一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰mcm7基因的小分子rna及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小分子干扰RNA (即shRNA)，尤其涉及一 种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子RNA ;另外，本发明还涉及该干扰MCM7基 因的小分子RNA的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] MCM7蛋白是MCM(minichromosome maintenance)复合物的组成成分之一，具有 DNA解旋酶活性，参与DNA复制起始，对细胞增殖、DNA损伤修复和细胞周期起重要的调控作 用，有研宄显示，MCM7在多种肿瘤中高表达（包括脑胶质瘤），可以作为多种恶性肿瘤的诊 断和预后指标。
[0003] 胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，故亦称神经外胚层肿瘤或神经上皮肿瘤。肿 瘤起源于神经间质细胞，即神经胶质、室管膜、脉络丛上皮和神经实质细胞，即神经元。大多 数肿瘤起源于不同类型的神经胶质，但根据组织发生学来源及生物学特征类似，对发生于 神经外胚层的各种复查肿瘤病，一般都称为神经胶质瘤。
[0004] 胶质瘤的分类方法很多，临床工作者往往采用的是分类比较简单的Kernohan分 类法。各型胶质瘤中，以星形细胞瘤最多，其次为胶质母细胞瘤，其后依次为髓母细胞瘤、室 管膜瘤、少枝胶质瘤、松果体瘤、混合性胶质瘤、脉络丛乳头状瘤、未分类胶质瘤及神经元性 肿瘤。各型胶质瘤的好发部位不同，如星形细胞瘤成人多见于大脑半球，儿童则多发在小 脑；胶质母细胞瘤几乎均发生于大脑半球；髓母细胞瘤发生于小脑蚓部；室管膜瘤多见于 第4脑室；少枝胶质瘤大多发生于大脑半球。
[0005] 胶质瘤以男性较多见，特别在多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤，男性明显多于女 性。各型胶质母细胞瘤多见于中年，室管膜瘤多见于儿童及青年，髓母细胞瘤几乎都发生在 儿童。胶质瘤的部位与年龄也有一定关系，如大脑星形细胞瘤和胶质母细胞瘤多见于成人， 小脑胶质瘤（星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤）多见于儿童。
[0006] 胶质瘤大多缓慢发病，自出现症状至就诊时间一般为数周至数月，少数可达数年。 恶性程度高的和后颅窝肿瘤病史较短，较良性的或位于静区的肿瘤病史较长。肿瘤若有出 血或囊变，症状会突然加重，甚至有类似脑血管病的发病过程。胶质瘤的临床症状可分两方 面，一是颅内压增高症状，如头痛、呕吐、视力减退、复视、精神症状等；另一是肿瘤压迫、浸 润、破坏脑组织所产生的局灶症状，早期可表现为刺激症状如局限性癫痫，后期表现为神经 功能缺失症状如瘫痪。
[0007] 胶质瘤的诊断，根据其生物学特征、年龄、性别、好发部位及临床过程进行分析，在 病史及体征基础上，采用电生理、超声波、放射性核素、放射学及核磁共振等辅助检查，定位 正确率几乎是100%，定性诊断正确率可在90 %以上。
[0008] RNA干扰（RNA interference，RNAi)是指由双链RNA介导的细胞内与其序列同源 的mRNA发生特异性降解，从而导致基因表达沉默的现象，这是一种转录后水平的基因沉默 机制。RNA干扰（RNAi)的基本原理是利用具有同源性的双链RNA (dsRNA)迅速阻断序列特 异的目标基因的表达活性，是实验室中一种有效的阻断基因表达的工具。
[0009]目前，尚未见有关用于抑制胶质瘤增殖的MCM7基因的相同序列小分子干扰RNA的 报道。
【发明内容】
[0010] 本发明要解决的技术问题之一是提供一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因 的小分子RNA。
[0011] 本发明要解决的技术问题之二是提供该干扰MCM7基因的小分子RNA的制备方法。
[0012] 本发明要解决的技术问题之三是提供该干扰MCM7基因的小分子RNA的应用。
[0013] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0014] 在本发明的一方面，提供一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子 RNA，其对应的序列为：
[0015] 正义链：5 ， -CTAGAGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTCTTGTCGAACTCATCAATG CG-3'，如 SEQ ID NO. 1 所示；
[0016] 反义链：5 ， -GATCCGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTCTTGTCGAACTCATCAATG CT-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示。
[0017] 所述RNA干扰（RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。宿主细胞 对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定 长度和结构的小片段RNA(大约21?23bp)，即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用 下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋 酶等）结合形成 RNA 诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC 与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位 切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降 解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。
[0018] 在本发明的另一方面，提供一种制备上述用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因 的小分子RNA的方法，该方法的具体步骤为：
[0019] 步骤一、根据PMT98载体设计的具体要求，设计对应于MCM7基因第1974-1994位， 即：GCATTGATGAGTTCGACAAGA的shRNA寡核苷酸序列并进行合成，所述的shRNA的寡核苷酸 序列序列为：如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所不的喊基序列；
[0020] 步骤二、依据PMT98载体设计的要求，将设计的ShRNA序列和PMT98质粒进行连 接，得到用于抑制胶质瘤增殖的MCM7基因的一种小分子干扰RNA。
[0021] 在本发明的另一方面，提供一种上述干扰MCM7基因的小分子RNA在制备抑制胶质 瘤增殖的药物中的应用。
[0022] 本发明设计对胶质瘤增殖关联的MCM7基因的RNAi，并应用胶质瘤细胞模型（U373 细胞模型）研宄其对抗胶质瘤增殖的抑制作用，为RNAi在胶质瘤的治疗应用提供了一种新 药物分子。经实验验证，转染MCM7 RNA干扰组中的肿瘤生长受到抑制，该实验结果表明，本 发明的小分子干扰RNA能下调胶质瘤中的MCM7基因表达，能够明显抑制胶质瘤的生长。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明实施例1中shRNA的寡核苷酸序列和PMT98质粒的连接示意图。
[0024] 图2是本发明实施例1中MCM7 RNAi对脑胶质瘤细胞中MCM7的干扰作用示意图， 其中，blank表示空细胞组，empty vector表示转染空载体组;MCM7 RNAi表示转染MCM7 RNA干扰组。
[0025] 图3是本发明实施例1中MCM7 RNAi对脑胶质瘤细胞增殖的影响示意图，其中， blank表示空细胞组，empty vector表示转染空载体组；MCM7 RNAi表示转染MCM7 RNA干 扰组。
[0026] 图4是本发明实施例2中三个小分子RNA对脑胶质瘤细胞中MCM7的干扰作用对 比示意图，其中，blank表示空细胞组，empty vector表示转染空载体组。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。
[0028] 实施例1
[0029] -、胶质瘤细胞的培养：
[0030] 胶质瘤细胞U373细胞系（购买自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心）培 养于37°C，5% CO2恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，之后加入适量培养液并 反复吹打以混匀细胞；将得到的细胞悬液移入15ml离心管中，1500rpm离心3min ;去上清； 用5ml无菌I XPBS将细胞悬起，吹打混匀；加约Iml细胞悬液于装有5ml新鲜培养基的新 培养瓶中，放入37°C，5% CO2培养箱中培养，约2天左右传代1次（主要查看细胞有无铺满 培养瓶）。
[0031] 二、MCM7-RNAi质粒的设计和转染：
[0032] I. MCM7-RNAi 质粒的设计：
[0033] 根据PMT98载体