大肠杆菌外膜蛋白TolC核酸适配体的序列及用图
【专利说明】大肠杆菌外膜蛋白ToIC核酸适配体的序列及用途
[0001] 本发明是于2013年2月28日申请的申请号为201310062950. 2、发明名称为"大 肠杆菌外膜蛋白TolC核酸适配体的序列及用途"的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明属于分子生物学和医学微生物技术领域，涉及大肠杆菌外膜蛋白TolC核 酸适配体的序列及用途。
【背景技术】
[0003] 大肠杆菌（Escherichia COli)是埃希氏菌属的代表菌，是构成人类肠道中的正常 菌群之一，又是重要的条件致病菌，极易通过多种形式和途径侵入肠道外的组织和器官，造 成各种严重感染。随着抗菌药物的临床广泛应用，诱导了大量该菌属耐药菌株的产生，并 形成了该菌对单一抗菌药物耐药到对多种抗菌药物同时耐药，由低耐药率到高耐药率的发 展，给临床治疗带来了极大的困难，导致较高的病死率。目前国内外对大肠杆菌的耐药性机 理展开了深入的研宄。研宄表明，主动外排泵为大肠杆菌多重耐药的重要机制。大肠杆菌 外排泵包括：RND、MFS、ABC、SMR、MATE五类，其中前三者必须与外膜蛋白（OMP)TolC构成转 运共同体，才能完成对多种药物的外排，由此可见TolC是构成大肠杆菌外排泵的重要组成 成分。TolC是位于外膜上的孔道蛋白，上端为开放结构，以便给外排底物提供泵出的宽阔通 道；下端为封闭结构。外排泵三联复合物构象的改变，可使孔道定期开放或闭合。TolC结 构的改变会引起它们三者相互作用的减弱甚至三联复合物的解体。在关于大肠杆菌外膜蛋 白的研宄报导中，很多结果提示了 TolC蛋白在大肠杆菌的多重耐药机制中起到至关重要 的作用。但目前没有报道通过改变该蛋白结构来抑制耐药性。
[0004] 适配体（Aptamers)的研宄是一个新的热点领域，它是能够与许多目标分子（蛋 白，药物，无机或有机分子）发生高亲合性和特异性结合的一类单链核酸（DNA or RNA)。至 今发现高亲和特异性适配体的方法是配体指数富集系统展开（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)。由于适配体与配体分子结合的高特异性 以及高亲和性，在医学研宄中被广泛应用于检测和药物研宄等方面。Yuan等（Yuan L，et al，Anal Chem，2007,79(3) :1082)利用等离子体表面共振成像与适配子技术建立蛋白质芯 片，检测该蛋白质芯片上吸附的蛋白抗体凝血酶、血管内皮生长因子（VEGF)复合物。Cao等 (Cao X，et al，Nucleic Acids Res，2009,37(14) :4621-8)利用筛选出的针对金黄色葡萄 球菌的适配子来检测金黄色葡萄球菌。
[0005] 目前国内外大部分从事核酸适配体研宄的科学家和生物技术公司主要将适配体 运用于病毒感染、癌症、自身免疫病、血管性疾病的临床治疗，并成为较为理想的临床治疗 的新手段。其治疗机制主要是通过折叠成一定的三维结构直接与病理学相关蛋白质特异性 结合，抑制这些蛋白质的活性，以达到治疗目的。Feng H等（Feng H，et al，PLoS 0ne，2011， 6(11) :e27862)筛选出了能与乙型肝炎病毒高亲和力结合，干扰病毒Ρ-ε复合物形成的适 配体。但迄今尚无针对细菌外膜蛋白的适配体报道或公开，因此实有必要开发一种可特异 性结合大肠杆菌外膜蛋白TolC的核酸适配体。
【发明内容】
[0006] 本发明拟考虑将核酸适配体应用于改变TolC蛋白结构来有效阻塞大肠杆菌外排 泵外排活性。开发可特异性结合大肠杆菌外膜蛋白TolC的核酸适配体，为抑制大肠杆菌多 重耐药提供有力支持，具有重要的临床价值。
[0007] 本发明的目的是提供一种可特异结合大肠杆菌外膜蛋白TolC的核酸适配体。该 适配体具有如下序列：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO ：6,SEQ ID NO ：7,SEQ ID NO ：8,SEQ ID NO ：9,SEQ ID NO ： 10,SEQ ID NO ：1U SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQIDN0:18、SEQIDN0:19或SEQIDN0 :20。
[0008] 具体的，所述 SEQ ID NO :1 为：5' -TGCGTGTTTACGTGTCGATGTCCGGGTACCCTCGG-3' ；
[0009] 所述 SEQ ID NO :2 为：5' -CTCTTAGCCATTTTGGTATGCGTATTGCTCTACAG-3' ；
[0010] 所述 SEQ ID NO :3 为：5' -ATATATTGCTCTGATCGTACTCTTATTAGGTTAGT-3' ；
[0011] 所述 SEQ ID NO :4 为：5' -ATGACGCTGTGGTATTACGTCCTCCTGTATTTGCC-3' ；
[0012] 所述 SEQ ID NO :5 为：5' -TCTAAGTGGAATCTACCACCAACGTATTTTTCCTC-3' ；
[0013] 所述 SEQ ID NO :6 为：5' -TCCGCCTATTCGGGAGGGAATATTGCTGATTTGTA-3' ；
[0014] 所述 SEQ ID NO :7 为：5' -CTCTTCAGTTTTAGACAATGCACGTTTCAGCGGTG-3' ；
[0015] 所述 SEQ ID NO :8 为：5' -TCCAGGCTATAATTTCTTGGAACTCCCTCCGTTAG-3' ；
[0016] 所述 SEQ ID NO :9 为：5' -CTTTCGAAGGGACTTTAACGGGTATATCCGGTTTT-3' ；
[0017] 所述 SEQ ID NO :10 为：5' -ATTACATGCTCTGAGCTTTTTGTATGAGAAATGAT-3' ；
[0018] 所述 SEQ ID NO :11 为：5' -CGCTTAGCTTGTGATTTCATCTTTCACACAAGAAT-3' ；
[0019] 所述 SEQ ID NO :12 为：5' -CGGAGATCTGTTACACTTCGGTACGTCTTAGTTTG-3' ；
[0020] 所述 SEQ ID NO :13 为：5' -CTACCATGTTCAGTGGTTTTGGGATTTTCATACAT-3' ；
[0021] 所述 SEQ ID NO :14 为：5' -TGAGATCGGTGAGTTAGTATCTTTTATTCAGTTTT-3' ；
[0022] 所述 SEQ ID NO :15 为：5' -GCATTGCGTGACATGGCCTTGCTATCCCTGTTCGT-3' ；
[0023] 所述 SEQ ID NO :16 为：5' -TCCTAAAAGCTAGTTATAGTAAATTGAAAACTTAG-3' ；
[0024] 所述 SEQ ID NO :17 为：5' -TGGAGCTTAGATTTTGAAGCAGTTACATTTCCCGA-3' ；
[0025] 所述 SEQ ID NO :18 为：5' -TACTGCGAGCTTCATTTTTACTTGGTAGTGTTGTG-3' ；
[0026] 所述 SEQ ID NO :19 为：5' -CGAACGAATATAATTATGGCGTCCCCGGGGTTTCG-3' ；
[0027] 所述 SEQ ID NO :20 为：5' -CTAGTTATGACATTTGTGTCATTTATCCCACGCTG-3'
[0028] 本发明之大肠杆菌外膜蛋白TolC核酸适配体序列，通过下述方法制得：
[0029] 采用核酸适配体的体外SELEX筛选技术，以大肠杆菌外膜蛋白TolC为筛选靶标， 从体外合成的随机寡聚 DNA 文库（5'-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGG ATC-3'）中筛选出与TolC蛋白特异结合的核酸适配体。
[0030] 优选的，所述大肠杆菌外膜蛋白TolC采用如下方法纯化得到：
[0031] 采用分子克隆技术，根据大肠杆菌外膜蛋白TolC的基因组序列设计特异引物，所 述特异引物之上游引物Pa为5' -CGGGATCCATGAAGAAATTGCTCCCCATTCTT -3'，其下游引物Pb 为 5' - CCGCTCGAGGTTACGGAAAGGGTTATGACCGTT - 3'，以全长 cDNA 为模板，PCR 扩增，得到目 的基因经Bam H I和Xho I双酶切，同样处理PET-30a质粒，再用T4连接酶连接制得含有 TolC基因的重组质