六味石榴片在制备抑制脑瘤细胞sf126细胞增殖药物中的应用
【专利摘要】本发明属于中药技术领域，具体涉及一种六味石榴片在制备抑制脑瘤细胞SF126细胞增殖药物中的应用及六味石榴片的制备方法。所述六味石榴片由石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g作为原料药制成，采用超临界萃取制备而成，使得胡椒碱含量有很大提高。
【专利说明】
六味石榴片在制备抑制脑瘤细胞SF126细胞増殖药物中的 应用
技术领域
[0001] 本发明属于中药技术领域，具体涉及一种六味石榴片在制备抑制脑瘤细胞SF126 细胞增殖药物中的应用及六味石榴片的制备方法。
【背景技术】
[0002] 六味石榴胶囊标准号WS-10474(ZD-0474)-2002,记载于国家中成药标准汇编外科 妇科分册。由石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g作为原料 药制成，具有温肾，嗳腰膝的功效。用于妇女白带病。
[0003] 现有技术中，尚未有六味石榴片在在制备抑制人脑瘤细胞SF126细胞增殖药物中 的应用的报道，也未见有六味石榴片提取制备方面采用超临界萃取的报道，而传统粉碎的 方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上 应用。
【发明内容】
[0004] 发明目的：本发明的目的在于提供一种六味石榴片在制备抑制脑瘤细胞SF126细 胞增殖药物中的应用。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种六味石榴片的制备方法。
[0006] 本发明的目的是通过如下的方案实现的： 六味石榴片在制备抑制脑瘤细胞SF126细胞增殖药物中的应用，所述六味石榴片由石 植子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g作为原料药制成，所述六 味石植片的制备方法包括如下步骤:取石植子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、 大托叶云实45g，加入到C〇2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积 百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，C〇2流量l_3ml/g生药· min，萃取时间 300-400min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制胶囊，干燥，压片，制成 500片，每片重0.30g。
[0007] 优选的，上述的六味石榴片在制备抑制脑瘤细胞SF126细胞增殖药物中的应用，所 述六味石榴片的制备方法包括如下步骤:取石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花 45g、大托叶云实45g，加入到C〇2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的 体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40°C，C〇2流量2ml/g生药· min，萃取时间350min，得 超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制胶囊，干燥，压片，制成500片，每片重 0·30g〇
[0008] 现有技术中，六味石榴胶囊口服，一次5粒，一日3次。六味石榴胶囊服药量大。采用 本发明方法制备成的六味石榴片每片重0.30g，每次仅需1片，一日服用3次。在具有更多活 性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。
[0009] 试验一、不同方法制备的六味石榴片中胡椒碱含量的比较 1、仪器及试药本发明六味石榴片:按实施例1方法制备，使用315g原料药，经提取制成 500片，每片重0.30g。原六味石榴胶囊，按照WS-10474(ZD-0474)-2002标准方法制备。 Agi 1 ent 1200高效液相色谱仪;METTLERAE240电子分析天平；胡椒碱对照品（中国药品生物 制品检定所）。
[0010] 2、方法 照高效液相色谱法(中国药典2015年版第四部凡例十五)测定。
[0011]色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(77: 23)为流动相;检测波长为343nm。理论板数按胡椒碱峰计算应不低于1500。
[0012] 对照品溶液的制备精密称取胡椒碱对照品适量，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成 每lml含20此的溶液，即得。
[0013] 本发明的六味石榴片的供试品溶液的制备取本发明的六味石榴片6g，混匀，取 0.12g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加无水乙醇40ml，超声处理30分钟，放冷，加无水乙醇 稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0014] 对照产品供试品溶液的制备取对照六味石榴胶囊6g，混匀，取0.3g，精密称定，置 50ml棕色量瓶中，加无水乙醇40ml，超声处理30分钟，放冷，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀， 滤过，取续滤液，即得。
[0015] 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ1，注入液相色谱仪，测定， 即得。
[0016] 3、结果 结果表明，本发明六味石植片中胡椒碱的含量为4.10-8.05mg/片;而原六味石植胶囊 中胡椒碱的含量为〇.81mg/粒，每次服用量2片的胡椒碱含量为原胶囊剂5粒含量的2-4倍， 在服用量减少的情况下，胡椒碱含量有很大提高。
[0017] 上述研究表明，采用本发明制备方法制备的六味石榴片，有效成分含量远远高于 WS-10474(ZD-0474)-2002标准记载的方法制备的六味石榴胶囊。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解 本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述 内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0019] 实施例1 取石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g，加入到C02超临 界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温 度40°C，C02流量2ml/g生药· min，萃取时间350min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入 淀粉，70%乙醇制胶囊，干燥，压片，制成500片，每片重0.30g。
[0020] 经检测，成品中胡椒碱的含量为8.05mg/片。
[0021] 实施例2 取石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g，加入到C02超临 界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温 度30°C，C02流量lml/g生药· min，萃取时间300min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入 淀粉，70%乙醇制胶囊，干燥，压片，制成500片，每片重0.30g。
[0022] 经检测，成品中胡椒碱的含量为4.15mg/片。
[0023] 实施例3 取石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g，加入到C02超临 界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温 度60°C，C02流量3ml/g生药· min，萃取时间400min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入 淀粉，70%乙醇制胶囊，干燥，压片，制成500片，每片重0.30g。
[0024] 经检测，成品中胡椒碱的含量为6.03mg/片。
[0025] 实施例4:六味石榴片抑制人脑瘤细胞SF126细胞增殖的实验研究资料 1.实验材料 1.1实验用细胞株 人脑瘤细胞SF126细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
[0026] 1.2实验药物 研究药物:本发明六味石榴片:按实施例1方法制备。
[0027] 药液储液：称取lOOmg六味石植片，溶于5ml无水乙醇中，0.2μηι滤器过滤，500μ ldoff管分装，-20°C存储，同时0.2μπι滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0028] 1.3实验试剂 DMEM(GIBC0公司Cat ·Νο · 12100-061Lot ·Νο · 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有 限公司Lot .No . 100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat .No . 118 10-033Lot.No.l088387)；Trypsin(AMRESC0^^)；EDTA(AMRESC0^^)； PenicillinGSodiumSalt(AMRESCO公司 1) ; StreptomycinSulfate(AMRESCO);无水乙醇（溜 博亚杜兰经贸有限公司）;MTT(Biosharp批号:0793):PBS(实验室自配）； 1.4实验器材 莱卡倒置显微镜（德国Leica型号:DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型 号：SPECTRAMAX190);C〇2培养箱(FORMA型号：3111);超净台（苏净集团安泰公司制造型号： SW-Cj-zro );纯水仪（美国Spr 1 ng公司型号：S/N020579 );精密移液器(法国吉尔森公司型 号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅（日本SANYO公 司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密实验设备公司型号：DHG9123A);冰箱 (西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂 型号:KA-1000) ;0 · 2μπι滤器(MILLIP0RE型号：SLGP033RB) ; lcm培养皿(NEST公司）、96孔培养 板(NEST公司）;细胞计数板;离心管、移液管、Tips若干。
[0029] 2.实验方法 1)SF126细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至 对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37 °C消 化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，lOOOrpm离 心5min，调整细胞悬液浓度3 X 104个/ml。
[0030] 2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μ1，培养板放入细胞培养箱中 (37°C，5%C0 2)常规培养。
[0031] 3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入六味石榴片溶液，继续培养24h。
[0032] 4)24h后加入20μ1ΜΤΤ溶液（5mg/ml，即0 · 5%MTT)，继续培养4h。
[0033] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200μ1二甲基亚砜，置摇床 上低速振荡l〇min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0034] 6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液），对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。
[0035] 7)结果以药物对细胞的抑制率表示:细胞增值抑制率(％ )=(对照孔0D值-给药孔0D 值）、对照孔0D值X 100%。实验重复3次。
[0036] 3.统计处理 采用MicrosoftExcel2007软件中的相关分析和Studentt检验，数据以mean±S.D.表 不。
[0037] 4.实验结果 MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对SF126细胞增殖抑 制有差异(P〈〇.〇5)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(？〈0.01)，当剂量达到15-2〇11^/1111 时有极显著性差异(P〈〇. 001)。
[0038] 表1六味石榴片对SF126细胞增殖抑制影响研究(X土SD)
注：与对照组比较，*P〈〇. 01; #P〈〇. 001。
[0039] 5.实验结论 本发明的六味石榴片可以抑制SF126细胞增殖，减少SF126细胞的细胞生长数目，该作 用呈剂量依赖性。
【主权项】
1. 六味石榴片在制备抑制脑瘤细胞SF126细胞增殖药物中的应用，所述六味石榴片由 石植子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g作为原料药制成，其特 征在于，所述六味石榴片的制备方法包括如下步骤:取石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡 椒45g、红花45g、大托叶云实45g，加入到C0 2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总 萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，C0 2流量l-3ml/g生药· min，萃取时间300-400min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制胶囊，干 燥，压片，制成500片，每片重0.30g。2. 根据权利要求1所述的六味石榴片在制备抑制脑瘤细胞SF126细胞增殖药物中的应 用，其特征在于，所述六味石榴片的制备方法包括如下步骤:取石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻 45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g，加入到C0 2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带 剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40°C，C0 2流量2ml/g生药· min， 萃取时间350min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制胶囊，干燥，压片， 制成500片，每片重0.30g。
【文档编号】A61K36/67GK105832825SQ201610190346
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月30日
【发明人】杨志华
【申请人】济南新时代医药科技有限公司