专利名称：评价脾虚证及中药药效的基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明生物检测技术，具体涉及评价脾虛证的基因芯片，以及利 用所述芯片评价中药药效。
背景技术：
脾虛证是中医脾胃理论的一个重要组成部分，具有广泛的临床基 础。传统中医理论认为，脾为后天之本，主运化，为气血生化之源， 脾主肌肉四肢，开窍于，现代研究认为，脾('胃)是以消化系统为主的 多系统、多器官的综合功能单位，涉及现代医学的消化吸收、能量代 谢、内分泌、血液系统、神经和免疫等多系统的功能。脾虛时临床上 主要表现为消化、吸收、运输功能失调，出现腹胀、腹泻、精神倦怠、 消痩、营养不良等症。脾对食物的消化和吸收起着十分重要的作用， 因此几乎所有的胃肠道疾病都可出现或伴有脾虛证。
目前对脾虛证的诊断，主要通过临床症状诊断标准以及淀粉酶、
D-木糖、血清胃泌素等指标的检测。对脾虛证的判定很难量化，且检 测的客观指标单一，不能准确体现脾虛证的本质。脾虛证治疗方面， 中药作为一种天然药物，具有资源丰富、价格低廉、毒副作用小、残 留少，不易致畸和致癌等独特作用。但当前中草药制剂存在着一些问 题，如有效成份不明确、疗效不稳定、剂量较大，尤其是药理作用机 制不明确等不足，不利于中药在实际生产中广泛使用，严重阻碍中药 产业化及中药产品进入国际巿场。因此，在倡导"绿色"动物产品的 今天，研制能有效防治动物脾虛证，且成分和药理作用明确、使用方 便的"绿色"新型天然药品已成为亟待解决的问题，业已成为当今药 物研制的热点。
基因芯片技术是目前基因研究方面最先进、也是最有效的方法之一，基因芯片技术作为基因诊断、相关基因确定、疾病分子机理分析、 药物筛选等重要工具，具有高通量、并行性及样品消耗量少的优势， 在中药研究尤其是新药的设计筛选开发独具魅力，能够进行大规模筛 选，在药物与基因间架起一座桥梁，通过基因表达谱芯片实验可以同 时观察成千上万个基因在不同个体、不同组织、不同发育阶段的表达 状况，从疾病及药物两个角度对生物体的多个参数同时进行研究，发 掘药物耙点并同时获取作用机制的相关信息，改变了传统的 一次实验 仅对单个或几个基因表达差异进行观察，为多环节药物作用机制的研 究提供了有力工具。中药尤其是复方组成成分多样，作用机制复杂， 这给中药研究带来很大的困难，以至有学者提出中药可能通过多途 径、多靶点发挥作用，而基因芯片高通量筛选的特点恰好满足同时获 得大量实验信息的需要。
中医证候动物模型的研究是体现中医辨证论治特色的 一种理想 的方法，但随着数十年来研究的深入，其存在的问题也逐渐显露客 观指标的特异性、重现性等较差；证的动物模型的研究长期停留于造 模阶段，致使中药新药药理实验研究仍在借用于西医的病理模型。随 着大鼠、小鼠、兔、狗、猪等动物基因组测序的完成，研制实用的基 因组芯片，利用基因芯片技术从整体、器官、细胞等水平筛选有关基 因的差异表达，获取并归纳与证候相关的关键特征信息，选择功效相 对稳定的经典方，进行证属性排比性的药物佐证，进而确定该证的基 因表达谱情况，从而建立相应的中医证模型和评价体系对中兽药新药 研发非常重要。本发明前期对大鼠脾虛时的消化相关、免疫机能相关
指标体系及其相关性进行了大量的研究，如大鼠肠道Tlr2、 Tlr4、 NOS2、 C3、 Ubd、 Apln、 C2ta、 Ccl22、 CxcllO、 Irf7、 Mxl、 Mx2、 Oasl2基因表达差异及部分激素蛋白表达变化，血清SOD、 MDA、 淀粉酶、脂肪酶、D-木糖的变化，但评价指标体系繁杂、工作量巨大， 难于实时反映本动物整体相关性、应激调控网络、特别是容易错过某些关键指标。
基因芯片技术目前的在国内人医研究中运用较多，但兽医方面由 于其成本太高，未有人涉足。有关机体免疫机能和生产性能指标的评 价是所有新药研发的基础指标，通用性极强。中药由于其成分的复杂 性及多种成分间可能存在的协同作用，因此，分析、鉴定和筛选其有 效成分是中药新药开发中的一个很大难题，如果将基因芯片技术应用 到中药活性成分的筛选，不仅可以节省大量的本动物实验，而且这种 高通量筛选技术将会大大加快中药新药研发的进程。利用基因芯片技 术可从基因水平解释中药的作用机制，为新药的开发提供理论依据， 在基因分子水平上确定药物作用的靶目标，进而找出特效治疗作用的 药物，同时，由于高通量的基因芯片，可以克服药物作用的单一靶点 研究，有助于中药多方面作用机理的揭示，并有助于发现中药的新功 能，为将来开发自主知识产权的国标一类新药打下良好的基础。
研究证实中药的药理作用具有多途径、多靶点的特点，其中生产 性能、免疫性能的药效学评价在畜禽新药研发中占有至关重要的位 置。生产性能作为畜牧生产的前提是经济动物养殖的基础；免疫机能 正常是保证畜禽健康及发挥生产性能，为人类提供安全食品和创造经 济效益的前提，建立上述两个重要性能的指标评价体系是所有新兽药 研发的基石和最终目标。所以，如何利用现代技术建立中药研发的技 术平台，对进行中药药效评价、开发新中兽药具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供 一 种能够用于评价脾虛证及中药药效的 基因芯片。
本发明提供的评价脾虛证的基因芯片，其主要针对以下基因产生
的RNA、 cRNA或cDNA进行检测
1、免疫相关Tlr2、 Tlr4、 NOS2、 C3、 Ubd、 Apln、 C2ta、 Ccl22、
CxcllO、 Gbp2、 Irf7、 Mxl、 Mx2、 Oasl2、 Tapl;2、 氧化应激相关Gpx2、 D丽2， Ephx2、 Maob.,
3、 代谢生物合成相关Mtel、 Aldhlal、 Acadsb、 Aldh6al 、 Hmgcs2、 Cyp24al、 Cesl、 Sultlal、 Decrl、 Fmo2、 Hsdl7M3、 Chdh、 Acacb、 Cyp4al2、 Slc35c2、 Npylr、 Cyp27al、 G6pc、 Upbl、 Gstm3、 Echl、 Arg2、 Cyp2d22、 Irs2、 Slc2a5、 Acaa2、 Acaal、 Gstm2， Eroll、 Scd2、 Ldha、 Fadsl、 Cyba、 Alpl、 Fuca2、 Atp7a、 Abo、 Oxct2a、 A3galt2、 Thrsp。
一种较佳的组合应当具有针对下述基因产生的RNA、 cRNA或 cDNA进行检测的探针Tlr2、 Tlr4、 NOS2、 C3、 Ubd、 Apln、 C2ta、 Ccl22、 CxcllO、 Gbp2、 Irf7、 Mxl、 Mx2、 Oasl2、 Tapl、 Gpx2、 Duox2、 Ephx2、 Maob、 Mtel、 Cyp24al、 Cesl、 Upbl、 Eroll、 Scd2、 Ldha、 Fadsl、 Cyba、 Alpl、和Thrsp。
此外还可进一步包括下述基因产生的RNA、 cRNA或cDNA进 行检测的探针中的一种或多种Tlr2、 Tlr4、 NOS2、 C3、 Ubd、 Apln、 C2ta、 Ccl22、 Cxcl10、 Gbp2、 Irf7、 Mxl、 Mx2、 Oasl2、 Tapl、 Gpx2、 D丽2、 Ephx2、 Maob、 Mtel、 Cyp24al、 Cesl、 Upbl、 Eroll、 Scd2、 Ldha、 Fadsl、 Cyba、 Alpl、和Thrsp。
脾虛证评判标准
1、 免疫相关下调Tlr2、 Tlr4、 NOS2、 C3、 Ubd、 Apln、 C2ta、 Ccl22、 Cxcl10、 Gbp2、 Irf7、 Mxl、 Mx2、 Oasl2、 Tapl, T检验PO.Ol。
2、 氧化应激相关下调Gpx2、Duox2，T检验P0.01;上调Ephx2、 Maob, T检验PO.Ol。
3、 代谢生物合成相关上调Mtel、 Aldhlal、 Acadsb、 Aldh6al、 Hmgcs2、 Cyp24al、 Cesl、 Sultlal、 Decrl、 Fmo2、 Hsdl7M3、 Chdh、 Acacb、 Cyp4al2、 Slc35c2、 Npylr、 Cyp27al、 G6pc、 Upbl、 Gstm3、 Echl、 Arg2、 Cyp2d22、 Irs2、 Slc2a5、 Acaa2、 Acaal、 Gstm2， T检 验PO.01;下调Eroll、 Scd2、 Ldha、 Fadsl、 Cyba、 Alpl、 Fuca2、
7Atp7a、 Abo、 Oxct2a、 A3galt2、 Thrsp, T检验PO.Ol。 中药效果证评判标准至少应当包括以下基因
1、 免疫相关Tlr2、 Tlr4、 NOS2、 C3、 Ubd、 Apln、 C2ta、 Ccl22、 CxcllO、 Gbp2、 Irf7、 Mxl、 Mx2、 Oasl2、 Tapl比脾虛证组，上调 PO.Ol。
2、 氧化应激相关下调Gpx2、 Duox2, T检验PO.01;
上调Ephx2、 Maob， T检验PO.Ol。
3、 代谢生物合成相关上调Mtel、 Cyp24al、 Cesl、 Upbl, T 检验PO.01
下调Eroll、 Scd2、 Ldha、 Fadsl、 Cyba、 Alpl、 Thrsp, T检 验P〈0.01。
本发明中所述的探针可以是上述相应基因的核酸序列、其互补序 列，或者它们的片段，它们被固定在适于检测反应的固相载体上，制 成基因芯片。本发明中所述固相载体可选用本领域中众所周知的载 体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果。优选的， 本发明所述固相载体为玻璃片、硝酸纤维素膜或硅片等。
本发明所述基因芯片可包含在一个试剂盒中，其中还可以包括用 于评价反应的相应试剂、缓冲液以及说明书等。
在本发明的实施方案中，所述固相载体为玻璃片，玻璃片用多聚 赖氨酸进行处理，向其上固定具有本发明所选的基因特征性片断，利 用机械手点印芯片，并将芯片重新水合化及快速干燥、UV-交联、封 闭及变性，得到评价用基因芯片。同时以荧光素标记待测样品，和芯 片进行杂交。
在本发明中，待测样品核酸的抽提可釆用异硫氰酸胍稳定法，用 分光光度计对RNA定量。
本发明所述评价用基因芯片釆用了严格的杂交反应条件。依据本 发明所选择的条件，可实现使大量杂交反应中的大多数反应物处于最佳状况中，从而使尽可能多的配对物都不遗漏，即减少假阳性的可能， 将错配降到最低。
本发明首次将上述差异表达明显的基因聚类后釆用生物芯片技 术应用于对中医脾虛证的评价，并通过一次实时、同步、高通量检测 神经-免疫-内分泌指标的变化多层次、多靶点全面评价畜禽在脾虛 证中上述指标的典型变化。
本发明首次将生产性能与免疫性能差异表达明显的基因聚类后 釆用生物芯片技术不仅应用于对中医脾虛证的评价，同时也实时、同 步、高通量检测神经-免疫-内分泌指标的变化多层次、多靶点全面 评价开发研制的中兽药治疗畜禽在脾虛证中上述指标的典型变化的 效果评价。
本发明首次将消化及氧化吸收相关的酶和胃肠激素及免疫相关 的细胞因子结合起来作为评价脾虛证的指标。上述指标对于评价与畜 禽生产性能相关指标、与免疫性能相关的指标具有重要的指导意义。 而生产性能相关指标是畜牧生产追求的指标，免疫性能是保障动物健 康的关键。
本发明芯片不仅将在新药研究中体现节省样品，节省时间，同时 节省资金。
图l显示的是脾虛组与对照组体重的变化情况； 图2显示的是釆食量的变化，其中釆食量为每笼6只大鼠每天釆 食量总和；
图3显示的是脾虛组与对照组脏器指数的变化；
图4显示的是小肠组织学变化，HE染色(x200): A对照组十 二指肠，B模型组十二指肠，C对照组空肠，D模型组空肠，图中标 尺为100,。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。
实施例1基因芯片制备的通用策略
关于本发明所述基因芯片的制备，可釆用如下详述的通用策略
1. 载玻片处理首先充分清洗载玻片，用25xNaOH溶液200mL 加300mL95。/。乙醇配成500mL碱性清洗液，将载坡片彻底浸泡在清 洗液中2h,再用清水冲洗5遍并将载玻片泡在水中。接下来就是用 多聚-L-赖氨酸溶液浸泡，从而使多聚赖氨酸均匀涂包在坡璃表面， 形成一种多聚-L-赖氨酸涂面。具体做法是配成350mL多聚-L-赖氨酸 浸泡液，将洗净的载玻片直接浸泡，浸泡期间保持慢速摇晃，lh后 取出并在水中浸泡清洗，最后干燥。 一般将涂好的载玻片用锡箔纸包 好，室温放置l个月，进行熟化，以使表面保持充分的疏水性。这对 于以后点DNA样品是十分重要的。
2. 基因芯片的点印点印DNA用机械手。将一组处理好的载 玻片固定在一个平台上，将DNA样品(溶在50% DMSO中，0.25-0.75 昭/pl)装在96孔或384孔的平板中，并将平板放在支架上。机械手 将一组特制的点样吸头插入对应的DNA平板孔中，让每个吸头充上 约lpl的DNA溶液。然后机械手轻轻地将吸头移向载玻片，将DNA 样品完全一致地点到多聚-L-赖氨酸包被的载玻片面上.每个载玻片 上大约点0.5pl的DNA溶液。点样的质量要表现在点与点的距离， 这取决于点样吸头的尖锐度与多聚-L-赖氨酸表面的疏水性，矩阵 24x24,每个样品重复4次，每张芯片上下两个矩阵。
3基因芯片的后加工处理当基因芯片点成之后，需要对其进行 进一步的加工处理，以便能够用于以后的杂交实验。通常进行四步处理，即重新水合化及快速干燥、UV-交联、封闭及变性后备用。
3.1重新水合化通常点样过程并不能保证DNA在点中均匀一 致。为使DNA在所有点中都分布均匀。需要对之进行重新水和化并 进行快速干燥。这一过程要求技术条件很高。当重新水合化不充分时, 大小不规则的点会影响以后的杂交与分析结果。但当过度水合化时， 点与点之间可能会产生融合。因此，要确定一个十分准确的水合条件， 本芯片釆用的是相对湿度70%环境水合2 h,室温干燥0.5 h。
3.2UV交联当重新水合化并立即干燥后，将载玻片放在UV射 线下照射，这样可以使DNA交联在载玻片上。这一过程对于DNA 浓度低时尤为重要，可以增加可杂交DNA吸附到每一个点上的量.在 UV交联时，将载玻片有DNA点的面朝上，照射总能量强度为65 MJ/cm。
3.3封闭封闭主要目的是将游离赖氨酸基团加以修饰，以避免 这些基团与以后被标记的DNA结合。如果不对载玻片封闭，那么， 将来杂交后就会产生无法分清的非特异杂交斑.而且还会产生过多的 背景。 一般的封闭办法是用琥珀酸酐进行酰基化，将赖氨酸的氨基转 化成酰氨基，使之形成负电荷表面，从而减小与DNA的非特异结 合.这一过程一般在15min内结束。
3.4变性处理当封闭过程完成后，要立即进行变性处理，即将 整个载玻片立即浸入沸腾但不冒泡的水中，上下翻3~5次，停留 2min，然后立即转到95%的乙醇中，浸泡一会儿后离心干燥，这样便 完成了对芯片上DNA的变性处理。此时，整个基因芯片块也就做好 了。
实施例2本发明所述基因芯片检测待测样品的通用策略
1.待测样品的标记
依照所检测对象的不同，选择具体的待测样本，依照如下方法提 取核酸样品，并对所得待测样品核酸进行生物素标记。RNA的提取方法(参见分子克隆实验指南中文第三版2002 年J.萨姆布鲁克等著黄培堂等译518-522页)；对待测样品的核酸进 行提取。
生物素标记以提取的核酸作模板，采用RT-PCR方法进行扩增， RNA/T7-01igo (dT)作为引物合成双联cDNA,再以cDNA为模板 合成cRNA,并用生物素-NTP进行标记。
2. 基因芯片与待测样品的杂交
取出芯片平衡芯片至室温，参见下表配制杂交液。根据芯片类型 确定需要配制的体积，这已将杂交过程中会损失部分(10-20 pL)杂 交液考虑在内。将杂交液置于加热块上，99。C温育5min。其间，用 一次性吸头通过一个septa (芯片上septa位置)注入相应体积 lxHybridization Buffer将芯片置于杂交炉中，45°C温育10 min, 60 rpm 旋转。将99。C已温育5min的杂交液转移到另一加热块上，45。C温育 5min。从加热块上取出杂交液，微型离心机最大转速离心5min,以 除去杂交混合液中的不溶性物质。从杂交炉中取出芯片，吸出 lxHybridization Buffer,将芯片平衡放置于杂交炉中，45°C, 60 rpm 旋转杂交16 h，
3. 杂交结果的检测
将杂交完毕的芯片用GeneChip Scanner 3000( Affymetrix,USA)
激光共聚焦扫描仪在适当条件下扫描检测其杂交信号。
实施例3大鼠脾虛证芯片实例
中兽医理论认为，脾为后天之本，主运化，为气血生化之源，脾 主肌肉四肢，开窍于唇，现代研究认为，脾(胃)是以消化系统为主的 多系统、多器官的综合功能单位，涉及现代兽医学的消化吸收、能量 代谢、内分泌、血液系统、神经和免疫等多系统的功能。由于脾(胃) 功能的重要性以及脾虛证涉及众多的疾病和复杂的病理变化，脾虛证 作为证候学研究的重要课题一直是中兽医临床和基础研究的重点。"脾主运化"与消化系统关系密切，其功能与形态的异常是脾虛 最基本的病理变化。许多实验结果表明，胃肠道运动功能、消化和吸 收功能、激素、形态结构的改变以及胰腺外分泌功能的改变等，均是 脾虛证发生的病理机制。
本例通过利血平制造大鼠脾虛模型，研究脾虛时大鼠临床症状， 体重、脏器指数变化，肠道形态学观察，检测消化酶及基因变化，并 通过本发明芯片来进行检测和验证。
一、材料和方法
1.1动物分组和饲养
36只体重为200 ± 20g雄性SD ( sprague-Dawley )大鼠(购自北
京维通利华试验动物技术有限公司)。供试大鼠在温度25 。C ，湿度45% 环境下适应性饲养3天(每天上午定时给料，自由饮水)。随机分为 对照组和模型组，每组18只。饲喂商品鼠粮(每天定量200g)。 1.2试验处理
模型组和对照组大鼠分别给予利血平0.5 mL/kg和生理盐水0.5 mL/kg，腹腔注射，每日一次，连续7天、10天和14天。 1.3样品和指标数据采集
分别于试验第7天、10天和14天，各组随机抽取6只大鼠断颈 处死，立即心脏釆集血样，用于血清生化指标测定；取脾脏、肝脏、 肾脏、心脏称重和计算脏器指数(mg/10g体重)；胃和小肠取出后，立 即用生理盐水冲洗干净，分别从胃窦(从胃幽门至胃小旁角切迹处， 取胃窦腹侧壁全层组织)、十二指肠(距离幽门口 5cm处)、空肠(距离 幽门口 20cm)、回肠(接近盲肠1Scm处)取2cmx 1 cm全层组织块2 块。胃肠组织用灭菌生理盐水冲洗干净分为4部分①10M甲醛固定② 基因芯片检测③④液氮冻透后-8(TC保存。 1.4动物临床表现
每天上午8: OO记录每笼大鼠饲料剩余量、测量每只大鼠体重；
13观察处理过程中动物行为变化。 1.5血清消化酶检测
血样，37。C放置60min， 4°C下3000 r/min离心10 min,取上清
分装，-s(rc保存，待测。血清在一周内，按试剂盒说明书操作测定
淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)活性。 1.6小肠组织形态学
胃肠道组织，用中性甲醛固定24h,然后经脱水、透明、透蜡、 包埋处理后，切片(厚4pm), HE染色，苏木精染色时间为5min， 伊红染色时间为45s。在生物显微镜下(10x20)观察组织变化。 1.7基因芯片扫描
从第7、 10、 14天中挑选指标变化明显天数用作芯片分析，为方 便实验和节约成本，本例借用Agilent芯片(名称Agilent大鼠寡聚 DNA芯片(4x44K)，货号Agilent G4131F，上海生物芯片有限公 司)进行实验。
二、结果
2.1动物临床表现
大鼠在注射利血平后第3天开始出现明显的拉稀症状，第5天开 始出现肛周污秽、消痩、活动频度下降、扎堆、拱背、眯眼、被毛枯 槁无光泽等症状。 2.2大鼠体重变化
结果如图l所示，脾虛组大鼠体重第7天、10天和14天均显著 下降，低于对照组，第10天最为显著。 . 2.3大鼠釆食量变化
结果如图2所示，与对照组比，脾虛组大鼠采食量在第7、 10、 14天都显著降低。 2.4脏器指数影响
结果如图3所示，与对照组相比，脾虛组脾脏、肝脏指数在第7天、第10天、第14天都显著降低；心脏指数在第10天显著降低; 肾脏指数在第7天和第14天显著升高。 2.5血清淀粉酶和脂肪酶活力变化
表l血清中消化酶活力的变化(n=6, x±s)
样品血清淀粉酶活力(U/L)血清脂肪酶活力(U/L)
7d10d 14d7d 10d 14d
对照组 脾虛组1232.9±20.7 1244.1±6.0 1223.8±17.9 936.7±206.3* 653.7±232.3* 卯3.2±177.7*25.91±18.3 51.10±40.5 32.39±19.3 113.00±70.1* 89.25±43.7 74.14±43.5
脾虛组血清淀粉酶活力在第7天、第10天、第14天都极显著降 低，脂肪酶活力在第7天显著升高。 2.6肠道组织学变化
结果如图4所示，与对照组比，模型组大鼠十二指肠和空肠肠壁 变薄；十二指肠肠腺萎缩，结构不完整。 2.7芯片差异数据
2.7.1上调基因数据
Xvs Control一Log2RatioT检验基因名注册号
6.5970270780.000633385CtelNM—031315
5.0224640.004491CB327764CB327764
4,6559360.004074TC608617TC608617
4.2902570.003204BF548548BF548548
4.2165830.002645TC648243TC648243
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1.1549792390.008498095AldhlalNM一022407
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1.00844卯540,004476678Gstm2NM—177426
2.7.2下调基因数据X vs Control—Log2Ratio T检验基因名注册号
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-5.896817260.000996545AboNM一023094
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-1.0323371330.001581254Tlr4丽019178
2.8差异基因GO(Gene Ontology)分析
选择计数
基因本体分项(GO Term)p-value(Count in总计
Selection)
细胞质成分(cytoplasmic part)4.43E-215482605
细胞质(cytoplasm)1.09E-206983515
细胞代谢过程(cellular metabolic process)1.19E-188324418
代谢过程(metabolic process)1.87E-178874809
主要代谢过程(primary metabolic process)2.43E-178014266
催化活性(catalytic activity)8.39E-167744149
免疫系统(immune system process)3.83E-14149550
乙醇代谢过程(alcohol metabolic process)1.07E-1287274
细胞生物合成过程(cellular biosynthetic process)7.71E-122421088
核糖体(ribosome)8.91E-1280252
免疫应答(immuneresponse)1.72E-11103362
胞浆(cytosol)2.53E-11126477
t亥糖f本结构纟且成(structural constituent of ribosome)3.00E-1175235
羧酸代谢过程(carboxylic acid metabolic process)1.15E-10116437有机酸代谢过程(organic acid metabolic process)1.56E-10116439
分解代谢过程(catabolic process)1.60E-10144582
细胞内相关基因(intracellular)2.45E-1010636257
细胞分解代谢过程(cellular catabolic process)2.5犯-10127498
生物合成过程(biosyntheticprocess)4.30E-103331655
单糖代谢过禾呈(monosaccharide metabolic process)7.00E-1053152
胞浆成分(cytosolicpart)8.24E-103996
细胞大分子代谢过程(cellular macromolecule metabolic process)8.80E-104622438
己糖代谢过程(hexose metabolic process)9.76E-1052149
胞浆核糖体(cytosolicribosome)1.59E-092651
细胞内部分(intracellular part )4.34E-099755738
月旨质代谢过程(lipid metabolic process)6.31E-09137575
细胞脂质代谢过程(cellular lipid metabolic process)6.64E-09119481
葡萄糖代谢过程(glucose metabolic process)7.91E-0944123
辅酶结合(coenzyme binding)1.18E-0850150
乙醇分角牟代谢过程(alcohol catabolic process)2.02E-083278
核糖体蛋白复合物(ribonucleoprotein complex)2.17E-0898382
辅因子结合(cofactor binding)2.18E-0861202
大分子代谢过程(macromoecue metabolic process)2.19E-086083404
葡萄糖分解代谢过程(glucose catabolic process)2.48E-083071
己糖分解代谢过程(hexose catabolic process)2.71E-083175
单糖分解代谢过程(monosaccharide catabolic process)2.71E-083175
抗原呈递(antigen processing and presentation)2.89E-082864
翻译(translation)2.96E-0895369
MHC蛋白复合物(MHC protein complex)3.10E-082450
糖酵解(glycolysis)1.14E-072660
细胞大分子生物合成过程(cellular macromolecule biosynthetic process)1.70E-07122524
结合区(binding)1.81E-0713628442
发育过程调控(regulation of developmental process)2.07E-07162745
周亡i周控(regulation of apoptosis)2.19E-07109457
细胞程序性死亡调控(regulation of programmed cell death)2.38E-07110463
一元羧酸代谢过程(monocarboxylic acid metabolic process)2.80E-0763225
大分子分解代谢过程(macromolecule catabolic process)2.87E-0778299
氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)3.55E-07146662
细胞碳水化合物分解代谢过程(cellular carbohydrate catabolic process)4.81E-0735100
甾醇生物合成过程(sterol biosynthetic process)5.87E-071526
己糖生物合成过程(hexose biosynthetic process)5.87E-071526
19catabolic5.90E-0736105
process)
结构分子活性(structural molecule activity)7.03E-07132592
质膜(plasma membrane)1.08E-063141656
单糖生物合成过程(monosaccharide biosynthetic1.14E-061527
process)
胞内信号级联(intracellular signaling cascade)1.21E-062091035
脂肪酸代谢过程(fatty acid metabolic process)1.31E-0646153
NAD结合(NAD binding)1.55E-062148
裂解酶活性(lyase activity)1.74E-0640127
氨基酸及其衍生物代谢过程(amino acid and1.93E-0672282
derivative metabolic process )
应激反应(response to stress)2.03E-06195961
乙醇生物合成过程(alcohol biosynthetic process)2.11E-061528
胆固醇生物合成过程(cholesterolbiosynthetic2.34E-061322
process)
蛋白二聚体活性(protein dimerization activity)2.61E-0678315
细胞碳水化合物代谢过程(cellular carbohydrate2.68E-0665254
metabolic process)
细胞大分子分解代谢过程(cellular macromolecule3.05E-0668265
catabolic process)
蛋白激酶级联反应(protein kinase cascade)3.11E-0661230
I类MHC蛋白复合物(MHC class I protein4.06E-061943
complex)
类异戊二烯代谢过程(isoprenoid metabolic4.28E-061736
process)
I-kappaB激酶/NF-kappaB级联(I-kappaB8.68E-061634
kinase/NF-kappaB cascade)核糖体亚基(ribosomal subunit)9.56E-063090
蛋白代谢过程(protein metabolic process)1.01E-054062271
细胞蛋白代谢过程(cellular protein metabolic1.05E-054022247
process)
酶结合(enzyme binding)1.35E-0560235
胞浆小核糖体亚基(cytosolic small ribosomal1.57E-051325
subunit)
蛋白质的胞夕卜基质(proteinaceous extracellular1.61E-0554206
matrix)
细胞程序性死亡正调控(positive regulation of1.85E-0556217
programmed cell death)
凋亡正调控(positive regulation of apoptosis)1.85E-0556217
线粒体(mitochondrion)2.12E-05144699
生物聚合物生物合成过程(biopolymer biosynthetic2.47E-051961004
process)
胞夕卜基质(extracellular matrix)2.50E-0554209水解酶活性(hydrolase activity)2.68E-053121705
大分子生物合成过程(macromolecule biosynthetic process)3.04E-052211156
胞夕卜基质部分(extracellular matrix part)3.09E-052573
胺代谢过程(amine metabolic process)3.82E-0573311
过氧化物酶体(peroxisome)4.01E-052574
微体(microbody)4.01E-052574
脂质生物合成过程(lipid biosynthetic process)4.26E-0556223
细胞氮化合物代谢过程(cellular nitrogen compound metabolic process)4.43E-0575323
激素代谢过禾呈(steroid metabolic process)4.98E-0541149
线粒体膜(mitochondrialmembrane)5.09E-0560245
糖异生途径(gluconeogenesis)6.62E-051121
乙酰辅酶AC-乙酰基转移酶活性(acetyl-CoA C-acetyltransferase activity)7.40E-0555
砲类代谢过程(terpenoid metabolic process)7.46E-051018
白细胞活性(leukocyte activation)7.90E-0534118
氮化合物代谢过程(nitrogen compound metabolic process)8.39E-0575329
线粒体内膜(mitochondrial inner membrane )8.75E-0553213
胞桨大核糖体亚基(cytosolic large ribosomal subunit)9.26E-051225
天然免疫应答(innate immune response)9.61E-051536
谷氨酰胺家族氨基酸代谢过程(glutamine family amino acid metabolic process)9.61E-051536
质膜部分(plasma membrane part)9.65E-052441316
大鼠脾虛证芯片预测准确率
通过大鼠生理指标、血清酶指标、肠道形态学观察以检验大鼠预
测准确率，结果表明按照以下评价体系其准确率可达达85%以上，单 独考察Tlr2、 Tlr4、 NOS2、 C3、 Ubd、 Apln、 C2ta、 Ccl22、 Cxcl10、 Gbp2、 Irf7、 Mxl、 Mx2、 Oasl2、 Tapl、 Gpx2、 D腿2、 Ephx2、 Maob、 Mtel、 Cyp24al、 Cesl、 Upbl、 Eroll、 Scd2、 Ldha、 Fadsl、 Cyba、 Alpl、和Thrsp基因，其准确率达90%。
评判标准
1)免疫相关下调Tlr2、 Tlr4、 NOS2、 C3、 Ubd、 Apln、 C2ta、 Ccl22、 Cxcl10、 Gbp2、 Irf7、 Mxl、 Mx2、 Oasl2、 Tapl， T检验
21PO.Ol。
2) 氧化应激相关下调Gpx2、 Duox2, T检验PO.01;
上调Ephx2、 Maob， T检验PO.Ol。
3) 代谢生物合成相关上调Mtel、 Aldhlal、 Acadsb、 Aldh6al、 Hmgcs2、 Cyp24al、 Cesl、 Sultlal、 Decrl 、 Fmo2、 Hsdl7bl3、 Chdh、 Acacb、 Cyp4al2、 Slc35c2、 Npylr、 Cyp27al、 G6pc、 Upbl、 Gstm3、 Echl、 Arg2、 Cyp2d22、 Irs2、 Slc2a5、 Acaa2、 Acaal、 Gstm2, T检验PO.01;
下调Eroll、 Scd2、 Ldha、 Fadsl、 Cyba、 Alpl、 Fuca2、 Atp7a、 Abo、 Oxct2a、 A3galt2、 Thrsp, T检验PO.Ol。
中药药效的评判与对照组相比以上各指标的趋势相反则表明具 有疗效。
权利要求
1、一种用于评价脾虚证及中药药效的基因芯片，其具有针对下述基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针Tlr2、Tlr4、NOS2、C3、Ubd、Apln、C2ta、Ccl22、Cxcl10、Gbp2、Irf7、Mx1、Mx2、Oasl2、Tap1、Gpx2、Duox2、Ephx2、Maob、Mte1、Cyp24a1、Ces1、Upb1、Ero1l、Scd2、Ldha、Fads1、Cyba、Alpl、和Thrsp。
2、 如权利要求1所述的基因芯片，其还具有针对下述基因产生 的RNA、 cRNA或cDNA进行检测的探针中的一种或多种Aldhlal、 Acadsb、 Aldh6al、 Hmgcs2、 Sultlal、 Decrl、 Fmo2、 Hsdl7M3、 Chdh、 Acacb、 Cyp4al2、 Slc35c2、 Npylr、 Cyp27al、 G6pc、 Gstm3、 Echl、 Arg2、 Cyp2d22、 Irs2、 Slc2a5、 Acaa2、 Acaal、 Gstm2、 Fuca2、 Atp7a、 Abo、 Oxct2a和A3galt2。
3、 如权利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于，所述探针 为相应基因的核酸序列、其互补序列，或者它们的片段。
4、 一种试剂盒，其包括针对下述基因产生的RNA或表达产物测 定的试剂Tlr2、 Tlr4、 NOS2、 C3、 Ubd、 Apln、 C2ta、 Ccl22、 Cxcl10、 Gbp2、 Irf7、 Mxl、 Mx2、 Oasl2、 Tapl、 Gpx2、 D丽2、 Ephx2、 Maob、 Mtel、 Cyp24al、 Cesl、 Upbl、 Eroll、 Scd2、 Ldha、 Fadsl、 Cyba、 Alpl、和Thrsp。
5、 如权利要求4所述试剂盒，其还包括针对基因产生的RNA或 表达产物测定试剂中的一种或多种Tlr2、 Tlr4、 NOS2、 C3、 Ubd、 Apln、 C2ta、 Ccl22、 Cxcl10、 Gbp2、 Irf7、 Mxl、 Mx2、 Oasl2、 Tapl、 Gpx2、 D丽2、 Ephx2、 Maob、 Mtel、 Cyp24al、 Cesl、 Upbl、 Eroll、 Scd2、 Ldha、 Fadsl、 Cyba、 Alpl、和Thrsp。
6、 如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述的盒为 a)检测RNA的试剂盒荧光定量PCR检测试剂盒，原位杂交及原位RT-PCR， Nouthem检测试剂盒；或b)检测表达产物的试剂盒ELISA试剂盒或抗体芯片试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种用于评价脾虚证及中药药效的基因的基因芯片，其包括针对免疫相关指标、酶、胃肠激素相关以及细胞因子相关基因表达检测的探针。本发明基因芯片对脾虚证的检测准确率可达85％以上，为脾虚证的快速检测以及中药药效评价提供了有效手段。
文档编号C12Q1/68GK101619359SQ20091009082
公开日2010年1月6日 申请日期2009年8月7日 优先权日2009年8月7日
发明者进 余, 刘凤华, 朋 尹, 朱晓宇, 飞 程, 程桂林, 许剑琴 申请人:中国农业大学