及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种瑞氏木霉中铜离子透性酶基因启动子Ptc;ul及应用，属于生物工程
技术领域。
【背景技术】
[0002] 在地球上，每年通过植物利用太阳能光合作用产生大量的纤维素和半纤维素，纤 维素和半纤维素的合成与降解是地球碳循环中重要的组成部分。丰富的纤维素和半纤维素 资源在可循环能源及基础化合物生产方面具有重要的应用潜力。因为其产纤维素酶的高效 性和多样性，瑞氏木霉（Trichoderma reesei)已作为工业菌株被大家广泛研究和应用。其 主要通过分泌纤维素酶和半纤维素酶来降解外界的木质素，所分泌纤维素酶类包括外切葡 聚糖苷酶，内切葡聚糖苷酶，β -葡萄糖苷酶及木聚糖酶等。目前所用真菌产生的纤维素酶 是通过诱导产生的，不溶性的微晶纤维素（Avicel)和可溶性的乳糖（Lactose)，纤维二糖 (Cellobiose),槐糖（Sophorose)均可以诱导纤维素酶的产生，而葡萄糖和甘油则不能诱 导。而在其中纤维糊精，纤维二糖，槐糖具有明显的纤维素酶诱导效果，但由于其价格昂贵 造成成本过高，微晶纤维素不可溶，有后续的纤维素酶的分离分纯有一定影响。同时现已报 道纤维素酶具有很高的重组蛋白的生产和分泌能力，已有多个异源蛋白在瑞氏木霉中进行 表达。相对于大肠杆菌及酵母来讲，瑞氏木霉更适合进行高等真核生物蛋白的异源表达。
[0003] 瑞氏木霉作为目前常用的工业产纤维素酶菌株，受到了大家的广泛关注，并且有 成熟的遗传操作体系。然而我们注意到，瑞氏木霉大部分以单倍体形式存在，对于一些对生 长有严重影响的基因进行遗传改造时非常困难，难以得到合适的转化子。因此，为了解决纤 维素酶的生产问题及其中涉及到的一些关键基因的遗传操作，寻找一个新的研究策略，找 到对瑞氏木霉不依赖于诱导碳源产纤维素酶的能力的因子，对纤维素酶生产具有重大的意 义。
【发明内容】
[0004] 本发明对现有技术的不足，提供了一种瑞氏木霉中铜离子透性酶基因启动子Ptral 及应用。
[0005] -种瑞氏木霉中铜离子透性酶基因启动子Pteul，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 /Jn 〇
[0006] 一种重组载体,该载体插入了核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的 片段。
[0007] -种重组真菌可控表达蛋白系统，是将上述重组载体转化瑞氏木霉中获得。该系 统含有Ptcu启动子及需要表达的目的蛋白基因。
[0008] 上述重组真菌可控表达蛋白系统在甘油和/或葡萄糖作为碳源的条件下，生产纤 维素酶的应用。
[0009] 本发明所涉及到基因启动子Pteul来自瑞氏木霉QM9414,在本发明的实施例1中提 供了该基因 Ptaul的序列特征及其调控实例。该方法是以瑞氏木霉QM9414的基因组为模 板,通过PCR方法得到ptcu的核苷酸序列，该序列由1715个核苷酸组成。通过利用Ptc;u$ 动子，在瑞氏木霉中表达GFP，可以表明这个启动子是高表达能力，且依赖于铜离子浓度抑 制，所以可利用此启动子构建一个丝状真菌瑞氏木霉的可调控的表达体系。利用QM9414诱 导得到的cDNA中扩增到xyrlcDNA，该序列由2763个核苷酸组成，编码920个氨基酸。然 后利用匕^启动子将xyrl在瑞氏木霉中进行表达，得到转化子发现能够在葡萄糖和甘油为 碳源的培z养基中大量分泌纤维素酶。
[0010] 本发明涉及的瑞氏木霉QM9414菌株为现有菌株，不涉及首次菌种保藏。
[0011] 有益效果
[0012] 本发明中Ptaul启动子是严格受到铜离子浓度调控，可以对一些关键基因进行可调 控性转录。同时利用P tc;ul的高表达特性，可以作为一很好的表达外源蛋白体系。同时启动 子过表达纤维素酶转录调控因子Xyrl可以解除瑞氏木霉对诱导碳源的依赖，可以利用葡 萄糖及其它寡糖等常见碳源进行纤维素酶的生产，大大降低了纤维素酶的生产成本。
【附图说明】
[0013] 图1、？_启动子启动内源性基因^111对铜离子响应结果的柱状图；
[0014] 其中：A、内源性基因 tcul转录随铜离子浓度升高而降低；
[0015] B、加入铜离子之后，tcul的转录迅速关闭；
[0016] C、当加入铜离子螯合剂铜离子螯合剂浴酮灵二磺酸（BCS)，tcul基因转录有所恢 复；
[0017] D -F、葡萄糖，甘油和纤维素上培养tcul转录在3 - 12h随时间延长而增加，转录 量受铜离子抑制。
[0018] 图2、Pteul启动子表达荧光蛋白GFP的检测结果；
[0019] 其中：A、表示Pteul启动子表达荧光蛋白GFP的菌丝荧光，加入铜离子之后荧光消 失的对比照片；
[0020] B、为Ptral启动子表达荧光蛋白GFP荧光强度随铜离子浓度升高而降低的曲线图；
[0021] 图3、Ptral启动子启动纤维素酶转录调控因子Xyrl转录及滤纸酶活分析的柱状 图；
[0022] 其中：A表示瑞氏木霉Ptral -xyrl在非诱导碳源葡萄糖或甘油上的xyrl的转录能 力与瑞氏木霉QM9414在Avicel诱导碳源上的水平相当；
[0023] B表示瑞氏木霉Ptc;ul -xyrl在非诱导碳源甘油上的滤纸酶活与瑞氏木霉QM9414在 Avicel诱导碳源上的水平相当。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，以便本领域 的技术人员了解本发明，但本发明所保护范围不限于此。
[0025] 实施例中的瑞氏木霉QM9414购自美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC)，菌种保 藏号为：26921。
[0026] 实施例中瑞氏木霉预培养培养基，每升组分如下：
[0027] (NH4)2SO4 I. 4 g K2HPO4 2. 0 g Na2HPO4-12H20, 17. 90 7 g Ura (尿素） 0. 3 g Tween-80 (吐温80) 0. 5 ml MgSO1 0. 6 g CaCl2 0. 6 g FeS〇4*7H20 5.0 rag MnSOfH2O I, 6 mg ZnSO4 I. 4 rag Peptone 2.0 g CoCl2 2. 0 mg Glycerol (甘油） IOml
[0028] Citric Acid (柠檬酸）调 pH 至 5.0。
[0029] 实施例中所述诱导培养基，每升组分如下：
[0030] (NH4)2SO4 1,4 g K2HPO4 2.0 g Na2HPO4-12H20, 17.907 g Ura (尿素） 〇. 3 g Tween-80 (吐温80) 0. 5 ml MgSO4 0. 6 g CaCl2 0. 6 g FeS〇4?7H20 5. 0 mg MnSO4eH2O I. 6 mg ZnSO4 L 4 mg CoCl2 2. 0 mg glycerol (甘油)或glucose (葡萄糖） 10 g
[0031] Citric Acid (梓樣酸）调 pH 至 5· 0。
[0032] 实施例1瑞氏木霉菌中tcul启动子基因的分离
[0033] 1、在20ml瑞氏木霉MM培养基中接种瑞氏木霉（Trichoderma reesei) QM9414的 孢子IO6个，30°C培养48h，收集菌丝，提取基因组。
[0034] 2、瑞氏木霉MM培养基，每升组分如下：
[0035] 蛋白胨，IOg;
[0036] 葡萄糖，20g;
[0037] (NH4) 2S04, 5g ;
[0038] K2HPO4,15g 用 IM NaOH 调 pH 至 5. 5,定容值 IL 后。
[0039] 灭菌后每瓶加
[0040] 200XMgS04(120g/l)5ml ；
[0041] 200 X CaCl2 (120g/l) 5ml ;
[0042] 1000 X 微量元素（FeSO4 · 7H20, 5g/l ;MnS04 · H2O, I. 6g/l ;ZnS04,1. 4g/l ;CoCl2， 2g/l),Imlo
[0043] 3、基因组提取采用fungal DNA mini Kit试剂盒，购自Omega公司，步骤详见产品 说明书。
[0044] 4、以步骤3获得的基因组为模板，以PtculF和PtculR为引物，采用PCR方法，得 到P tc;u$动子的DNA片段，引物如下：
[0045] PtculF:GAGCGGAATCCTACATTCCCAGATG
[0046] PtculR:CCCAAGCTTATAAGAATGCGGCCGCTTGGCGCGCCTGTCGTATCAACCAGGTCGTATA
[0047] 反应体系（25 μ L)为：
[0048]
【主权项】
1. 一种瑞氏木霉中铜离子透性酶基因启动子Ptaul，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -种重组载体，该载体插入了核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的片 段。
3. -种重组真菌可控表达蛋白系统，是将权利要求2所述重组载体转化瑞氏木霉中获 得。
4. 权利要求3所述重组真菌可控表达蛋白系统在甘油和/或葡萄糖作为碳源的条件 下，生产纤维素酶的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种瑞氏木霉中铜离子透性酶基因启动子Ptcu1及应用。一种瑞氏木霉中铜离子透性酶基因启动子Ptcu1，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明中Ptcu1启动子是严格受到铜离子浓度调控，可以对一些关键基因进行可调控性转录。同时利用Ptcu1的高表达特性，可以作为一很好的表达外源蛋白体系。同时启动子过表达纤维素酶转录调控因子Xyr1可以解除瑞氏木霉对诱导碳源的依赖，可以利用葡萄糖及其它寡糖等常见碳源进行纤维素酶的生产，大大降低了纤维素酶的生产成本。
【IPC分类】C12N15-80, C12R1-885, C12N9-42, C12N15-113
【公开号】CN104561002
【申请号】CN201510009476
【发明人】刘巍峰, 吕新星, 郑芳林, 李春燕, 张伟欣
【申请人】山东大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月8日