实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体及其制备方法，piggyBac载体含有3个末端反向重复序列，位于中间位置的末端反向重复序列为193bp且与左侧末端反向重复序列的方向相同，其制备方法简单，制得的piggyBac载体在转座酶的作用下外侧2个末端反向重复序列插入到家蚕基因组中，然后由转座酶激活中间位置的末端反向重复序列和右侧末端反向重复序列，进而删除中间位置的转座子，从而剩下只有一个末端反向重复序列的转座子，该转座子不能被转座酶激活，从而长期稳定存在于宿主中，实现转基因的长期稳定性；为转基因家蚕素材在实际生产中提供稳定性保障。
【专利说明】实现家蚕转基因长期稳定性的PiggyBac载体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，特别涉及一种实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体实现转基因稳定性的piggyBac载体,还涉及该载体的制备方法。
【背景技术】
[0002]来源于粉纹夜蛾的piggyBac转座子是迄今为止应用最为广泛的转基因载体之一，它在包括哺乳动物、昆虫、原生动物以及涡虫等三十余个不同物种或生殖种系中取得了转基因的成功。piggyBac是典型的II型转座子家族成员，在其内部区域序列(internalregion)编码的转座酶(transposase)的协助下，它通过其两端的末端反向重复序列(ITRs)，在“TTAA”特征靶序列处发生转座插入。转基因即是通过将外源基因序列替换掉piggyBac内部编码转座酶的序列，并由瞬时表达转座酶的方式来实现。随着瞬时表达的转座酶的消失，携带有转基因序列的piggyBac不会再次发生转座。这种模式对于转基因的建立和持续表达十分重要。虽然受未知因素影响，比如内源性的转座酶，或者外部提供的转座酶而导致piggyBac携带的转基因发生再次转座的事件不会对基础研究产生太大影响。但是，piggyBac的长期稳定性对于那些有望应用到实际生产上去的转基因品系却尤其重要。
[0003] 家蚕不仅是重要的经济产丝昆虫，为农业经济做出卓越贡献。同时家蚕也是公认的鳞翅目昆虫模式生物代表，推动了生命科学的发展。随着家蚕基因组的解析，对家蚕的研究已经进入功能基因组时代。自从2000年Tamura等人报告piggyBac的转基因技术在家蚕中成功应用的案例后，该技术被广泛的应用到家蚕的基础与应用研究中。许多家蚕的功能基因通过该技术得以详细的诠释。更为重要的是，该技术也成为家蚕遗传改良的有力工具，被广泛的用于蚕丝力学性能改良、转基因家蚕生物反应器以及转基因家蚕抗性素材培育等应用研究中，并取得巨大进展。随着PiggyBac技术在家蚕中的广泛使用，越来越多的跟实际应用紧密相关的转基因家蚕正被逐步的推向实用化，并且Xu等人曾报道过家蚕基因中存在许多PiggyBac-1ike的转座子元件,并且推测相当一部分还具有转座活性。因此对家蚕转基因的PiggyBac载体进行改进以提高转基因在家蚕基因组中的长期稳定显得尤为重要。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体，提闻转基因在家香基因组中的长期稳定性；本发明的目的之二在于提供该载体的制备方法，其制备方法简单。
[0005]为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案:
[0006]1、实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体,所述piggyBac载体含有3个末端反向重复序列，位于中间位置的末端反向重复序列小于679bp且与左侧末端反向重复序列的方向相同。[0007]优选的，所述位于中间位置的末端反向重复序列为193bp。
[0008]优选的，所述位于中间位置的末端反向重复序列的序列如SEQ ID N0.5所示。
[0009]更优选的，所述piggyBac载体依次包括左侧反向重复序列，外源基因表达框1、位于中间位置的末端反向重复序列、外源基因表达框II和右侧末端反向重复序列。
[0010]优选的，所述外源基因表达框I与位于中间位置的末端反向重复序列之间还包括限制性酶切位点。
[0011]优选的，所述限制性酶切位点为AscI限制性酶切位点。
[0012]更优选的,所述piggyBac载体的序列如SEQ ID N0.7所示。
[0013]2、所述实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体的制备方法，包括如下步骤:以pBac [3xp3-EGFPaf]载体为模板，设计扩增左侧反向重复序列的引物，然后进行PCR扩增，然后将扩增产物通过MluI和AscI酶切，酶切后插入到pBac [3xp3_EGFPaf]载体的AscI位点，筛选插入方向与pBac[3xp3-EGFPaf]载体的左侧反向重复序列同向的载体，得实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体。
[0014]优选的，所述扩增左侧反向重复序列的引物如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。
[0015]本发明的有益效果在于:本发明公开了实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体，通过设计含有3个末端 反向重复序列(ITRs)的piggyBac转基因载体,转座子在整合基因组后载体转座从而删除内部转座子，剩下只有一个末端反向重复序列的片段，该片段不论在有转座酶或无转座酶的条件下均不能再次激活，因此可实现家蚕转基因的长期稳定性，并且该PiggyBac载体的制备方法简单，能够大批量获得，该载体的获得对家蚕转基因素材的开发应用具有重大意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0017]图1 为 pBac[3ITRs679_AscI]和 pBac[3ITRsl93_AscI]载体结构图(A:pBac[3ITRsl93-AscI]载体结构；B:pBac [3ITRs679_AscI]载体结构)。
[0018]图2为3xp3DsRed/3xp3EGFP和DsRed荧光表型转基因家蚕的筛选(A:卵期第7天荧光图，a-a’’为3xp3DSRed/3xp3EGFP荧光表型分别在白光、绿色荧光和红色荧光下观察，b-b’’为3xp3DSRed荧光表型分别在白光、绿色荧光和红色荧光下观察；B:蚁蚕荧光图，a-a’’为3xp3DSRed/3xp3EGFP荧光表型分别在白光、绿色荧光和红色荧光下观察，b-b’’为3Xp3DsRed荧光表型分别在白光、绿色荧光和红色荧光下观察；C:蛹期荧光图，a-a’’为3xp3DSRed/3xp3EGFP荧光表型分别在白光、绿色荧光和红色荧光下观察，b-b’’为3xp3DSRed荧光表型分别在白光、绿色荧光和红色荧光下观察；D:蛾期荧光图，a-a’ ’为3Xp3DsRed/3Xp3EGFP荧光表型分别在白光、绿色荧光和红色荧光下观察，b_b’ ’为3xp3DsRed荧光表型分别在白光、绿色荧光和红色荧光下观察，标尺大小为2mm)。
[0019]图3为含3个末端反向重复序列的piggyBac转基因载体实现长期稳定性的原理图。
[0020]图4为转基因转基因家蚕中的分子检测结果(A:引物设计示意图；B:基因组PCR检测图；C:基因组Southern Blot图，探针为地高辛标记的EGFP探针)。
[0021]图5为家蚕后代转基因稳定性调查结果(A:3Xp3DSRed/3Xp3EGFP家蚕后代的荧光观察，a为红色荧光观察结果，b为绿色荧光观察结果，c为白光观察结果，3xp3EGFP荧光的丢失如b中箭头所示，标尺大小为2mm ；B:3Xp3DSRed转基因家蚕后代的荧光观察，a_a’’分别表示Gl代蚕卵分别在红色荧光、绿色荧光和白光下观察结果，b-b’ ’分别表示G2代蚕卵分别在红色荧光、绿色荧光和白光下观察结果c-c’ ’分别表示G3代蚕卵分别在红色荧光、绿色荧光和白光下观察结果，d-d’’分别表示G4代蚕卵分别在红色荧光、绿色荧光和白光下观察结果e-e’’分别表示G5代蚕卵分别在红色荧光、绿色荧光和白光下观察结果，标尺大小为2mm ；C:基因组PCR检测，引物F1/R1，F2/R2和F3/R3所扩增的序列；D:转座酶基因在3xp3DSRed转基因家蚕后代中的转录表达检测)。
【具体实施方式】
[0022]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0023]本发明中所使用的家蚕品种为大造(Dazao)，由本实验室保存。家蚕由桑叶或人工饲料在25 °C人工气候箱中饲养。质粒载体pSLfall80fa (Carsten Horn, et al2000)、pBac[3xp3EGFPaf](Carsten Horn, et al2000), pBac[3xp3DsRedaf](Aichun Zha0.etal2010)由本实验室保存。
[0024]实施例1、转基因载体的构建
[0025]构建含有3个末端反向重复序列(ITRs)的piggyBac转基因载体,具体步骤如下:
[0026](I)根据pBac[3xp3EGFPaf]载体序列，设计两条扩增piggyBac左侧反向重复序列(ITR)的引物，具体为:PiggyL_F (679)-Mlu1: 5’ -ggcacgcgtagatctgacaatgttcagtg-3’ (SEQ ID N0.1)，下划线为 MluI 酶切位点，PiggyL-F(193)-Mlu1:5，-ggcacgcgtgtcattttgactcacgcggt-3，(SEQ ID N0.2)，下划线为 MluI 酶切位点，下游引物为 PiggyL-R-ASC1:5，-aaggcgcgcctcgagtaaagcgcaaatc-3，(SEQ ID N0.3),下划线表示 ASCI 酶切位点。然后以 pBac [3xp3-EGFPaf]载体为模板，分别以 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.3，SEQ ID N0.2 与SEQ ID N0.3为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为:94°C预变性4分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸45秒，共30个循环；最后72°C延伸10min，4°C保存。将扩增获得片段分别命名为L2-679(SEQ ID N0.4)和L2-193 (SEQ ID N0.5)，并回收扩增片段连接到测序载体上进行测序鉴定。然后通过MluI和AscI酶切PCR扩增产物，酶切后分别插入到pBac[3xp3EGFPaf]载体的AscI位点中，然后经测序鉴定并筛选L2-679和L2-193的插入方向与pBac[3xp3EGFPaf]载体自身的左侧ITRs序列同向的载体,分别得pBac [3xp3EGFP,L2-679af] (SEQ ID N0.6)和 pBac[3xp3EGFP,L2-193af] (SEQ ID N0.7)。SEQ ID N0.6 中，第5~1056位为PiggyR，第1055~1328位为3xp3启动子，第1329~2049位为EGFP编码区，第2050~2308位为SV40终止子，第2321~2999位为扩增所得L2-679，第3026~3033位为AscI限制酶识别位点，第3036~3043位为FseI限制酶识别位点，第3062~3740位为PiggyL ；SEQ ID N0.7中第5~1056位为PiggyR，第1055~1328位为3xp3启动子，第1329~2049位为EGFP编码区，第2050~2308位为SV40终止子，第2321~2513位为扩增所得L2-193，第2540~2547位为AscI限制酶识别位点，第2550~2557位为FseI限制酶识别位点，第2576~3254位为PiggyL。[0027](2)根据pBac[3xp3DsRedaf]载体序列，设计扩增3xp3DsRed的引物，具体为:3xp3DsRed-F~Mlu1:5’ -ggcacgcgtaattcgagctcgcccg-3’ (SEQ ID N0.8),下划线为 MluI 酶切位点；3xp3DsRed-R_ASC1:5，-aaggcgcgccatcgataagctttaagatac_3’ (SEQID勵.9)，下划线为八5(:1酶切位点，然后以？8&(3[31?3081^(1&幻为模板，SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为:94°C预变性4分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸90秒，共30个循环；最后72°C延伸10min，4°C保存。扩增获得3Xp3DsRed序列，然后将扩增获得的序列3Xp3DsRed通过MluI和AscI酶切后分别插入到步骤(1)获得的 pBac[3xp3EGFP，L2_679af]和 pBac[3xp3EGFP，L2_193af]中，形成pBac[3xp3EGFP, L2-679，3xp3DsRedaf]和 pBac[3xp3EGFP， L2-193，3xp3DsRedaf]，分别简称为 pBac[3ITRs679-AscI]和 pBac [3ITRsl93_AscI]，结构如图1 所示。由图1 可知，PBac[3ITRsl93-AscI]载体内部含有两个同向的左侧ITRs，一个在外侧长度为679bp，命名为LI，一个在内部长度为193bp，命名为L2，右侧ITR长度为1052bp，命名为R1。LI与L2之间含有一个红色荧光筛选基因3xp3DSRed荧光筛选基因和AscI位点供外源基因的构建使用，L2与Rl之间含有3Xp3EGFP荧光筛选基因(图1A)。pBac[3ITRs679_AscI]的内部结构与pBaC[3ITRS193-ASCI]相似，不同的是其内部的L2序列长度与外侧的LI长度一样，都为 679bp (图1B)。获得的 pBac [3ITRs679_AscI]和 pBac [3ITRsl93_AscI]分别含有 3 个末端反向重复序列，因此在转座酶的作用下首先通过外侧的L1/R1将整个载体序列插入到家蚕基因组中去，然 后由转座酶激活内侧的L2/R1发生再次转座进而删除L2/R1，剩下一个LI转座臂，不管有无转座酶的存在，其都不能发生转座，因而实现家蚕转基因长期稳定性。由于短的转座子比长的转座子更容易发生转座。因此，改造后的PiggyBac载体中，L2/R1会比L1/R1更容易首先发生基因组整合。为了提高L1/R1首先发生转座的频率，本研究将L2的转座臂序列缩短到193bp，希望以此减弱L2/R1首先发生转座的频率，从而增加L1/R1首先转座的概率。
[0028](3)为测试改造后的piggyBac载体是否可以实现转基因插入以及再次转座，将活性hsp70启动子驱动表达的piggyBac转座酶基因的表达框(hsp70PIG)通过AscI分别构建到上述两个载体中，形成 pBac{3ITRs679-hsp70PIG}和 pBac {3ITRsl93_hsp70PIG}。具体步骤为:根据phspBac vector序列(Handler AM等，1999),设计扩增活性hsp70启动子驱动的PiggyBac转座酶基因(hsp70PIG)的引物序列，具体为:Helper-F，5’ -aaggcgcgccctcattaggcaccccagg-3J (SEQ ID N0.10),下划线为 ASCI 酶切位点，Helper-R,5? -aaggcgcgcctcaacaaacaa tttatttatgttta-3，(SEQ ID N0.11),下划线为ASCI酶切位点，然后以phspBac质粒为模板，以SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示序列为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为:94 V预变性4分钟，94 V变性30秒，56 V退火30秒，72 °C延伸150秒，共30个循环；最后72°C延伸lOmin，4 °C保存。扩增获得hsp70启动子驱动的PiggyBac转座酶基因(hsp70PIG)，然后通过AscI位点分别构建到pBac[3ITRs679-AscI]和 pBac[3ITRsl93_AscI]载体中，形成 pBac[3ITRs679_hsp70PIG]和pBac[3ITRS193-hSp70PIG]，即获得含3个末端反向重复序列的piggyBac转基因载体，并将获得的含3个末端反向重复序列的piggyBac转基因载体转化入大肠杆菌感受态细胞Transl-Tl 中。
[0029]本实施例中构建含3个末端反向重复序列的piggyBac转基因载体是通过MluI和AscI同尾酶连接策略实现。
[0030]实施例2、制备和筛选转基因家蚕
[0031]转基因家蚕的制备采用显微注射与荧光筛选进行，具体为:利用质粒提取试剂盒从大肠杆菌中提取 pBac[3ITRs679-hsp70PIG]和 pBac[3ITRsl93_hsp70PIG]载体的质粒DNA，然后按照400ng/y L的浓度分别注射已解除滞育家蚕早期胚胎，随后用无毒胶水对注射孔进行封口，经35%的甲醛蒸汽消毒5分钟后置于25°C、相对湿度为85%的环境中孵化，孵化得GO代幼虫，将GO代幼虫采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交或回交制种，获得的Gl代蚕卵，将获得的Gl代蚕卵在第7天时用宏观体视荧光显微镜(Olypus MVXlO,日本)下检测，在波长为510~550nm的激发光条件下观察红色荧光，在波长为460~490nm的激发光条件下观察绿色荧光，筛选同时在眼睛或神经特异激发绿色荧光和红色荧光的转基因阳性蛾圈或者只发红色荧光的转基因阳性蛾圈(图2)，并统计，结果如表1所示。
[0032]表1、转基因家蚕荧光筛选统计结果
【权利要求】
1.实现家蚕转基因长期稳定性的PiggyBac载体,其特征在于:所述piggyBac载体含有3个末端反向重复序列，位于中间位置的末端反向重复序列为193bp且与左侧末端反向重复序列的方向相同。
2.根据权利要求1所述实现家蚕转基因长期稳定性的PiggyBac载体，其特征在于:所述位于中间位置的末端反向重复序列的序列如SEQ ID N0.5所示。
3.根据权利要求1或2所述实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体，其特征在于:所述PiggyBac载体依次包括左侧反向重复序列，外源基因表达框1、位于中间位置的末端反向重复序列、外源基因表达框II和右侧末端反向重复序列。
4.根据权利要求3所述实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体，其特征在于:所述外源基因表达框I与位于中间位置的末端反向重复序列之间还包括限制性酶切位点。
5.根据权利要求4所述实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体，其特征在于:所述限制性酶切位点为AscI限制性酶切位点。
6.根据权利要求5述实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体,其特征在于:所述piggyBac载体的序列如SEQ ID N0.7所示。
7.权利要求1-6任一项所述实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:以pBac[3xp3-EGFPaf]载体为模板，设计扩增左侧反向重复序列的引物，然后进行PCR扩增，然后将扩增产物通过MluI和AscI酶切，酶切后插入到pBac [3xp3-EGFPaf]载体的AscI位点，筛选插入方向与pBac [3xp3_EGFPaf]载体的左侧反向重复序列同向的载体，得实现家蚕转基因长期稳定性的piggyBac载体。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于:所述扩增左侧反向重复序列的引物如 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.3 所示。
【文档编号】C12N15/66GK103923941SQ201410177428
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】夏庆友, 王峰, 徐汉福, 王元成, 王日远, 赵萍 申请人:西南大学