家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因及其重组表达载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物领域，特别涉及家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因，还涉及还 有该基因的重组表达载体和应用。
【背景技术】
[0002] 家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫。BmNPV是蚕业生产上最常见且危害最严 重的一类病原，对蚕业影响巨大。如何利用当今发展迅速的基因工程技术，从根本上提高家 蚕病毒抗性，是蚕业领域重要的研宄课题。近些年对宿主抗性基因的研宄表明，干涉或过表 达某些宿主的基因可以影响BmNPV对宿主的感染。因此，干涉或过表达这些宿主基因将成 为防治家蚕感染BmNPV的一种有效策略。
[0003] 基因 RNA 干扰（RNA interference，RNAi)是指外源性双链 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)引发生物体内同源mRNA降解从而表现出的基因转录后沉默现象，现已成为分 子生物学家分析基因组功能和基因治疗的一个有力工具。小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)是RNAi的效应分子，是一类长21?23个核苷酸的双链RNA，在体内可特异性降 解与其序列互补的mRNA而引发RNA沉默。产生siRNA的方法有多种，其中化学合成法简单 易行，但由于siRNA的稳定性较差，在体内易被核酸酶降解，RNAi干扰效应时间短，因而分 子生物学家多采用siRNA表达载体法，即将短发卡RNA (short hairpin RNA，shRNA)对应的 DNA模板序列插入载体启动子后构建RNAi载体，RNAi载体导入体内后持续转录出shRNA， shRNA被RNase III家族的内切核酸酶Dicer剪切成siRNA，从而引发较长时间的RNA沉默效 果。因此，利用RNAi技术，以目的基因为靶标构建RNAi载体，再将其导入家蚕细胞并持续 表达能够导致目的基因 mRNA降解的siRNA，是防治家蚕感染BmNPV和培育家蚕抗病毒品系 的一种有效手段。基因过表达是指将基因序列插入到宿主适用的启动子后，构建目的基因 的表达载体，然后将表达载体导入宿主细胞，从而使目的基因在宿主中的表达量上调。利用 过表达技术将BmNPV抗性基因导入家蚕细胞以增强的家蚕细胞的BmNPV抗性，同样也是防 治家蚕感染BmNPV和培育家蚕抗病毒品系的一种有效手段。
[0004] 近年来，研宄者对REEP基因的研宄只局限于哺乳动物中其对受体的增强作用和 与各类神经性疾病的关系；昆虫中，只有果蝇中有研宄指出果蝇的REEPl基因与果蝇的抗 逆性相关。但迄今为止，尚未见有关家蚕BmREEP基因及其功能的研宄报道。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因；本 发明的目的之二在于提供含有家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因的重组表达载体；本 发明的目的之三在于提供含有上述重组表达载体的转化子；本发明的目的之四在于提供 BmREEPa基因干扰序列或干扰BmREEPa基因表达的RNA干扰载体在制备抗核型多角体病毒 家蚕或家蚕细胞中的应用。
[0006] 为实现上述发明目的，经过研宄后本发明提供如下技术方案：
[0007] 1、家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因，所述BmREEPa基因包括BmREEPa-L和 BmREEPa-S两种剪切体，所述BmREEPa-L的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述BmREEPa-S 的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0008] 2、含有所述家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因的重组表达载体。
[0009] 进一步，所述重组表达载体为干扰BmREEPa基因表达的干扰载体或含有BmREEPa 基因编码区的过表达载体。
[0010] 进一步，所述干扰BmREEPa基因表达的干扰载体为将BmREEPa基因干扰序列连 入经改造的pIZ/V5-His载体而得，所述改造的pIZ/V5-His载体是在pIZ/V5-His载体的 HindIII和KpnI之间连入红色荧光蛋白Dsred表达框的载体。
[0011] 进一步，所述BmREEPa基因干扰序列如SEQ ID No. 5所示。
[0012] 进一步，所述含有BmREEPa基因编码区的过表达载体是将SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示序列连入pIZ/V5-His载体多克隆酶切位点处而得。
[0013] 3、含有所述重组表达载体的转化体。
[0014] 4、BmREEPa基因干扰序列或干扰BmREEPa基因表达的RNA干扰载体在制备抗核型 多角体病毒家蚕或家蚕细胞中的应用。
[0015] 进一步，所述干扰BmREEPa基因表达的RNA干扰载体为将BmREEPa基因干扰序列 连入经改造的pIZ/V5-His载体而得，所述改造的pIZ/V5-His载体是在pIZ/V5-His载体的 HindIII和KpnI之间连入红色荧光蛋白Dsred表达框的载体；所述BmREEPa基因干扰序列 如 SEQ ID No. 5 所示。
[0016] 更进一步，所述家蚕细胞为家蚕卵巢细胞。
[0017] 本发明的有益效果在于：本发明提供了一个与BmNPV感染高度相关的宿主基因， 能够改变家蚕细胞对BmNPV的感染能力。利用本发明的RNAi载体，可以使家蚕细胞对BmNPV 的感染能力下降，达到抗BmNPV的效果；同时也可能为家蚕抗逆性的研宄提供新的素材。
【附图说明】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0019] 图1为BmREEPa基因两种剪切体的序列比对结果。
[0020] 图2为BmREEPa基因干涉与过表达载体的效果检测。
[0021] 图3为Control、导入BmREEPa干涉载体、导入BmREEPa过表达载体后感染BmNPV 后48h的荧光图（A为荧光视野，B为白光视野）。
[0022] 图4为Control、导入BmREEPa干涉载体、导入BmREEPa过表达载体后感染BmNPV 48h病毒滴度测定结果。
[0023] 图5为Control、导入BmREEPa干涉载体、导入BmREEPa过表达载体后感染BmNPV 后48h Vp39基因的定量检测结果。
【具体实施方式】
[0024] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0025] 实施例UBmREEPa基因的克隆
[0026] 从silkDB和transDB中确定其mRNA序列。通过Primer Premier 5. 0软件设计如 下PCR特异引物：上游引物BmREEPa-F :5'_tcacattcggttagccactaaaag_3'（SEQ ID No. 3)， 下游引物 BmREEPa-R :5' -cgcataagcgaagtgctgaaa-3'（SEQ ID No. 4)。然后以感染 BmNPV 的家蚕全蚕cDNA为模板，以BmREEPa-F和BmREEPa-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增程序 为：94°C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸1分钟，共35个循 环；最后72°C延伸10分钟。将扩增所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、切胶回收纯化 后，与PMD19-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌Trans-Tl感受态细胞，用含有氨苄青霉 素（Amp)的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，用含有Amp的LB培养基过夜培 养后提取质粒，然后进行测序。测序结果显示扩增获得的序列为两个剪切体形式，分别命 名为BmREEPa-L和BmREEPa-S，其核苷酸序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,形成的 质粒分别命名为pMD19-T-BmREEPa-L和pMD19-T-BmREEPa-S。将测序获得的BmREEPa-L和 BmREEPa-S进行比对，结果如图1所示。结果显示，BmREEPa-S在序列内部缺失108bp的序 列，其他序列完全相同，表明了 BmREEPa-L和BmREEPa-S是两个不同的剪切体。
[0027] 实施例2、BmREEPa干涉载体和过表达载体的构建
[0028] 1、BmREEPa基因干涉载体的构建
[0029] 根据BmREEPa基因的序列设计3个