一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抑制小鼠 GH基因表达的shRNA的载体及 其应用。
【背景技术】
[0002] Small interfering RNA siRNA是一种小RNA分子，它的核苷酸序列长度为? 21-25,由Dicer，RNAase III家族中对双链RNA具有特异性的酶加工而成。SiRNA是siRISC 的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。RNA干涉RNAinterference，RNAi是指内 源性或外源性双链RNA，dsRNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达 沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。
[0003] 小鼠生长激素 mouse growth hormone, mGH是小鼠垂体前叶分泌的一个单链多肽 类激素，它能加速蛋白质的合成和脂类的代谢，因而具有较高的商业价值和科研价值，我们 发现不同内含子对生长激素基因的表达有很大的差异。shRNA包括两个短反向重复序列， 中间由一茎环loop序列分隔的，组成发夹结构，由pol III启动子控制。随后在连上5-6个 T作为RNA聚合酶III的转录终止子。在细胞或活体组织中输送"短干涉RNA" siRNA的一种 办法是将siRNA序列作为"短发夹"克隆进真核表达载体中。当送入动物体内时，该发夹序 列被表达出来，形成一个"双链RNA" shRNA，并被RNAi通道处理。
[0004] 目前，缺乏一种有效抑制小鼠 GH基因表达的ShRNA的载体及其应用。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种有效抑制小鼠 GH基因表达的shRNA的载 体及其应用。
[0006] 为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明提供了一种抑制小鼠 GH基因表达的shRNA的载体，所述shRNA包括分别与GH mRNA序列特异性结合在340位点 的 GH-mus-340、544 位点的 GH-mus-544、616 位点的 GH-mus-616 和 627 位点的 GH-mus-627 ;
[0007] 所述 GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627 的 DNA 模板包括 siRNA 正 义链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信 号的核苷酸序列。
[0008] 进一步地，所述GH-mus-340的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO: 1所示的核 苷酸序列，所述GH-mus-340的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:2所示的核苷酸序 列；
[0009] 所述GH-mus-544的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列， 所述GH-mus-544的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
[0010] 所述GH-mus-616的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列， 所述GH-mus-616的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；
[0011] 所述GH-mus-627的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列， 所述GH-mus-627的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。
[0012] 进一步地，所述正义链模板的5'端添加了 CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补； 反义链模板的5'端添加了 GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；当siRNA的第一个碱基 不是G时，在CACC后补加一个G。
[0013] 更进一步地，所述loop环的核苷酸序列是TTCAAGAGA ;终止信号的核苷酸序列是 TTTTTTo
[0014] 本发明所述的抑制小鼠 GH基因表达的小干扰RNA质粒，所述所述GH-mus-340、 GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板，经单链退火形成双链的shRNA分子后， 分别插入到pGPU6/GFP/Neo载体中，构建4个干扰RNA质粒，分别为pGPU6/GFP/Ne〇-GH340、 pGPU6/GFP/Ne〇-GH544、pGPU6/GFP/Ne〇-GH616 及 pGPU6/GFP/Ne〇-GH627。
[0015] 本发明所述的shRNA在抑制小鼠 GH基因表达的药物中的应用。
[0016] 本发明所述的抑制小鼠 GH基因表达的shRNA的载体在制备降低小鼠 GH基因表达 的试剂中的应用。
[0017] 有益效果：本发明能有效抑制小鼠 GH基因表达的shRNA的载体及其应用。本发明 设计的4条GH shRNA序列均有很好的抑制GH基因表达的活性，且4个GH shRNA过表达载 体均具有很高的表达效率。涉及4个过表达小鼠 GH shRNA载体的构建及4条专用GH shRNA 片段。本发明通过荧光PCR及western blot分别从mRNA及蛋白水平分析各对shRNA的干 扰效率。
【附图说明】
[0018] 图1为重组载体酶切鉴定图
[0019] 图2为本发明实施例重组载体的示意图；
[0020] 图3为QRT-PCR检测shRNA干扰后的GH表达图；
[0021] 图4为GH蛋白表达检测图；
[0022] 图5为GH蛋白表达灰度分析图。
【具体实施方式】
[0023] 本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明 目的，而不用于限制本发明范围。
[0024] 如图1至图5所示，本发明提供了一种抑制小鼠 GH基因表达的shRNA的载体， 所述shRNA包括分别与GH mRNA序列特异性结合在340位点的GH-mus-340、544位点的 GH-mus-544、616 位点的 GH-mus-616 和 627 位点的 GH-mus-627 ;
[0025] 所述 GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627 的 DNA 模板包括 siRNA 正 义链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信 号的核苷酸序列。
[0026] 所述GH-mus-340的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列， 所述GH-mus-340的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；
[0027] 所述GH-mus-544的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列， 所述GH-mus-544的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
[0028] 所述GH-mus-616的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列， 所述GH-mus-616的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
[0029] 所述GH-mus-627的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列， 所述GH-mus-627的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0030] 所述正义链模板的5'端添加了 CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板 的5'端添加了 GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；当siRNA的第一个碱基不是G时， 在CACC后补加一个G。
[0031] 所述loop环的核苷酸序列是TTCAAGAGA ;终止信号的核苷酸序列是TTTTTT。
[0032] 本发明所述的抑制小鼠 GH基因表达的小干扰RNA质粒，所述所述GH-mus-340、 GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板，经单链退火形成双链的shRNA分子后， 分别插入到pGPU6/GFP/Neo载体中，所述载体包括pGPU6、GFP和Neo。构建4个干扰RNA质 粒，分别为 pGPU6/GFP/Ne〇-GH340、pGPU6/GFP/Ne〇-GH544、pGPU6/GFP/Ne〇-GH616 及 pGPU6/ GFP/Ne〇-GH627〇
[0033] 本发明所述的shRNA在抑制小鼠 GH基因表达的药物中的应用。
[0034] 本发明所述的抑制小鼠 GH基因表达的shRNA的载体在制备降低小鼠 GH基因表达 的试剂中的应用。
[0035] 实施例1
[0036] GH shRNA的设计及合成
[0037] (1)寡核苷酸的合成
[0038] 根据小鼠 GH mRNA的核苷酸序列是SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。针对不同位点 设计4条shRNA和对照shRNA，模板中的loop结构选用了 TTCAAGAGA以避免形成终止信号， shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5'端添加了 CACC，与BbsI酶切后形成 的粘端互补；反义链模板的5'端添加了 GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；如果siRNA 的第一个碱基不是G，则在CACC后补加一个G，序列名称分别为GH-mus-340、GH-mus-544、 GH-mus-616、GH-mus-627,另外设计阴性对照shRNA，所述阴性对照正义链的核苷酸序列是 SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列，所述阴性对照反义链的核苷酸序列是SEQ ID NO: 11所示 的核苷酸序列。
[0039] (2) shRNA模板的退火
[0040] 将DNA oligo分别用TE (pH8. 0)溶解，浓度为100 uM。取相应的正义链和反义链 oligo溶液，按照如下配比配置退火反应体系。
[0041]
【主权项】
1. 一种抑制小鼠 GH基因表达的ShRNA的载体，其特征在于：所述ShRNA包括分别与 GHmRNA序列特异性结合在340位点的GH-mus-340、544位点的GH-mus-544、616位点的 GH-mus-616 和 627 位点的 GH-mus-627 ; 所述 GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627 的 DNA 模板包括 siRNA 正义 链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信号 的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的抑制小鼠 GH基因表达的shRNA的载体，其特征在于： 所述GH-mus-340的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，所述 GH-mus-340的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； 所述GH-mus-544的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，所述 GH-mus-544的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； 所述GH-mus-616的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列，所述 GH-mus-616的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； 所述GH-mus-627的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列，所述 GH-mus-627的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的抑制小鼠 GH基因表达的shRNA的载体，其特征在于：所述正 义链模板的5'端添加了 CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5'端添加了 GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；当siRNA的第一个碱基不是G时，在CACC后补加一 个G0
4. 根据权利要求1至3任一项所述的抑制小鼠 GH基因表达的shRNA的载体，其特征在 于：所述loop环的核苷酸序列是TTCAAGAGA ;终止信号的核苷酸序列是TTTTTT。
5. 权利要求1或2所述的抑制小鼠 GH基因表达的小干扰RNA质粒，其特征在于：所述 所述 GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627 的 DNA 模板，经单链退火形成双链 的shRNA分子后，分别插入到pGPU6/GFP/Neo载体中，构建4个干扰RNA质粒，分别为pGPU6/ GFP/Ne〇-GH340、pGPU6/GFP/Ne〇-GH544、pGPU6/GFP/Ne〇-GH616 及 pGPU6/GFP/Ne〇-GH627〇
6. 权利要求1所述的shRNA在抑制小鼠 GH基因表达的药物中的应用。
7. 权利要求1所述的抑制小鼠 GH基因表达的shRNA的载体在制备降低小鼠 GH基因表 达的试剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体，其特征在于：所述shRNA包括分别与GH？mRNA序列特异性结合在340位点的GH-mus-340、544位点的GH-mus-544、616位点的GH-mus-616和627位点的GH-mus-627；所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板包括siRNA正义链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信号的核苷酸序列。本发明能有效抑制小鼠GH基因表达，且4个GH？shRNA过表达载体均具有很高的表达效率。
【IPC分类】A61K48-00, C12N15-113, C12N15-63
【公开号】CN104560996
【申请号】CN201410826215
【发明人】鞠辉明
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月25日