专利名称：一种固体发酵生产γ-多聚谷氨酸的细菌YXY-C1及其产品的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及到一种固体发酵生产γ -多聚谷氨酸 的细菌YXY-Cl及其产品。
背景技术：
Y-多聚谷氨酸是由微生物利用D-和/或L-型谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧 基之间的酰胺键聚合而成的一种天然带负电和的高分子聚合物，最先由Ivanovics及其合 作者在炭疽芽孢杆菌的荚膜中发现，近几十年来受到越来越多的关注。Y-多聚谷氨酸具有 高度水溶性和吸水保湿性，且可被生物降解、可食用、对人和环境无毒，因此Y -多聚谷氨 酸及其衍生物在食品、化工、材料、医药等领域具有极大的开发价值和广阔的应用前景。目前国内外用于研究Y-多聚谷氨酸生产的典型菌株主要有Bacillus licheniformisATCC9945a(从土壤中分离得到)和Bacillus subtilis IF03335(从豆制品 中分离得到)等。而生产Y-多聚谷氨酸的方法通常有液体发酵和固体发酵两种。相比较 于液体发酵而言，固体发酵拥有耗能低、设备简易、成本低、产生废弃物少、产量高、回收效 率高等优势，故常用于饲料、食品、能源等微生物发酵工业生产当中。另一方面，规模化养殖后的畜禽粪便及食品发酵工业的下脚料随地弃置等不仅严 重污染了环境，也极大地浪费了大量的养分资源(C、N、P、K、S及微量元素)。本发明旨在从 土壤中分离出一株高产Y-多聚谷氨酸的菌种，该菌株能够以牛粪和味精粕为主要原料， 添加辅料麸皮、玉米粉、黄豆粉、柠檬酸、MgSO4 WH2CKMnSO4 ·Η20，通过固体发酵生产γ-多 聚谷氨酸，具有原料来源广、成本低、发酵工艺简单、产量高、产物提取纯化方便等优势，有 很好的应用前景。
发明内容
技术问题本发明目的在于从土壤中分离一株高产Y-多聚谷氨酸的菌种，利用固体废弃物 和廉价农副产品通过固体发酵生产Y-多聚谷氨酸。技术方案一种能够固体发酵生产Y-多聚谷氨酸的细菌YXY-C1，属于死谷芽孢杆菌 (Bacillus valliSmortiS)，2009年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 34780主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞 形状为杆状，芽孢中生，过氧化氢酶阳性、淀粉水解阳性、V. P.反应阳性、纤维素分解阴性、 明胶水解阳性、硝酸盐还原阳性、吲哚试验阳性，能利用柠檬酸盐，发酵葡萄糖、木糖、蔗糖 产酸产气。该菌株在固体保存培养基上于30°C培养后，可于4°C短期保藏；同时以种子液与 30%甘油按1 1体积比混勻后-70°C下长期冷冻保存，作为原始菌种。生产用菌种需要从 原始菌株转接活化后再利用。
用所述的细菌YXY-CI固体发酵生产Y-多聚谷氨酸的方法，包括以牛粪和 味精粕为培养基主要原料，并添加辅料麸皮、玉米粉、黄豆粉、柠檬酸、MgSO4 · 7H20和 MnS04· H2O,接入YXY-Cl种子液，通过固体发酵生产Y-多聚谷氨酸产品。包括DYXY-CI的种子液制备将菌株YXY-Cl接种到种子液培养基中，摇瓶发酵生产种子液，发酵条件为pH生 长范围7. 0-7. 2，培养温度30°C，搅拌速度为180-200转/分钟，发酵时间为16-20小时，发 酵液中的菌体含量或芽孢量> IX IO9个/ml ；所用种子液培养基的配制方法为(以配制IL 培养基为例)称取蛋白胨10克，酵母膏10克，氯化钠(NaCl) 10g，用水定容至1L，pH值调 制 7. 0-7. 2，121°C灭菌 20 分钟。2)配制固体发酵培养基固体发酵培养基(20g)配制方法为牛粪2.94g，味精粕2. 10g，豆粕1.92g，麸皮 0. 8g，玉米粉 0. 59g，柠檬酸 0. 16g，硫酸镁(MgSO4 ·7Η20)0· 04g，硫酸锰(MnSO4 ·Η20)0· 024g, 用磷酸缓冲液调节PH至7. 0，调节含水量为60%，121°C灭菌20分钟。3)固体发酵条件将种子液以5%的接种量接种到固体发酵培养基中，充分搅拌均勻，置于恒温箱中 静置培养，固体发酵温度为37°C，恒温箱中湿度保持在60%以上，每隔12小时搅拌发酵基 质一次，发酵时间为48小时。4) Y"多聚谷氨酸的提取纯化发酵结束后，向发酵基质中加入IOOml去离子水，振荡混勻后4层纱布过滤取滤 液。滤液离心去除菌体和杂质，即获得含Y-多聚谷氨酸粗提物的上清。上清中加入3倍体积预冷的无水乙醇，静置沉淀Y -多聚谷氨酸4小时，离心获得 沉淀。将沉淀用等量去离子水溶解，将不溶的杂质沉淀，上清即为含有Y-多聚谷氨酸的样 品。将此样品真空冷冻干燥，即可获得纯化的Y-多聚谷氨酸的固体产品，并于-20°C保存。5) Y-多聚谷氨酸产量测定将纯化后的γ -多聚谷氨酸在真空条件下，110°C用6mol/L的HCl水解24小时， 水解液过滤，滤液经旋转蒸发去除HCl后用Biochrom 30专用自动氨基酸分析系统测定其 中游离谷氨酸的含量，即为YXY-Cl菌株固体发酵生产Y -多聚谷氨酸的产量。6) Y-多聚谷氨酸分子量测定采用十六烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定YXY-Cl菌株固体 发酵生产的、~多聚谷氨酸的分子量，、~多聚谷氨酸用阿利新兰-8GX染色(图3)。有益效果Y-多聚谷氨酸分子中有大量游离的亲水性羧基，可在分子内部或分子之间形成 氢键，具有极高的水溶性和吸水保湿性，最高可达1 3500倍。将这种高吸水性物质与土 壤结合，不仅可以改进团粒，还能改进土壤的保墒、保湿、保肥性能，在改造荒山、秃岭、沙漠 方面发挥积极作用。据科技日报2002年8月19日报道，日本九州大学农学系教授原敏夫 等人以Y-多聚谷氨酸为原料，开发出了一种吸水性极强的纳豆树脂，用这种树脂把植物 种子包起来，在植物不能生长的沙漠及缺水地区种植，可很快发芽，效果十分理想。本发明从土壤中筛选出一株可高效产生Y-多聚谷氨酸的野生菌株YXY-Cl，选用 规模化养殖后的畜禽粪便(牛粪)及食品发酵工业的下脚料(味精粕)为主要原料，并添加一些廉价的农副产品，如麸皮，玉米粉，豆粕等为辅料，通过固体发酵生产Y “多聚谷氨酸， 不仅可以提供解决畜禽粪便和发酵产业下脚料环境污染和养分流失问题的新方法，而且可 以生产Y-多聚谷氨酸，变废为宝。该发明所选用的菌株YXY-Cl生产Y-多聚谷氨酸性能 稳定，固体发酵工艺简单，耗能低，产量高，产物回收简单高效，故具有很强的应用价值。
四
图1是YXY-Cl菌株液体发酵提取纯化的固体Y -多聚谷氨酸。为白色或略带黄 色的絮状物。图2是YXY-Cl菌株固体发酵完成提取纯化的产物Y -多聚谷氨酸的SDS-PAGE图 谱。泳道1为标准蛋白，泳道2为上样缓冲液，泳道3为固体发酵经纯化的Y-多聚谷氨酸， 分子量为130-300KD。图3是YXY-Cl菌株的相关照片。1为YXY-Cl菌株的革兰氏染色照片；2为YXY-Cl 菌株的芽孢染色照片；3为YXY-Cl菌株的荚膜染色照片；4为YXY-Cl菌株的平板菌落拉丝 照片生物材料保藏细菌YXY-C1，属于死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)，2009 年 11 月 30 日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCN0. 3478。
五具体实施例方式(一 )菌株分离和鉴定培养基固体选择性培养基(g/L)柠檬酸10，谷氨酸 10，NH4C16，K2HPO4I,MgSO4 ·7Η20 0. 5， FeCl3 · 6Η20 0. 02，CaCl2O. 2，MnSO4 · H2O 0. 05，琼脂 20，ρΗ 7· 2。种子液培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，ρΗ 7. 0。液体摇瓶发酵培养基(g/L):柠檬酸13. 5，谷氨酸10，NH4ClB. 8，甘油75，K2HPO4I, MgSO4 · 7H20 0. 5，FeCl3 · 6H20 0. 02CaCl20. 2，MnSO4 · H2O 0. 05，ρΗ 7· 2。斜面保存培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，琼脂20，ρΗ 7. 0。菌株分离称取采集于江苏省南京市玄武区附近的菜园土样10g，放入装有90ml无菌水及玻 璃珠的三角瓶内，室温下150转/分钟振荡30分钟后，沸水浴3-5分钟，再依次制成ΚΓ1， ΙΟ"2, ΙΟ"3, ΙΟ"4, ΙΟ"5, ΙΟ"6不同稀释度的土壤悬液，最后涂布于固体选择性培养基上。将平板 至于37°C培养箱中培养1-2天。从平板上挑选粘度较大，且能够拉丝的菌落，划线接种到固 体选择性培养基上，直到获得纯培养。接种环挑取一环平板上单菌落接种到种子培养基中，30°C下170转/分钟培养16 小时，将种子液按5%接种量接种到液体摇瓶发酵培养基中(1/5装液量)，30°C下170转/ 分钟摇床培养48小时后，发酵液10000转/分钟离心30分钟后，取上清，加入3倍体积的 预冷的无水乙醇，静置过夜，12000转/分钟离心30分钟后弃上清，沉淀用去离子水溶解后， 透析过夜，冷冻干燥得到固体初提物。初提物用去离子水溶解，12000转/分钟离心10分 钟，上清加20mg/ml蛋白酶K，去离子水透析过夜，12000转/分钟离心10分钟，取上清液真空冷冻干燥，得到固体Y -PGA纯品(图1)，于-20°C保存。取纯化的γ-PGA样品0.2g放入水解管中，加入IOmL 6mol/L的HC1，抽真空，维持 IOmin后封口，110°C水解24小时，冷却后过滤，再用旋转式蒸发仪去除HCl，洗提三次，最后 定容到10ml。采用Biochrom 30专用自动氨基酸分析系统对水解产物进行分析，测其中游 离谷氨酸含量。经计算后，YXY-Cl菌株在液体摇瓶培养基中的产量可达到18. 4g/L。经过 几次传代培养后证明，YXY-Cl菌株在液体摇瓶培养基中的产量稳定。最终选取Y -多聚谷氨酸产量最高的菌种YXY-C1，纯培养菌种划线接种于固体保 存培养基上，4°C保存，每隔一个月转接活化一次；并以种子液与30%甘油按1 1体积比 混勻后-70°C下长期保存，作为原始菌种。生产用菌种需要从原始菌株转接活化后再利用。菌种鉴定通过生理生化鉴定和16S rDNA将菌株YXY-Cl鉴定到属种。其平板特性为菌落 为圆形，菌落表面光滑发亮，边缘整齐，中间突起，无色或略带黄色，半透明到透明，且粘度 较大；主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞形状为杆状，芽孢中生，过氧化氢酶阳性、 淀粉水解阳性、V. P.反应阳性、纤维素分解阴性、明胶水解阳性、硝酸盐还原阳性、吲哚试验 阳性，能利用柠檬酸盐，发酵葡萄糖、木糖、蔗糖产酸产气；经16S rDNA鉴定为一株死谷芽 抱杆菌 Bacillus vallismortis。( 二 )固体发酵生产Y -多聚谷氨酸种子液制备种子液培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH 7. 0。接种环挑取一环活化的YXY-Cl单菌落接种到种子液培养基中，30°C下170转/分 钟培养16小时，经显微镜镜检后，确定菌体形态单一，且芽孢形成较少，以此为固体发酵一 级种子液。将一级种子液再按5%接种量接种于种子液培养基中，30°C下170转/分钟培养 16小时，镜检后，作为固体发酵二级种子液备用。固体发酵培养基固体发酵在250ml三角瓶中进行，发酵培养基装入量为20g，成分为牛 粪2. 94g，味精粕2. IOg,豆粕1. 92g，麸皮0. Sg,玉米粉0. 59g，柠檬酸0. 16g，硫酸镁 (MgSO4 ·7Η20)0. 04g，硫酸锰(MnSO4 ·Η20)0. 024g，用磷酸缓冲液调节pH至7. 0，调节含水量 为60%，121°C灭菌20分钟。固体发酵条件将固体发酵二级种子液以5%的接种量接种到固体发酵培养基中，充分搅拌均勻。 将三角瓶置于恒温箱中静置培养，固体发酵温度为37°C，恒温箱中湿度保持在60%以上， 每隔12小时彻底搅拌发酵基质一次，以保证菌体在固体发酵培养基中均勻生长，发酵时间 为48小时。γ -多聚谷氨酸提取纯化发酵结束后，向发酵基质中加入IOOml去离子水，室温下于摇床内160转/分钟振 荡混勻，悬浊液用4层纱布过滤，滤液12000转/分钟离心30分钟去除菌体和杂质，即获得 含Y-多聚谷氨酸粗提物的上清。上清中加入3倍体积预冷的无水乙醇，4°C下静置沉淀 Y “多聚谷氨酸4小时，12000转/分钟离心30分钟获得沉淀。将沉淀用等量去离子水溶 解，12000转/分钟离心10分钟将不溶的杂质沉淀，上清即为含有Y-多聚谷氨酸的样品。将此样品真空冷冻干燥，即可获得纯化的Y -多聚谷氨酸的固体样品，并于-20°C保存。固体发酵Y -多聚谷氨酸的产量分析称取纯化的γ -PGA样品0. 2g放入水解管中，加入IOmL 6mol/L的HC1，抽真空， 维持10分钟后，密封封口，110°c水解24h，冷却后过滤，再用旋转式蒸发仪去除HCl，洗提三 次，最后定容到10ml，每一步均采用超纯水进行处理。水解液过滤浓缩后用Biochrom 30专 用自动氨基酸分析系统测定其中游离谷氨酸的含量。经计算和换算后得知，YXY-Cl菌株在 此固体发酵培养基中Y “多聚谷氨酸的产量为39g/kg培养基。γ -多聚谷氨酸分子量测定采用十六烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定YXY-C 1菌株固 体发酵生产的Y-多聚谷氨酸的分子量，Y-多聚谷氨酸用阿利新兰8GX染色(图2)，可见 YXY-Cl菌株固体发酵生产的Y-多聚谷氨酸的分子量分布在130kD-300kD以上的范围内， 属于高分子聚合物。
权利要求
一种固体发酵生产γ 多聚谷氨酸的细菌YXY C1，属于死谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)，2009年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.3478，主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞形状为杆状，芽孢中生，过氧化氢酶阳性、淀粉水解阳性、V.P.反应阳性、纤维素分解阴性、明胶水解阳性、硝酸盐还原阳性、吲哚试验阳性，能利用柠檬酸盐，发酵葡萄糖、木糖、蔗糖产酸产气。
2.用权利要求1所述的细菌YXY-Cl固体发酵生产Y-多聚谷氨酸的方法，包括以牛 粪和味精粕为主要原料，添加辅料麸皮、玉米粉、豆粕、柠檬酸、MgSO4 · 7H20和MnSO4 · H2O, 接入YXY-Cl种子液，通过固体发酵生产Y-多聚谷氨酸。
3.根据权利要求2所述生产Y-多聚谷氨酸的方法，其特征在于1)将权利要求1所述的菌种YXY-C1接种到种子液培养基中，摇瓶发酵生产种子液，发 酵条件为φΗ生长范围7. 0-7. 2，培养温度30°C，搅拌速度为180-200转/分钟，发酵时间 为16-20小时，发酵液中的菌体含量或芽孢量> IX IO9个/ml ；所用种子液培养基的配制方 法为，以配制IL培养基为例称取蛋白胨10克，酵母膏10克，氯化钠10g，用水定容至1L， PH值调制7. 0-7. 2，121°C灭菌20分钟；2)配制固体发酵培养基20g，其方法为牛粪2.94g，味精粕2. IOg,豆粕1. 92g，麸皮 0. 8g，玉米粉 0. 59g，柠檬酸 0. 16g，MgSO4 · 7Η200· 04g, MnSO4 · H2OO. 024g,用磷酸缓冲液调 节pH至7.0，调节含水量为60%，121°C灭菌20分钟；3)将种子液以5%的接种量接种到固体发酵培养基中，充分搅拌均勻，置于恒温箱中 静置培养，固体发酵温度为37°C，恒温箱中湿度保持在60%以上，每隔12小时搅拌发酵基 质一次，发酵时间为48小时。
4.根据权利要求2或3所述生产Y-多聚谷氨酸的方法，其特征在于1)发酵基质中加入IOOml去离子水，摇床振荡混勻后4层纱布过滤取滤液，滤液离心去 除菌体和杂质，上清即为含Y-多聚谷氨酸粗提物的产品。2)向含Y-多聚谷氨酸粗提物的上清液产品中加入3倍体积预冷的无水乙醇，4°C静置 沉淀Y “多聚谷氨酸4小时，离心获得沉淀，沉淀用等量去离子水溶解，离心将不溶的杂质 沉淀，上清真空冷冻干燥，即可获得纯化的Y -多聚谷氨酸的固体产品。
5.权利要求2-4之一所述方法获得的Y-多聚谷氨酸产品。
6.权利要求5所述Y-多聚谷氨酸产品的应用。
7.权利要求2-4之一所述方法获得Y-多聚谷氨酸产品的的测定方法，包括1)将纯化后的Y-多聚谷氨酸在真空条件下，110°c用6mol/L的HCl水解24小时；2)水解液过滤，滤液经旋转蒸发去除HCl后用Biochrom30专用自动氨基酸分析系统 测定其中游离谷氨酸的含量，即为YXY-Cl菌株固体发酵生产Y -多聚谷氨酸的产量。
全文摘要
本发明公开了一种固体发酵生产γ-多聚谷氨酸的细菌YXY-C1及其产品，属于微生物发酵技术领域。本发明分离到了一株高效产生γ-多聚谷氨酸的菌株YXY-C1，该菌株能够以牛粪和味精粕为主要原料，并添加辅料麸皮、玉米粉、豆粕、柠檬酸、MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O，通过固体发酵生产γ-多聚谷氨酸，产量达到39g/kg培养基，分子量可达300kD。本发明的优点是菌株YXY-C1能够利用固体废弃物和廉价的农副产品发酵生产γ-多聚谷氨酸，原料成本低，方法简单，产量高，产物提取纯化方便，具有潜在的应用前景。
文档编号C09K17/18GK101948769SQ20101025851
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者冉炜, 尹成红, 徐阳春, 杨兴明, 沈其荣, 雍晓雨 申请人:南京农业大学