设计的具体要求，设计对应于MCM7基因第1974-1994位，即：
[0034] GCATTGATGAGTTCGACAAGA的shRNA寡核苷酸序列并进行合成，送上海捷瑞生物工 程有限公司进行合成。
[0035] MCM7-RNAi对应的序列为：
[0036] Sense (正义链）：5 ' -CTAGAGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTC TTGTCGAACTCATCAATGCG-3'，如 SEQ ID NO. 1 所示；
[0037] Antisense (反义链）：5 ，-GATCCGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAG TCTTGTCGAACTCATCAATGCT-3，JnSEQIDN0.2K*。
[0038] 根据PMT98载体设计的具体要求，将设计的MCM7-RNAi的干扰片段和PMT98质 粒连接，参见图1，然后转染进胶质瘤细胞。图1为PMT98质粒构建原理的图解，它使 用基于RNA的CMV聚合酶II启动子和优化的茎环结构，从而在靶细胞内可精确地形成 小分子干扰RNA (s h RNA)。PMT 9 8是一个预切好的载体，通过载体上携带的筛选标记， 进行哺乳动物细胞的共转染，建立shRNA表达的稳定细胞系。PMT98载体（元件顺序： pLVX-PGK-PUR0-CMV-EGFP-mir30 arm-polyA)是在 clontech 公司的 pLVX-PURO 载体（元件 顺序：pLVX-CMV-MSC-PGK-PURO-polyA)基础上改造而来。PMT98载体全序列如SEQ ID NO. 7 所示。
[0039] 2. MCM7-RNAi 质粒的转染：
[0040] 转染前一天，在含有5ml无抗生素的DMEM生长培养基（DMEM生长培养基是一种在 MEM培养基的基础上研制的，含各种氨基酸和葡萄糖的细胞培养基）的60mm培养皿里种上 2X IO6个胶质瘤细胞（胶质瘤细胞由上述一、培养得到）。铺板后第二天准备转染：首先用 500 μ 1无血清的培养基（DMEM)溶解8. 0 μ g的MCM7-RNAi表达载体，用500 μ 1培养基（DMEM 或RPMI1640)溶解阳离子脂质体LipofectamineTM2000 (20 μ 1)，轻轻地混匀，室温孵育5分 钟。孵育后，为促使shRNA表达载体与LipofectamineTM2000充分结合，将它们轻轻混匀，室 温孵育 20 分钟，以形成 DNA-Lipof ectamine?2000 的复合物。将 DNA-Lipofectamine?2000 复合物加入到60mm培养皿，之后将含有DNA-Lipofectamine TM2000复合物的细胞培养皿放 入37°C，5% CO2培养箱内培养6小时，换上正常细胞培养液。
[0041] 三、实验分组与检测指标
[0042] Blank组（空细胞组）：胶质瘤细胞，培养液为胶质瘤细胞培养液；
[0043] empty vector组（转染空载体组）；转染过empty vector的胶质瘤细胞，培养液 为胶质瘤细胞培养液；
[0044] MCM7 RNAi组（转染MCM7 RNA干扰组）：转染过MCM7-RNAi的胶质瘤细胞，培养液 为胶质瘤细胞培养液。
[0045] 图2表示MCM7 RNAi对脑胶质瘤细胞中MCM7的干扰作用，图2是U373细胞中MCM7 干扰效果QPCR检测。图2中，MCM7 RNAi组与empty vector组相比，MCM7基因明显受到抑 制（**ρ〈0· 01)。
[0046] 图3表示MCM7-RNAi对脑胶质瘤细胞增殖的影响。由图3可知，MCM7 RNAi组与 empty vector组相比，转染MCM7 RNAi干扰组（MCM7 RNAi组）的细胞增殖显著低于转染空 载体组（empty vector组）的细胞增殖率（**ρ〈0· 01)。
[0047] 四、实验结果：
[0048] 上述实验表明，转染MCM7 RNAi干扰组中的MCM7基因被显著敲减，肿瘤生长也受 到明显抑制。该实验结果表明，本发明的小分子干扰RNA能下调胶质瘤中的MCM7基因表达， 能够明显抑制胶质瘤的生长。
[0049] 实施例2对比实验
[0050] 挑选3个分值较高的小分子RNA，构建载体并干扰筛祀，实验步骤同实施例1，以下 是相关对比实验数据。
[0051] MCM7-si 1456:CGTCAGCGTCACTGGTATTTT(对应于 MCM7 基因第 1456-1476 位）； MCM7-si 1456对应的序列为：
[0052] 正义链：5 ， -CTAGACGTCAGCGTCACTGGTATTTTCTCGAGAAAATACCAGTGACGCTGAC GG-3'，如 SEQ ID NO. 3 所示；
[0053] 反义链：5 ， -GATCCCGTCAGCGTCACTGGTATTTTCTCGAGAAAATACCAGTGACGCTGAC GT-3'，如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0054] MCM7-si 1644:CGAAAAGCTGGCAGCTTCA(对应于 MCM7 基因第 1644-1664 位）； MCM7-sil644对应的序列为：
[0055] 正义链：5' -CTAGA CGAAAAGCTGGCAGCTTCACTCGAGTGAAGCTGCCAGCTTTCGG-3 '，如 SEQ ID NO. 5 所示；
[0056] 反义链：5' -GATCC CGAAAAGCTGGCAGCTTCACTCGAGTGAAGCTGCCAGCTTTCGT-3 '，如 SEQ ID NO. 6 所示。
[0057] MCM7-sil974:GCATTGATGAGTTCGACAAGA(对应于MCM7基因第 1974-1994位，即实施 例1中的有效序列），MCM7-sil974对应的序列为：
[0058] Sense (正义链）：5 ' -CTAGAGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTC TTGTCGAACTCATCAATGCG-3 "，如 SEQ ID NO. 1 所示；
[0059] Antisense (反义链）：5，-GATCCGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTCTTGTCGAACTCAT CAATG CT-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示。
[0060] 对比实验结果如图4所示，从图4可知，MCM7-sil974(即本发明实施例1的小分 子RNA)与MCM7-sil456、MCM7-sil644相比，在U373细胞中MCM7干扰效果最显著。
【主权项】
1. 一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子RNA，其对应的序列为： 正义链：5' -CTAGAGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTCTTGTCGAACTCATCAATGCG-3'，如 SEQ ID NO. 1 所示； 反义链：5' -GATCCGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTCTTGTCGAACTCATCAATGCT-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示。
2. -种根据权利要求1所述的干扰MCM7基因的小分子RNA的制备方法，其特征在于， 该方法的具体步骤为： 步骤一、根据PMT98载体设计的具体要求，设计对应于MCM7基因第1974-1994位， 即：GCATTGATGAGTTCGACAAGA的shRNA寡核苷酸序列并进行合成，所述的shRNA寡核苷酸序 列序列为：如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所不的喊基序列； 步骤二、依据PMT98载体设计的要求，将设计的shRNA序列和PMT98质粒进行连接，得 到用于干扰MCM7基因表达的RNA干扰载体。
3. 根据权利要求1所述的干扰MCM7基因的小分子RNA在制备抑制胶质瘤增殖的药物 中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子RNA及其应用。该干扰MCM7基因的小分子RNA为SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2所示的碱基序列。本发明设计对胶质瘤增殖有促进作用的干扰MCM7基因的小分子RNA，应用胶质瘤细胞(U373细胞)模型研究其对胶质瘤增殖的抑制作用，为胶质瘤的基因治疗提供了一种新分子药物。
【IPC分类】C12N15-10, A61P35-00, A61K31-713, C12N15-113
【公开号】CN104561003
【申请号】CN201510022968
【发明人】俞磊, 吴小江, 祁伟, 楼小燕, 吴雪松
【申请人】上海生博生物医药科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月16日