的比色皿)先加入待测血清样品，再加入试剂1，混勻后在37°C的恒温环境中定时保温5分钟，然后再加入试剂2起动酶的反应，继续保温，经过短暂的延迟时间后，开始在一定的波长处对吸光度的变化进行连续监测，获得在单位时间段内吸光度的变化率ΔΑ/min。用同样的方法测定校准液的吸光度变化率ΔΑ/min，血清样品中的TBA含量可通过下述的计算式得到TBA (ymol/L) = ( Δ A测定 / Δ A校准)X Cs (校准液 TBA 浓度)本发明的TBA测定方法只需3 10微升(μ )血清样品，总的反应体积也仅有 300 μ 1左右，检测的灵敏度以测定TBA的最低检测限(LLD)表示，至少可达1. 5 μ mol/L，所以是一种高效率、高灵敏度、低成本、快速微量的自动测定方法。
下面的实施例是对本专利申请的具体描述，但是，本专利申请不限于这些实施例， 这些实施例也不能解释为对本专利申请的限制。附图简述
图1示出在实施例2中本发明试剂与对照试剂对LDL-C的测定结果对比。
具体实施例方式实施例1 一、按照下述成分和比例配制下述本发明试剂1及试剂2 试剂1
β-石充代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)952.9 mg/L
GOODS 缓冲液 pH4.00.75mmol/L
乙二醇15ml/L
叠氮化钠0.5 g/L
草酸钠1.30 g/L
曲拉通 X-1002.50 g/L试剂2
还原型辅酶I (NADH)6.1g/L
GOODS 缓冲液 pH 9.20.75mmol/L
3α-羟类固醇脱氢酶10000U/L
7α-羟类固醇脱氢酶2000U/L
AMPSO45 g/L
BSA1.5 g/L
叠氮化钠0.2 g/L
甘露醇9.1 g/L二、测定使用HITACHI7100型自动生化分析仪，设置分析参数具体为分析方法 速率法；测定点19、观；检测波长405nm(主)/660nm(副)；样品量3. 0μ 1 ；试剂Rl 210 μ 1 ；试剂R2 :70μ1 ；反应方向上升；校准模式线性模式，2点校准；单位μ mol/L。 仪器自动执行以下操作过程在比色皿中先加入待测血清样品3 μ 1，再加入试剂1210 μ 1， 混勻后在37°C的恒温环境中定时保温5分钟，然后再加入试剂2起动酶的反应，继续保温， 经过短暂的延迟时间后，开始在405nm波长处对吸光度的变化进行连续监测，自动获得在单位时间段内吸光度的变化率ΔΑ/min。并自动根据计算公式TBA (μ mol/L) = ( Δ A测定 / Δ A校准)X Cs (校准液 TBA 浓度)自动报告样品TBA的测定结果。
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对高、中、低三个TBA含量水平的血清样品进行测定，每份样品各以上述标准操作方法重复测定20次，按正规的统计学要求，求取每份样品测定结果的平均值和标准差，然后按公式变异系数(CV% )=标准差/平均值X 100%计算变异系数CV%，结果列于下表1 中。表1高低浓度TBA测定的结果
权利要求
1.一种定量测定血清样品中总胆汁酸含量的试剂，其适用于自动生化分析仪器进行自动定量测定总胆汁酸，该试剂由分别放置的溶液型试剂1和试剂2两部分组成，其中，所述试剂1中含有氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、缓冲剂、表面活性剂、稳定剂和防腐剂；所述试剂2中含有还原型辅酶I、羟类固醇脱氢酶、缓冲剂、表面活性剂、稳定剂以及防腐剂。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在所述试剂1中，所述的氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸选自由酶转化法制备的辅酶衍生物纯品。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在所述试剂1中，所述的缓冲剂选自 GOODS缓冲液、三(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种，所述缓冲液的PH范围为pH 3. 5 6.0。
4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在所述试剂1中，所述的表面活性剂选自吐温系列、Brij系列、曲拉通系列的一种或多种表面活性剂；所述的稳定剂选自海藻糖、甘露醇、聚乙二醇中的一种或多种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂，其特征在于，在所述试剂1中，所述的氧化型β -硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在试剂溶液中的浓度范围为500mg/L 2000mg/L ；表面活性剂的浓度范围为100mg/L 5000mg/L ；缓冲液的浓度范围为0. 5mmol/L 150mmol/ L ；稳定剂的浓度范围为100mg/L 50000mg/L。
6.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在所述试剂2中，所述的还原型辅酶I选自由酵母细胞中提取的高纯度产品，或是NADH的钠盐。
7.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在所述试剂2中，所述的羟类固醇脱氢酶选自3 α -羟类固醇脱氢酶、7 α -羟类固醇脱氢酶、12 α -羟类固醇脱氢酶中的一种或多种；所述的表面活性剂选自吐温系列、Brij系列、曲拉通系列的一种或多种表面活性剂；所述的稳定剂选自海藻糖、甘露醇、聚乙二醇等的一种或多种；所述的缓冲剂选自GOODS缓冲液、三(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，在所述试剂2中，所述的还原型辅酶I 在试剂溶液中的浓度范围为1. Og/L 20. Og/L ；羟类固醇脱氢酶的浓度范围为500U/L 50000U/L ；表面活性剂的浓度范围为100mg/L 5000mg/L ；缓冲液的浓度范围为0. 5mmol/ L 150mmol/L ；稳定剂的浓度范围为100mg/L 50000mg/L。
9.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，试剂1和试剂2中都含有抑菌和稳定的防腐剂，该防腐剂选自叠氮化钠，防腐剂的优选浓度范围为0. 05% 1.0%。
10.一种定量测定血清样品中总胆汁酸含量的试剂盒，其特征在于其中装有权利要求 1至9中任一项所述的定量测定血清样品中总胆汁酸含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂1和试剂2组成。
全文摘要
本发明提供了一种以酶学方法定量测定人血清样品中总胆汁酸含量的试剂，适用于自动生化分析仪器进行自动定量测定总胆汁酸。该试剂由分别放置的溶液型试剂1和试剂2两部分组成，其中，所述试剂1中含有氧化型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)，缓冲剂，和稳定剂；所述试剂2中含有还原型辅酶I(NADH)和羟类固醇脱氢酶(HSD)以及稳定剂和缓冲剂。本发明还提供了一种装有本发明试剂1和试剂2的试剂盒，以及一种测定血清总胆汁酸含量的方法。本发明具有灵敏度高、成本低、操作简便快速、易于推广的优点。
文档编号G01N21/31GK102539791SQ20121000509
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者宋高峰, 李清华 申请人:宁波天康生物科技有限公司