一株拟康氏木霉tz-11菌株及其用途
【专利摘要】本发明涉及一株拟康氏木霉(Trichoderma?koningiopsis)TZ-11菌株、用途及其制剂的制备方法。由该菌株经固体发酵而制得的可湿性粉剂，可用于防治由围小丛壳菌(Glomerella?cingulata)侵染引起的炭疽病，例如辣椒、芒果、香蕉和枇杷等很多作物炭疽病的防治，尤其是由围小丛壳菌(Glomerella?cingulata)侵染引起的葡萄炭疽病和草莓炭疽病等病害。田间试验结果表明，该菌剂对葡萄炭疽病和草莓炭疽病均有很好的防治效果且菌株发酵工艺简单，生产成本低廉；菌剂活孢子含量高，贮藏性质稳定。
【专利说明】一株拟康氏木霉TZ-11菌株及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株微生物菌株及其用途，更具体地说涉及一株拟康氏木霉 (Trichoderma koningiopsis)TZ-ll菌株、用途及其制剂的制备方法，属于生物农药技术领 域。
【背景技术】
[0002] 由植物病原真菌围小丛壳菌属（Glomerellaspp.)引发的葡萄、苹果、梨和草莓等 的炭疽病，是设施农业农作物的主要病害。化学药剂防控是当前防治炭疽病的主要防治措 施。常用的化学药剂主要有多菌灵（carbendazim)、丙环唑（propiconazole)、双苯三唑醇 (bitertanol)、抑霉唑（imazalil)、己唑醇（hexaconazole)、啼菌酯（azoxystrobin)、醚菌 酯（kresoxim-methyl)、啼霉胺（pyrimethanil)、苯醚甲环唑（difenoconazole)、烯厢菌酯 (enestroburin)、咪鲜胺（prochloraz)和批唑醚菌酯（pyraclostrobin)等。农户在作物 炭疽病防治上大多使用上述的高效低毒药剂，但该类药剂作用位点单一（抑制线粒体呼吸 链电子传递）。在高防治频次下极易产生抗药性，且药剂间交互抗药性风险极高。生产上已 屡屡出现防治失败的事例，说明炭疽病病原真菌已对上述当家化学药剂都产生了不同程度 的抗（耐）药性，替代药剂的研发已刻不容缓。
[0003] 相对于大田作物病害生物防治，葡萄、草莓等应时鲜果病害的生物防治研究在 我国才刚刚开始。目前国内外还没有成功用于防治炭疽病的生物农药专用制剂。已 报道的研究大多集中于利用活体微生物来防控，如利用木霉菌属真菌（Trichoderma spp.)中的绿色木霉（Trichoderma viride)、哈茨木霉（Trichoderma harzianum)和 长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum),芽抱杆菌属细菌（Bacillus spp.)中的 枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、錯质芽抱杆菌（Bacillus cereus)、多粘芽抱杆 菌（Bacillus polymyxa)、巨大芽抱杆菌（Bacillus megaterium)和解淀粉芽抱杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)，假单胞菌属细菌（Pseudomonas spp.)中的洋葱假单胞 菌（Pseudomonas cepacia)、突光假单胞细菌（Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)，酵母菌中的季也蒙毕赤氏酵母（Pichia guilliermondii)和罗伦隐 球酵母（Cryptococcus laurentii)，寡雄腐霉（Pythiumoligandrum)等来防治。运用活体 微生物防治作物炭疽病的研究报道仅限于室内活性测定、温室防治试验和田间试验测定阶 段。本发明提供的可有效防治炭疽病的拟康氏木霉菌株，在现有技术中没有提及和公开。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的在于提供一种可用于防治由围小丛壳菌（Glomerella cingulata)侵染引起的炭疽病病害的菌株。
[0005] 本发明的第二目的是提供菌株在防治由围小丛壳菌（Glomerella cingulata)侵 染引起炭疽病病害方面的应用，尤其是在围小丛壳菌侵染引起的葡萄炭疽病和草莓炭疽病 上的应用。
[0006] 本发明的第三目的是一种利用上述菌株制备的可湿性粉剂。
[0007] 本发明的第四目的是提供一种上述可湿性粉剂的制备方法。
[0008] -、为解决第一目的，提供的技术方案如下：
[0009] 一株拟康氏木霉囷株，其特征在于，该囷株的分类命名为拟康氏木霉 TZ-11 (Trichoderma koningiopsisTZ-11)，为该菌株已于2010年7月8号在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo. 3969。
[0010] 本发明菌株的形态学及显微特征如下：
[0011] 在麦芽汁琼脂培养基（MEA)上生长快，25°C黑暗条件下培养4d菌落直径60-63mm， 初期白色，后期因产孢呈灰绿色，质地絮状；背面浅褐色，无水溶性色素。分生孢子结构大量 形成，产孢区均匀分布。菌丝壁平滑或粗糙，多分枝，具分隔，宽2. 0-3. 5 μ m ;分生孢子梗壁 光滑，主轴明显，对生分枝情况较少，宽2. 0-3. 5 μ m ;产孢瓶梗多数2-4个簇生于分生孢子 梗或其分枝上，基部柱状或略膨大6. 2-15. 0X 2. 0-3. 5 μ m ;分生孢子椭圆形，深绿色，壁平 滑或稍粗糙，3. 5-5. 5 X 1. 8-3. 0 μ m。
[0012] 本发明的拟康氏木霉（Trichoderma koningiopsis) TZ-11菌株rRNA基因序列对 应的DNA序列（该段rRNA包括了 18SrRNA片段，ITS1、5. 8SrRNA、ITS2区全序列及28SrRNA 序列片段）如SEQ ID NO :1所示。
[0013] 二、菌株在防治由围小丛壳菌（Glomerellacingulata)侵染引起的炭疽病害方面 的应用，尤其是在围小丛壳菌引起的葡萄炭疽病和草莓炭疽病防治中的应用。
[0014] 三、一种利用上述菌株制备的可湿性粉剂。
[0015] 四、一种上述可湿性粉剂的制备方法，具体包括以下步骤：
[0016] ㈧固体发酵培养物的获得
[0017] ⑴将麦麸和锯木屑按3: 7 (V/V)的比例混匀后，分别加入0. 1 % (W/W)的蔗糖和 碳酸铵，并加水使含水量为60?65 %，pH调至7. 5-8. 0,再次混匀后在加厚的聚乙烯塑料 袋内每袋分装1.5kg，扎紧袋口，并在121°C下湿热灭菌60min。在水平槽固体发酵盘底部 铺垫2张灭菌报纸，加入灭菌后的固体发酵培养基1. 5kg，装料厚度约为5cm。将预先转接 到PDA平皿中的拟康氏木霉TZ-11菌株，置于培养箱内28°C培养7d后，用无菌水洗下的孢 子，用显微镜计数后将孢子液浓度调配为：1. 〇X 1〇7个/mL。将100mL该孢子液均匀接种 至IJ 1. 5kg固体发酵培养基后，在发酵盘顶部盖2张灭菌报纸并用扎绳扎紧密封，最后放置于 28°C保湿培养箱内发酵，发酵环境相对湿度达到80 %以上，发酵8-10d，发酵产物活孢子量 可达 1. 0-2. 0X109cfu/g ;
[0018] (2)将上述发酵产物加入适量蒸馏水置于摇床上150rpm振荡洗涤8min，然后用 325目标准筛过滤并收集滤液，反复3次，最后将滤液在3000rpm下离心15min，收集沉淀物 备用。
[0019] (B)菌剂加工工艺
[0020] (1)将经固体发酵、离心后收集到沉淀物用〇· 5% (W/W)甲基纤维素溶液（溶液用 无菌水配制）悬浮，并将悬浮液中活孢子的含量调节成> 5. OX 108cfu/mL ;
[0021] (2)将亚甲基二萘磺酸钠、十二烷基苯磺酸钙、轻质碳酸钙和硅藻土按5:4:1:90 的重量比混合后，通过气流粉碎使细度达到325目以上，然后加入配制好的孢子悬浮液，最 后经50°C气流烘干、搅拌机混匀和包装后加工成含拟康氏木霉TZ-11菌株活孢子的可湿性 粉剂。其中所述拟康氏木霉τζ-ll菌株可湿性粉剂的活孢子含量> 1.0X108cfu/g。
[0022] 本发明的有益效果
[0023] (1)本发明为了解决葡萄和草莓等作物栽培中炭疽病防治的问题，结合农业生产 实际需求，提供一株新的生防菌株--拟康氏木霉TZ-11菌株，由该菌株经固体发酵而制 得的可湿性粉剂，可用于防治由围小丛壳菌（Glomerella cingulata)侵染引起的炭疽病， 例如辣椒、芒果、香蕉和枇杷等很多作物炭疽病的防治，尤其是由围小丛壳菌（Glomerella cingulata)侵染引起的葡萄炭疽病和草莓炭疽病等病害。田间试验结果表明，该菌剂对葡 萄炭疽病和草莓炭疽病均有很好的防治效果。
[0024] (2)菌株发酵工艺简单，生产成本低廉；菌剂活孢子含量高，贮藏性质稳定。
[0025] 本发明的拟康氏木霉 TZ-11 (Trichoderma koningiopsis TZ-11)菌株已于 2010 年 7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所）保藏，保藏编号为：CGMCCNo. 3969。
【具体实施方式】
[0026] 下面列举实施例对本发明进一步说明，但不因此限制本发明的内容。
[0027] 实施例1本实施例说明获得拟康氏木霉（Trichoderma koningiopsis)TZ-11菌株 的方法。
[0028] PDA培养基配方为：马铃薯（去皮）200g/L，葡萄糖20g/L，水1L，琼脂20g/L，pH自 然。将马铃薯去皮，切成小块，于锅中加水约1L煮沸半个小时，用双层纱布过滤，取其滤液 加葡萄糖，并加水补足1L。
[0029] 包括以下步骤：
[0030] 1)菌株的分离、纯化与保存。
[0031] 在江苏省句容市葡萄种植区内的巨峰葡萄上采集样品，在超净工作台上将采集的 样品在PDA平皿上进行组织分离，根据真菌的菌落特征及时挑取不同形态单菌落至PDA平 皿上，纯化2次，记录菌株号，将已纯化的菌株转到PDA斜面上培养好后放入4°C冰箱中备 用。然后将上述分离保存的真菌菌株转接中PDA平皿上活化，采用平皿对峙培养法筛选围 小丛壳菌（Glomerella cingulata)的拮抗菌株，根据抑菌圈的大小评定菌株的拮抗活性。
[0032] 2)鉴定囷株种属并保减。
[0033] 将拮抗活性最强的菌株传代纯化培养后，对菌株进行分子鉴定，鉴定结果显示 菌株为拟康氏木霉（Trichoderma koningiopsis),对其命名为拟康氏木霉（Trichoderma koningiopsis)TZ-11 菌株，并制作拟康氏木霉（Trichoderma koningiopsis)TZ-11 菌株的 冷冻干燥管进行原始菌株的冻藏。
[0034] 上述菌种的菌落形态及显微特征为：在麦芽汁琼脂培养基（MEA)上生长快， 25°C黑暗条件下培养4d菌落直径60-63mm，初期白色，后期因产孢呈灰绿色，质地絮 状；背面浅褐色，无水溶性色素。分生孢子结构大量形成，产孢区均匀分布。菌丝壁 平滑或粗糙，多分枝，具分隔，宽2.0-3. 5μπι;分生孢子梗壁光滑，主轴明显，对生分枝 情况较少，宽2.0-3. 5μπι;产孢瓶梗多数2-4个簇生于分生孢子梗或其分枝上，基部 柱状或略膨大6. 2-15. 0X2. 0-3. 5μπι;分生孢子椭圆形，深绿色，壁平滑或稍粗糙， 3. 5-5. 5X1. 8-3. 0 μ m〇
[0035] 本发明的拟康氏木霉（Trichoderma koningiopsis) TZ-11菌株rRNA基因序列对 应的DNA序列（该段rRNA包括了 18SrRNA片段，ITS1、5. 8SrRNA、ITS2区全序列及28SrRNA 序列片段）如SEQIDN0 :1所示。。
[0036] 实施例2用本发明的防治炭疽病的菌株TZ-11制备可湿性粉剂
[0037] 制备方法包括以下步骤：
[0038] (A)固体发酵培养物的获得
[0039] (1)将麦麸和锯木屑按3:7 (V/V)的比例混匀后，分别加入0. 1 % (W/W)的蔗糖和 碳酸铵，并加水使含水量为60?65 %，pH调至7. 5-8. 0,再次混匀后在加厚的聚乙烯塑料 袋内每袋分装1.5kg，扎紧袋口，并在121°C下湿热灭菌60min。在水平槽固体发酵盘底部 铺垫2张灭菌报纸，加入灭菌后的固体发酵培养基1. 5kg，装料厚度约为5cm。将预先转接 到PDA平皿中的拟康氏木霉TZ-11菌株，置于培养箱内28°C培养7d后，用无菌水洗下的孢 子，用显微镜计数后将孢子液浓度调配为：1. OX 1〇7个/mL。将100mL该孢子液均匀接种 到1. 5kg固体发酵培养基后，在发酵盘顶部盖2张灭菌报纸并用扎绳扎紧密封，最后放置 于28°C保湿培养箱内发酵，发酵环境相对湿度达到80%以上，发酵8-10d，发酵产物活孢子 量可达1. 0-2. OX 109cfu/g ; (2)将上述发酵产物加入适量蒸馏水置于摇床上150rpm振荡 洗涤8min，然后用325目标准筛过滤并收集滤液，反复3次，最后将滤液在3000rpm下离心 15min，收集沉淀物备用。
[0040] (B)菌剂加工工艺
[0041] (1)将经固体发酵、离心后收集到沉淀物用0. 5% (W/W)甲基纤维素溶液（溶液用 无菌水配制）悬浮，并将悬浮液中活孢子的含量调节成>5.0乂108(^11/ 1^;(2)将亚甲基二 萘磺酸钠、十二烷基苯磺酸钙、轻质碳酸钙和硅藻土按5:4:1:90的重量比混合后，通过气 流粉碎使细度达到325目以上，然后加入配制好的孢子悬浮液，最后经50°C气流烘干、搅拌 机混匀和包装后加工成含拟康氏木霉TZ-11菌株活孢子的可湿性粉剂。其中所述拟康氏木 霉TZ-11菌株可湿性粉剂的活孢子含量彡1. OX 108cfu/g。
[0042] 实施3试验实施例
[0043] (1)TZ-11菌株可湿性粉剂对围小丛壳菌（Glomerella cingulata)的室内毒力
[0044] TZ-11菌株可湿性粉剂对围小丛壳菌的室内毒力测定方法如下：
[0045] 分别用无菌水将1. OX 108cfu/gTZ-ll菌株可湿性粉剂和1. OX 106cfu/g寡雄腐 霉可湿性粉剂（北京比奥瑞生物科技有限公司）依次稀释至一定浓度，再将lmL药液与 9mLPDA培养基在培养皿内混匀，制成含系列梯度浓度药剂的PDA培养基，各药剂在PDA培养 基中的系列梯度浓度均设计为 1. 〇Xl〇5、5. 0X104、1. 0X104、5. 0X103、1. 0X103、5. 0X102 和1. OX 102cfu/mL，采用无菌水作对照，各处理重复4次。将保留的围小丛壳菌移植到PDA 平皿中，在25°C下活化96h，然后在近菌落边缘用打孔器制取直径为5mm的菌饼，并移植到 上述含药和空白对照的PDA平皿中，25 °C培养96h，待对照中菌落长至约平皿直径的4/5时， 采用十字交叉法量取菌落直径。计算菌落直径平均值，并按照下列公式计算菌丝生长平均 抑制率：菌丝生长平均抑制率={(对照菌落直径均值-处理菌落直径均值）八对照菌落直 径均值-接种菌饼直径）} X 100%。采用DPS数据处理系统，计算出各药剂对围小丛壳菌菌 丝生长抑制的回归方程、EC5(I及其95 %置信限。
[0046] TZ-11菌株可湿性粉剂对围小丛壳菌的室内毒力测定结果：
[0047] 室内毒力测定结果（表1)表明，TZ-11菌株可湿性粉剂和寡雄腐霉可湿性粉剂对 围小丛壳菌菌丝生长抑制的EC 5(I分别为：8. 2979Χ102和1.4434X 103yg/mL，相差约1.7 倍，TZ-11菌株可湿性粉剂对围小丛壳菌菌丝生长抑制的活性高于寡雄腐霉可湿性粉剂。
[0048] 表1TZ-11菌株的可湿性粉剂对围小丛壳菌（Glomerella cingulata)的室内毒力 测定结果
[0049]
【权利要求】
1. 一株拟康氏木霉菌株，其特征在于，该菌株的分类命名为拟康氏木霉τζ-11 ΤΖ-11),该菌株已于2010年7月8号在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No. 3969。
2. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，SEQ ID NO :1所示的为rRNA基因序列对应 的DNA序列，该段rRNA包括了 18S rRNA片段，ITS1、5. 8S rRNA、ITS2区全序列及28S rRNA 序列片段。
3. 权利要求1-2所述的菌株在防治由围小丛壳菌侵染引起 的炭疽病病害方面的应用。
4. 一种用权利要求1-2所述的菌株制备的可湿性粉剂。
5. -种制备根据权利要求4所述的可湿性粉剂的方法，其特征在于包括以下步骤： (A) 固体发酵培养物的获得 (1) 将麦麸和锯木屑按3:7(V/V)的比例混匀后，分别加入0. 1%(W/W)的蔗糖和碳酸铵， 并加水使含水量为6(T65%，pH调至7. 5-8. 0,再次混匀后在加厚的聚乙烯塑料袋内每袋分 装1. 5kg，扎紧袋口，并在121°C下湿热灭菌60 min ; 在水平槽固体发酵盘底部铺垫2张灭菌报纸，加入灭菌后的固体发酵培养基1. 5 kg，装 料厚度约为5 cm ; 将预先转接到PDA平皿中的拟康氏木霉TZ-11菌株，置于培养箱内28°C培养7d后，用 无菌水洗下的孢子，用显微镜计数后将孢子液浓度调配为：1. 〇 X 1〇7个/mL ; 将100mL该孢子液均匀接种到1. 5 kg固体发酵培养基后，在发酵盘顶部盖2张灭菌报 纸并用扎绳扎紧密封，最后放置于28°C保湿培养箱内发酵，发酵环境相对湿度达到80%以 上，发酵8-10d，发酵产物活孢子量可达1. 0-2. 0 X 109cfu/g ; (2) 将上述发酵产物加入适量蒸馏水置于摇床上150rpm振荡洗涤8min，然后用325目 标准筛过滤并收集滤液，反复3次，最后将滤液在3000rpm下离心15min，收集沉淀物备用； (B) 菌剂加工工艺 ⑴将经固体发酵、离心后收集到沉淀物用〇.5%(W/W)甲基纤维素溶液悬浮，其中溶液 用无菌水配制，并将悬浮液中活孢子的含量调节成> 5. 0X108 cfu/mL ; (2)将亚甲基二萘磺酸钠、十二烷基苯磺酸钙、轻质碳酸钙和硅藻土按5:4:1:90的重 量比混合后，通过气流粉碎使细度达到325目以上，然后加入配制好的孢子悬浮液，最后 经50°C气流烘干、搅拌机混匀和包装后加工成含拟康氏木霉TZ-11菌株活孢子的可湿性粉 剂。
6. 根据权利要求5中所述的可湿性粉剂的制备方法，其特征在于所述的拟康氏木霉 TZ-11菌株活孢子含量彡1. OX 108cfu/g。
【文档编号】C12N1/14GK104059860SQ201410316956
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】陈宏州, 肖婷, 杨敬辉, 庄义庆 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所