Hmg1基因及其在家蚕微孢子虫分子检测中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了家蚕微孢子虫 HMG1 基因，以及一对特异性的快速检测家蚕微孢子虫的引物组及其应用。所述引物组包括上游引物HMG1-sF和下游引物HMG1-sR，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。该检测引物的靶基因为与家蚕微孢子虫性别有关的高移动蛋白基因 HMG1 ，以该基因作为家蚕组织特别是蚕卵微孢子虫分子检测的靶基因，检测结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，可用于家蚕微孢子虫高灵敏度快速分子检测，尤其是蚕种家蚕微孢子虫的早期检测，具有重要的实际应用意义。
【专利说明】HMG1基因及其在家蚕微孢子虫分子检测中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于昆虫病原微生物分子检测【技术领域】。更具体地，涉及基因及其在家蚕微孢子虫分子检测中的应用。
【背景技术】
[0002]家蚕微粒子病(又名家蚕微孢子虫病)的研宄始于1845年发生在法国的全国流行微粒子病，巴斯德确定他观察到的“微粒”是微粒子病的成因因素，后来Balbiani确定其为家蚕微孢子虫bombyci^.V.Maddox等，2000)。家蚕微孢子虫有水平传播和垂直传播两种传染途径，其中垂直传播对蚕业生产中的蚕种生产造成巨大的危害，同时对丝茧育蚕茧产量和品质带来很大的负面影响，严重影响蚕丝产业链下游经济的发展(蔡顺风等，2011)。自法国全国微粒子病爆发以来，家蚕微孢子虫始终是各国蚕种生产和进出口贸易的重要检测对象。19世纪末，在日本养蚕业最发达的时期，《母蛾镜检法》、《蚕病预防法》曾被写入宪法(Takeshi Kawarabata，2003)，我国也将其列为进出口动物检疫二类疫病[《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》，(1992)农(检疫)字第12号]。
[0003]最初人们判别家蚕微孢子虫主要根据家蚕微粒子病的发病特点进行肉眼观察。显微镜发明以后，人们根据微孢子虫的形态和大小进行显微镜镜检，一定程度上提高了检测的灵敏度和效率，并因此遏制了法国全国流行的微粒子病，拯救了世界的养蚕业。但是显微镜镜检有明显的缺点，如对操作人员的技术及经验要求较高，而且家蚕微孢子虫个体及其微小，常用的显微镜镜检检测方法特异性和灵敏度较低，难以区分微孢子虫类似物，特别是蚕卵中的家蚕微孢子虫一般都是未成熟的孢子，普通光学显微镜根本无法鉴别判定等。
[0004]随着PCR技术的普及，人们开始使用PCR方法来检测家蚕微孢子虫并且达到了较高的灵敏度。“分子钟”是分子水平分析生物系统进化中的有效手段，SSU rRNA (16S rDNA)是微生物进化研宄中常用的“分子钟”(Pei A Y, et al., 2010)。家蚕微粒子病PCR检测技术研宄中所设计的引物针对的靶基因多数也是SSUrRNA，针对其他微孢子虫基因设计的引物较少或灵敏度较差，因而很少被报道。Baker et al (1995)和Terry et al (1999)根据相近种属微孢子虫SSU rRNA高度保守区设计的PCR引物Vlf/530r，可鉴别多种种属的微孢子虫的DNA模板扩增约450bp的特异目的条带，但是对家蚕微孢子虫不具有特异性，而且本发明人研宄发现，使用该引物检测蚕卵微孢子虫，检测的灵敏度极低，暗示蚕卵抽提物中可能存在某种抑制因素干扰了对家蚕微孢子虫(N.b)DNA的PCR扩增。另一方面，微孢子虫寄生于蚕卵中，且蚕卵含量明显高于要检测的微孢子虫，在提取获得的DNA样品中，两者DNA同时存在，家蚕蚕卵DNA对检测造成严重的干扰，因此，如果想要直接以蚕卵DNA为模板进行微孢子虫的检测，对检测提出了更高的要求。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有家蚕微孢子虫检测技术的不足，以家蚕微孢子虫HMG 1基因为靶基因设计检测引物，该引物可以以家蚕DNA/cDNA、家蚕蚕卵DNA/cDNA或家蚕中肠DNA/cDNA等为模板，并且检测结果可靠、易于操作(简单快速)、特异性强、灵敏度高，可用于家蚕微孢子虫的快速检测，尤其是侵染早期检测和蚕卵中家蚕微孢子虫的快速检测。
[0006]本发明的目的是提供一种家蚕微孢子虫基因。
[0007]本发明另一目的是提供一组以家蚕微孢子虫基因为靶基因、快速检测家蚕微孢子虫的引物组及其在制备家蚕微孢子虫检测试剂盒方面的应用。
[0008]本发明的再一目的是提供一种家蚕微孢子虫检测试剂盒。
[0009]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明公开了一种家蚕微孢子虫邏基因，其DNA全长核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]本发明还提供了一组以M2基因为靶基因的快速检测家蚕微孢子虫的引物组，所述引物组包括上游引物HMGl-sF和下游引物HMGl-sR，上游引物HMGl-sF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，下游引物HMGl-sR的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0011]基于本发明人对家蚕微孢子虫—2基因的研宄实验和针对性分析总结，选择家蚕微孢子虫基因序列作为本发明PCR检测的靶基因，所述引物灵敏、快速、特异性高，依据本引物可有效地检测家蚕微孢子虫，尤其是对侵染早期的检测和蚕卵中家蚕微孢子虫的快速检测，具有重要的意义。
[0012]本发明还提供所述快速检测家蚕微孢子虫的引物组在制备家蚕微孢子虫检测试剂盒方面的应用。提供了一种家蚕微孢子虫检测试剂盒，包括上游引物HMGl-sF和下游引物HMGl-sR，上游引物HMGl-sF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，下游引物HMGl-sR的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0013]优选地，所述试剂盒的使用方法如下:
以家蚕DNA/cDNA、家蚕蚕卵DNA/cDNA或家蚕中肠DNA/cDNA为模板，利用引物HMGl-sF和HMGl-sR进行PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增DNA片段的大小判定结果。所述判定结果的标准为:琼脂糖凝胶上出现特异性地684 bp的DNA片段产物，即该家蚕或蚕卵感染了家蚕微孢子虫。
[0014]优选地，所述PCR反应的反应体系为:
2 X反应缓冲液1yL
ΙΟμΜ 引物 HMGl-sF0.5 μ L
ΙΟμΜ 引物 HMGl-sR0.5 μ L
模板DNAI μ L
ddH20补至 20 μ L ;
其中，2X反应缓冲液的组分为Taq DNA聚合酶，160 mM Tris-HCl,40 mM(NH4)2SO4,3.0 mM MgCl2,400 μ M dNTP。
[0015]优选地，所述PCR 反应的程序为:94°C 5 min ；94°C 30 s，50°C 45 s，72°C 45 s,32 个循环；72°C 10 min。
[0016]本发明具有以下有益效果:
本发明首次克隆了家蚕微孢子虫HMGmi因的DNA和cDNA全长序列，并在此基础上，设计获得了一组特异性、灵敏性非常好的快速检测家蚕微孢子虫的引物组，该引物可用于家蚕微孢子虫病的PCR检测，能够准确地判断样品是否含有家蚕微孢子虫，且可为蚕种生产中“有毒”蚕卵(即感染微孢子虫的蚕卵)的检测及安全发种提供保证。
[0017]另外，本发明引物及相关试剂可组装成试剂盒，使用方便。而且适用的PCR扩增模板非常多样，适用范围广，如PCR模板可以是家蚕DNA/cDNA、家蚕蚕卵DNA/cDNA、家蚕中肠DNA /cDNA等，大大增加了检测对象的范围。
[0018]重要的是，本发明的检测引物和试剂盒能够在家蚕微孢子虫侵染早期就能够特异性的检测出来，而且能够直接以蚕卵DNA为模板进行家蚕微孢子虫的快速检测，为家蚕微孢子虫病的早期检测提供了一种简单快速的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为HMGIF/ HMGlR引物的检测结果；泳道:M:DL1000 ;1:有毒蚕卵DNA，2:纯化的家蚕微孢子虫(N.b) DNA, 3:(正常)无毒蚕卵DNA，4:ddH20。
[0020]图2为HMGl-sF/ HMGl-sR引物的检测结果；泳道:M:DL1000 ；1:有毒蚕卵DNA, 2:纯化的家蚕微孢子虫(N.b) DNA, 3:(正常)无毒蚕卵DNA，4:ddH20。
[0021]图3为HMGl-xF/ HMGl-xR引物的检测结果；泳道:M:DL1000 ；1:有毒蚕卵DNA, 2:纯化的家蚕微孢子虫(N.b) DNA, 3:(正常)无毒蚕卵DNA，4:ddH20。
[0022]图4为HMGIF/ HMGlR引物的特异性检测结果；泳道:M:DL1000 ；1:N.b (家蚕微孢子虫)DNA ；2:N.a (柞蚕微孢子虫)DNA ；3:N.f (玉米螟微孢子虫)DNA ；4:水对照。
[0023]图5为HMGl-sF/ HMGl-sR引物的特异性检测结果；泳道:M:DL1000 ；1:N.b (家蚕微孢子虫)DNA ；2:N.a (柞蚕微孢子虫)DNA ；3:N.f (玉米螟微孢子虫)DNA ；4:水对照。
[0024]图6为HMGl-xF/ HMG1-xR引物的特异性检测结果；泳道:M:DL1000 ；1:N.b (家蚕微孢子虫)DNA ；2:N.a (柞蚕微孢子虫)DNA ；3:N.f (玉米螟微孢子虫)DNA ；4:水对照。
[0025]图7为HMGIF/ HMGlR引物的灵敏性检测结果；泳道:M:DL1000 ； 1-7分别为5.0XlO0、5.0X1'5.0X10_2、5.0X10_3、5.0X10_4、5.0X10_5、5.0X10_6 ng/μ L 的 N.bDNA，8为水对照。
[0026]图8为HMGl-sF/ HMGl-sR引物的灵敏性检测结果；泳道:M:DL1000 ；1~7分别为5.0XlO0、5.0X1'5.0X10_2、5.0X10_3、5.0X10_4、5.0X10_5、5.0X10_6 ng/μ L 的 N.bDNA，8为水对照。
[0027]图9为HMGl-xF/ HMG1-xR引物的灵敏性检测结果；泳道:M:DL1000 ；1~7分别为5.0XlO0、5.0X1'5.0X10_2、5.0X10_3、5.0X10_4、5.0X10_5、5.0X10_6 ng/μ L 的 N.bDNA，8为水对照。
【具体实施方式】
[0028]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试剂、方法和设备。
[0029]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0030]实施例1家蚕微孢子虫HMG 7基因
1、根据分子生物学的基因克隆技术中基因同源克隆的方法，克隆获得了家蚕微孢子虫HMG 2基因的cDNA和DNA全长序列。
[0031]2、cDNA全长的获得，具体方法如下:
(I)运用Primer premier 5.0软件，结合综合分析，设计了引物引物HMGIF/ HMG1R，序列分别如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0032]上游引物HMGlF (SEQ ID N0.3):
5’ ATGACTGCTCAAAAAGACGATAC 3’
下游引物 HMGlR (SEQ ID N0.4):
5’ TTATTCATCACTATCTCCTACTTCT 3’。
[0033](2)以纯化的家蚕微孢子虫(N.b)孢子DNA为模板，以引物HMGIF/ HMGlR进行PCR扩增。
[0034](3)PCR产物经过纯化，连接到pMD19T中，并转化到E，coli DH- 5α中培养。
[0035](4)提取重组质粒，并测序，获得邏基因的cDNA全长，如SEQ ID N0.2所示。
[0036]3、DNA全长的获得
利用基因组高通量测序的方法，并经过大量的基因预测对比分析，最后经PCR测序验证，获得了家蚕微孢子虫HMG 2基因的DNA全长序列，如SEQ ID N0.1所示。
[0037]4、根据测序结果的多次确认，得出家蚕微孢子虫M 2基因的DNA全长序列，如SEQ ID N0.1所示，其cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0038]实施例2检测引物设计及PCR扩增方法的建立
1、引物设计
在获得家蚕微孢子虫/3私7基因的基础上，应用Primer premier 5.0软件设计，设计了多对引物，通过大量的抗药性、特异性和灵敏性检测，最终选取了 3对引物有代表性的引物组，各组引物序列如下:
(I)第一对:
上游引物 HMGlF (SEQ ID N0.3):
5’ ATGACTGCTCAAAAAGACGATAC 3’
下游引物 HMGlR (SEQ ID N0.4):
5’ TTATTCATCACTATCTCCTACTTCT 3’。
[0039](2)第二对:
上游引物 HMGl-sF (SEQ ID N0.5):
TTCCGAAATAATCTTCTTTTAATTG
下游引物 HMGl-sR (SEQ ID N0.6):
TTGTGCACCGAATCGTAAATAG
(3)第三对:
上游引物 HMGl-xF (SEQ ID N0.7):
TCCCTAGGAACTTTTAAAGAGAAG
下游引物 HMGl-xR (SEQ ID N0.8):
TCCTTTTATTCATCACTATCTCCT
2、PCR扩增方法的建立
(I)家蚕或家蚕蚕卵的总DNA的提取采用QIAGEN公司生产的植物DNA小提试剂盒(DNeasy Plant mini kit试剂盒)抽提蚕卵基因组DNA，步骤如下(按照说明书进行):
取20粒蚕卵放入研钵中，液氮充分研磨，将研磨后的粉末收集至1.5mL的离心管中。加Λ 400 μ L裂解缓冲液APl和4 uL Rnase Α，涡旋混匀(400 μ L裂解缓冲液APl和4 μ LRnase A勿在使用前混合)；混匀后的溶液，65°C，孵育10 min (期间上下颠倒试管2~3次)；加130 μ L缓冲液ΑΡ2，混合后冰浴5 min ;然后14，000 rpm，离心5 min ;吸取上清于过滤柱(QIAshredder spin column)中的收集管，14，OOOrpm，离心2min ;将离心管中上清液移至新管(勿搅动出现的残渣)，加入1.5倍体积的AP3/E，移液器混合；将650 yL混合液移至吸附柱(DNeasy Mini spin column)中，4200 rpm，离心I min ;剩下的液体重复此步骤；将吸附柱放入新收集管中，加入500 μ L缓冲液AW，4200 rpm,离心I min ;弃上清；再加入500μ L缓冲液AW，14000 rpm，离心2 min(保证收集管不接触到底部上清);移收集管至1.5 mL或2 mL离心管中；加入40 μ L缓冲液AE洗脱，室温放置5 min ；4200 rpm离心I min ;重复上一步(即加入40 μ L缓冲液AE洗脱，室温放置5 min, 4200 rpm离心I min);将提取好的总DNA置于-20°C冰箱保存备用。
[0040](2) PCR扩增方法
以家蚕或家蚕蚕卵的总DNA为模板，用实施例1所述三对引物进行PCR扩增。
[0041 ] 所述PCR反应体系(总体积20 μ L):
2 X Taq Master Mix (反应缓冲液)1yL
10μ M 上游引物 HMGlF0.5 μ L
10μ M 下游引物 HMGlR0.5 μ L
模板 DNAI μ L ；
ddH20补至 20 yLo
[0042]其中，2XTaq Master Mix (反应缓冲液)的组分为Taq DNA聚合酶，160 mMTris-HCl,40 mM(NH4)2SO4, 3.0 mM MgCl2,400 μΜ dNTP。
[0043]PCR 反应的程序为:94°C 5 min ；94°C 30 s，50°C 45 s，72°C 45 s，32 个循环；72°C 10 min。
[0044](3)结果判断
第一对引物HMG1F/HMG1R:PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到561bp的DNA片段判定蚕卵样品是否感染了家蚕微孢子虫。当能特异性地扩增出561 bp的DNA片段产物，即可判断该家蚕或蚕卵感染了家蚕微孢子虫。
[0045]第二对引物HMGl-sF/HMGl-sR:PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到684 bp的DNA片段判定蚕卵样品是否感染了家蚕微孢子虫。当能特异性地扩增出684bp的DNA片段产物，即可判断该家蚕或蚕卵感染了家蚕微孢子虫。
[0046]第三对引物HMGl-xF/HMGl-xR:PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到251 bp的DNA片段判定蚕卵样品是否感染了家蚕微孢子虫。当能特异性地扩增出251bp的DNA片段产物，即可判断该家蚕或蚕卵感染了家蚕微孢子虫。
[0047](4)分别取50粒“有毒”蚕卵(即感染家蚕微孢子虫的家蚕所产的蚕卵)、健康蚕卵和纯化的家蚕微孢子虫样本，分别提取DNA，按照上述的PCR方法进行PCR扩增。
[0048]琼脂糖凝胶电泳检测结果分别如附图1~3所示，三对引物均可在“有毒”蚕卵和纯化的家蚕微孢子虫中检出特异性的DNA片段，而健康蚕卵中未检测出特异性片段。表明三对引物和建立的PCR方法均可以很好的用于家蚕微孢子虫的快速检测。
[0049]实施例3引物特异性检测
1、分别以家蚕微孢子虫(N.b )、柞蚕微孢子虫(N.a )、玉米螟微孢子虫(N.f )的DNA为模板，以引物 HMGIF/ HMG1R，HMG1-sF/ HMGl-sR，HMG1-xF/ HMGl-xR，以实施例 2 的方法进行PCR扩增，扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0050]2、三对引物的扩增结果分别如附图4~6所示。结果显示，只有引物HMGl-sF/HMGl-sR能特异的检测家蚕微孢子虫，而引物HMGIF/ HMGlR和引物HMGl-xF/ HMGl-xR均能够检测到所有的微孢子虫，具有很好的通用检测性，但是不具有对家蚕微孢子虫的特异性。
[0051]实施例4引物灵敏性检测
1、提取家蚕微孢子虫(N.b)的DNA，原始浓度为5.0 ng/ μ L。
[0052]将上述N.b DNA用ddH20进行稀释，分别稀释10°、1iUO2UO3UO4UO'16倍。即得到浓度梯度为 5.0Χ10'5.ΟΧΙΟ'5.0Χ10_2、5.0Χ10_3、5.0Χ10_4、5.0Χ10_5、5.0X10—6ng/ μ L0
[0053]2、以上述各浓度的 N.b DNA 为模板，以引物 HMGIF/ HMG1R, HMGl-sF/ HMGl-sR，HMG1-xF/ HMGl-xR,以实施例2的方法进行PCR扩增，扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果O
[0054]3、三对引物的扩增结果分别如附图7~9所示。结果显示，引物HMGIF/ HMGlR和引物HMGl-sF/ HMGl-sR均能检测到5.0X 10_4 ng/ μ L浓度的N.b DNA,具有很好的检测灵敏性。而引物HMGl-xF/ HMGl-xR的灵敏性差了 I个数量级，能检测到5.0X 10_3 ng/μ L浓度的 N.b DNAo
[0055]因此，综上所述，从特异性和灵敏性的角度考虑，只有引物HMGl-sF/ HMGl-sR既能够特异性的检测家蚕微孢子虫，又具有很好的检测灵敏性，尤其是检测蚕卵家蚕微孢子虫，为蚕种生产中“有毒”蚕种的检测及安全发种提供了保证，在家蚕微孢子虫的实际检测以及早期蚕卵是否感染了家蚕微孢子虫的检测应用中具有重要的意义。实验结果也表明，HMGl基因是一个很好的检测家蚕微孢子虫的分子靶标。
【权利要求】
1.一种家蚕微孢子虫趟似基因，其特征在于，其DNA全长核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.—组快速检测家蚕微孢子虫的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物HMGl-sF和下游引物HMGl-sR，上游引物HMGl-sF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，下游引物HMGl-sR的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
3.权利要求2所述快速检测家蚕微孢子虫的引物组在制备家蚕微孢子虫检测试剂盒方面的应用。
4.一种家蚕微孢子虫检测试剂盒，其特征在于，包括上游引物HMGl-sF和下游引物HMGl-sR，上游引物HMGl-sF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，下游引物HMGl-sR的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下: 以家蚕DNA/cDNA或家蚕蚕卵DNA/cDNA为模板，利用引物HMGl-sF和HMGl-sR进行PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增DNA片段的大小判定结果。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述PCR反应的反应体系为: 2 X反应缓冲液1yL ΙΟμΜ 引物 HMGl-sF0.5 μ L ΙΟμΜ 引物 HMGl-sR0.5 μ L模板DNAI μ L ddH20补至 20 μ L ; 其中，2Χ反应缓冲液的组分为Taq DNA聚合酶，160 mM Tris-HCl, 40 mM(NH4)2SO4, 3.0mM MgCl2,400 μM dNTP。
7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述PCR反应的程序为:94°C5 min ；94°C 30 s,50°C 45 s,72°C 45 s，32 个循环；72°C 10 min。
8.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述判定结果的标准为:琼脂糖凝胶上出现特异性地684 bp的DNA片段产物，即该家蚕或蚕卵感染了家蚕微孢子虫。
【文档编号】C12Q1/68GK104498509SQ201410755670
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】刘吉平, 宋小景, 程伟 申请人:华南农业大学