专利名称：：慢病毒三链体dna、及含有慢病毒三链体dna的载体和重组细胞的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及病毒核酸和含有病毒核酸的细胞。更具体地，本发明涉及可以是三链体DNA结构一部分的病毒核酸序列，以及含有这些病毒核酸序列的核酸载体、病毒和细胞。本发明还涉及使用这些DNA结构和核酸序列的方法。相关技术描述在造血干细胞(HSC)中进行基因转移对于遗传性和获得性疾病的因为HSC具有广泛的增殖能力，所以稳定的基因转移^^"1^#基因的基因组整合。基于莫洛尼鼠类白血病病毒(MoMLV)的逆转录病毒之所以非常流行，是因为它们整合到宿主细胞基因組中并能允许长期转基因表达。但是，这些肿瘤逆转录病毒不整合到非分裂细胞中，而大多数HSC是静止的.已经开发了许多利用不同细胞因子组合的预刺激方法来引发HSC的细胞周期，以便使它们能被胂瘤病毒来源的有丝分裂依赖性基因转移载体转导，但是，细胞因子刺激诱导增殖，也诱导分化，HSC的潜能可能会在转导过程中丧失。这个问题可通过使用慢病毒来源的载体解决，因为慢病毒已显示感染分裂和非分裂细胞(Poznansky等，1991;Naldini等，1996).过去三年发表的使用这类慢病毒衍生载体转导HSC的最新报道显示很有前途，但结果差异很大(Case等，1991;E丽s等，1999:Uchida等，1998;Miyoshi等，1999).慢病毒进化了一套允许其DNA基因组穿越宿主细胞核膜的向核输入策略。慢病毒的这种活跃的向核输入解释了它们在逆转录病毒中独特的能在非分裂靶细胞如组织巨噬细胞中有效复制的能力。肝瘤病毒如MoMLV的复制限于分裂细胞，似乎是由于需要在有丝分裂过程中核膜屏障的破坏，使MoMLV整合前复合物(PIC)能进入核(Roe等，1993)。在慢病毒体内复制策略开始、因而也是其致病性开始时慢病毒不依赖有丝分裂的复制已使得产生了具有治疗应用前景的慢病毒基因转移载体(Poz腦asky等，1991;Naldini等，1996)。慢病毒不依赖有丝分裂的复制最初是由VISNA慢病毒生产性感染非有丝分裂软骨样细胞证实的(Thormar,1963)。在其发现后不久，发现HIV在分化的初级巨噬细胞中复制(Gartner等，1986;Ho等，1986)。HIVDNA整合在非有丝分裂耙细胞的染色体(Weinberg等，1991;Lewis等，1992)，提示HIV-1PIC能跨越宿主细胞的核膜(Bukrinsky等，1992)。因此，不依赖有丝分裂的向核输入是负责慢病毒在非分裂细胞中复制能力的关键事件。搜索负责HIV-1DNA基因组活跃向核输入的病毒决定因子已构成一个活跃而有争议的研究名页域。在基质蛋白(MA)和Vpr病毒蛋白中存在推测的核定位信号(NLS)产生了如下主张，即它们可能以冗余的方式在證-1DNA向核输入中起作用(Bukrinsky等，1993b;Eme簡n等，1994;Popov等，1998;vonSchwedler等，1994)。已提出，一小部分(1%)MA分子在C-端酪氨酸残基处磷酸化触发它们从质膜释放和与HIV-1整合酶蛋白締合(Gallay等，1995a;1995b)。这些蛋白质对HIV-1PIC的亲核特性的贡献目前是一个很有争议的问题(Freed和Martin,1994:Freed等，1995;Fouchier等，1997;Freed等，1997;Koostra和Schuitemaker，1999)。新近，已在整合酶蛋白(IN)中鉴定了NLS基序，且据报道这些基序中的突变消除IN与细胞NLS受体karyopherina的相互作用(Gallay等，1997)。发明概述无论这些候选病毒蛋白在HIV向核输入中的作用如何，本发明显示，逆转录的HIV-1基因组本身带有其向核输入的顺式作用决定因子(cis—actingdeterminant)。本发明提供含有三链(三链体)结构(如慢病毒的三链结构)的核酸。该三链体刺激核酸进入细胞核。该核酸可包含'艮病毒的cPPT和CTS顺式作用序列。该慢病毒可以是任何慢病毒，包括但不限于HIV-1、HIV-2、VISNA、EINV、FIV、和CAE。在实施方案中，该核酸处在载体如表达载体中。因此，本发明还提供载体，例如核酸栽体。核酸载体可包括从本本发明还提供含有本发明核酸的病毒和细胞(真核细胞或原核细胞)。该细胞可以是重组细胞。本发明还提供通过例如将宿主细胞暴露给本发明的核酸、载体、病毒或细胞而转移核酸到宿主细胞核以提供重组细胞的方法。本发明方法允i午核酸高效转移至宿主细胞核，例如造血干细胞的细胞核。高效转移允许本领域技术人员实施各种治疗方法，包括但不限于预防性治疗方法，改善性治疗方法，和治疗性治疗方法。例如本发明使得基因治疗方法成为可能.通常，基因治疗可用于治疗血液疾病、脑疾病、病毒性疾病、以及其它许多遗传的和获得的疾病。附图简述图1显示逆转录中心起始是HIV-1复制周期的重要步骤。(A)在HIV-1cPPT序列中导入突变，构建了保守和半保守cPPT突变病毒'半保守突变体cPPT-D在19聚体cPPT中包含10个突变。突变体cPPT-AG是其对照病毒，在该病毒中单个噤呤到噤呤突变在重叠整合酶编码区导入了相同的氨基酸改变.突变以翻转型显示。(B)cPPT中的突变对HIV-1感染性的影响.在PHA刺激的PBL(左图)和MT4(右图)上的病毒复制动力学。按照病毒上清的衣壳抗原(p24)含量用等量的病毒颗粒感染细胞。通过RT活性跟踪病毒随时间的产生。(C)在分裂或非分裂的坊栖菌素处理P4细胞(HelaCD4-LTRLacZ)中单周期病毒滴定.用化学发光分析测定P-半乳糖苷酶活性.结果表示为相对光单位(RLU)/秒/ng接种物p24，四个独立实验的平均值iSD。图2显示了cPPT中的突变不影响病毒生产、病毒DNA合成和病毒DNA体外整合能力。(A)cPPT中的突变对病毒生产的影响。用pLAI、pcPPT-AG、pcPPT-D质粒瞬时转染Hela细胞。病毒生产通过定量感染后48小时细胞上清中的p24病毒抗原来测量。(B)cPPT中的突变对逆转录效率的影响。用相同量的病毒颗粒(每l(f细胞300ngp24抗原)感染P4细胞，12小时后提取DNA。逆转录病毒DNA的总量，以内部MscIHIV-l片段代表，通过用相同DNA片段作为探针进行Southern印迹来检测，并用磷光成像仪(phosphorimager)定量。(C)cPPT中的突变对体外整合的影响。MT4细胞与H9-LAI或H9-cPPT-255慢性感染细胞共培养。从感染细胞细胞质分离的病毒整合前复合物的体夕卜整合按前人所述进州Farnet和Haseltine，1990)。每一泳道加载2xl(f感染细胞的细胞质DNA。图3显示，中心DNA三链体突变病毒是病毒DNA向核输入缺陷的。(A)HIV-1DNA合成、环化和整合的定量性跟踪策略。在感染后不同时间提取感染细胞的DNA，用Mscl和Xhol消化，并通过用重叠5，Mscl位点的探针进行Southern印迹来分析。无论整合或未整合状态的所有病毒DNA种类都共有的内部1.9kbDNA片段指示了感染细胞中病毒DNA的总量。揭示了2.6kb、2.8kb、和3.4kb分别相应于未整合线性DNA、一个、和两个LTR环状DNA的信号。因为PCR产生的探针刚好与Mscl位点重叠，所以每个条带的强度直接与相应病毒DNA种类的量成比例，因此，整合的前病毒DNA的量可通过从病毒DNA的总量中减去未整合的线性和环状病毒DNA的信号来计算。(B)在感染细胞中加工的病毒DNA的Southern印迹分析.P4细胞用按上清p24含量标化的等量的每种病毒感染.感染细胞在感染后不同时间裂解，提取DNA，用于上述定量分析。(C)一个感染周期(感染后48小时)结束时细胞内病毒DNA的分布图。结果表示为总病毒DNA的百分数。用MT4细胞获得类似的细胞内病毒DNA分布图(数据未显示)。图4显示，来自中心DNA三链体突变病毒的线性DNA在核膜附近聚集。(A)感染P4细胞的核/胞质的分级分离。感染后24小时核(N)和胞质(C)组分的病毒DNA的Southern印迹分析。按前人所述进行基于triton裂解的分级分离(Belgrader等，1991),DNA用Mscl限制性消化，并用重叠Mscl位点的探针杂交。(B)通过荧光原位杂交(FISH)检测各HIV-1基因组。P4细胞以高复数(每106细胞2pgp24抗原)感染，并用全长HIV-1基因组探针杂交。荧光信号通过tyramid沉淀放大。用去巻积显微镜检查(deconvolutionmicroscopy)分析通过细胞的光学切片。图5显示，在基于HIV-1的载体中插入中心DNA三链体增强载体DNA基因组的GFP转导和向核输入。(A)载体基因组的示意图。在逆转录过程中负责DNA三链体形成的cPPT和CTS中心顺式作用序列插入在先前描述的HRGFP载体(Naldini等，1996)的中心位置。TRIPinv-GFP以相反的、非功能性定向包括中心DNA三链体序列.(B)使用有或没有中心DNA三链体的HIV载体进行GFP转导的效率比较。分裂或非分裂(蚜栖菌素处理的)Hela细胞用作靼标，用微量滴定板荧光计(Wallac)定量转导后48小时的GFP荧光，结果表示为三次重复进行的代表性实验的平均值±SD.从信号中减去GFP活性的假转导(pseudotransduction),(C)Southern印迹分析在转导细胞中加工的载体DNA.转导的Hela细胞在感染后不同时间裂解，提取DNA，限制性消化，并使用类似用于病毒的策略进行Southern印迹.MscI消化代以EcoNI和Avail消化，探针是刚好覆盖EcoNI位点的PCRDNA片段.(D)感染48小时后载体DNA细胞内状态的定量分析。结果表示为总载体DNA的百分数。图6显示依赖于DNA三链体的HIV-1基因组向核输入模型。(A)中心DNA三链体突变病毒的观察到的表现型概观。HIV-l逆转录的中心起始和终止步骤创建了一个长的正链DNA瓣片结构(flapstructure):中心DNA三链体。HIV-1正链作为两个分离的半基因组区段来合成。下游区段起始于多嘌呤段序列的中心拷贝(cPPT)处。上游区段在99个核苷酸长链替换事件后终止于cPPT下游，被中心终止序列(CTS)阻断。在单个感染完成时，野生型病毒的病毒DNA几乎全部加工成整合的前病毒(-55%)、1LTR(35%)和2LTR环状DNA(〈5%),而小部分保持线性DNA(<10%)。cPPT中的突变影响中心DNA三链体的形成。中心起始突变病毒的最终逆转录产物是缺少中心DNA三链体的连续双链线性DNA(Charneau等，1992)。cPPT-D突变病毒的病毒DNA在感染细胞中以线性DNA分子积累，并位于核膜附近。(B)经过逆转录复合物(RTC)成熟为整合前复合物(PIC)和线性DNA转运通过核孔，三链体依赖性HIV-1基因组向核输入的两个推测的机制。HIV-1逆转录可能发生在被衣壳蛋白装置包围的有结构的(有序)复合物内。RTC的大小超过核孔的排除直径。在转移之前，RTC经过变为失去衣壳蛋白的更小PIC的成熟过程(Karageorgos等，1993)。DNA三链体的形成表示病毒DNA合成结束，并可能表示HIVDNA从衣壳装置内脱离.在PIC中，与LTRs顶端结合的整合酶蛋白二聚化后，线性DNA的末端可能桥接在一起(Miller等，1997).鉴于DNA三链体处于中心位置，故HIV-1PIC的一个合理结构是双丝，通过整合酶二聚化在中心三链体每一側对称折叠.这样，DNA三链体将构成可能与亲核穿梭蛋白相互作用的顶端，允许HIV-1DNA丝通过核孔，在cPPT突变病毒中，RTC成熟为PIC的缺陷将导致在核孔处积累完整病毒衣壳.或者，在cPPT突变线性DNA中DNA三链体的缺乏将抑制与穿梭蛋白相互作用，阻止HIV-1DNA转移通过核孔。在两种情况下，cPPT突变病毒的DNA都在核膜附近积累成线性DNA,图7显示采用CD34+人脐带血细胞进行转导实验的结果。(A)在这里所述的条件下存在100ng/ml病毒P24时转导24小时的人脐带血CD34+细胞的FACS分析。分析在24小时转导期结束时洗涤细胞后48小时进行。百分数表示形态学gated造血细胞的比例。X平均值表示绿色荧光强度的平均值。(B)在转导后5天分析GFP表达。图8以图表示病毒剂量对转染效率的影响。(A)表达eGFP的CD34+细胞的百分数。(B)CD34+eGFP+细胞的GFP焚光强度平均值。(C)CD34+eGFP+细胞的GFP荧光强度平均值乘以CD34+eGFP+细胞的百分数。CD34+细胞在本文所述条件下用包含CMV启动子控制下的eGFP编码序列和包含(粗线)或没有(虚线)三链体结构的慢病毒载体转导24小时。分析在24小时转导期结束时洗涤细胞后48小时进行。图9显示对在本文所述条件下用具有完整HIV-1LTR(左图)或U3缺失的HIV-1LTR(右图)和内部CMV启动子(上图)或EF-1a启动子(下图)的慢病毒载体转导了24小时的人脐带血CD34+细胞的FACS分析。(A)在24小时转导期结束时洗涤细胞后48小时进行分析。(B)在24小时转导期结束时洗涤细胞后120小时进行分析。分析可区分明亮的(未成熟)和暗淡的CD34细胞。百分数表示为形态学gated的造血细胞的比例。当指明时，第二个数代表绿色焚光的平均值。发明详述前面我们已显示，HIV-1进化了一套复杂的逆转录策略，该策略在基因组中心处发生的两个步骤上与胂瘤病毒不同与终止步骒偶联的正链合成的一个附加起始.HIV-1正链DNA作为两个分开的半基因组区段而合成。在所有慢病毒基因组中心存在的一个多噤呤段顺式作用序列的附加拷贝(cPPT)起始下游正链的合成(Charneau等，1991,1992)。起始于3，PPT的上游正链区段在链转移后前进到基因组的中心，并在不连续的链置换事件后终止(图6A)。HIV-l逆转录的该最后时间顺序事件由中心终止序列(CTS)顺式作用序列控制，后者在链置换合成的特定环境中在该位点排出HIV-1逆转录斷RTXCharneau等，1994;Lavigne等，1997)。因此，HIV-l逆转录的最终产物是在中心含有稳定的99核苷酸长DNA瓣片的线性DNA分子，此DNA瓣片在此称作中心DNA三链体(图6A)。中心起始和终止突变病毒都合成没有野生型DNA三链体的逆转录产物。如图6A所示，对于中心起始突变体，最终产物是缺乏中心三链体的连续双链线性DNA(Charneau等，1992)。起始于cPPT处的下游正链区段没有合成。因此，在基因组中心没有发生链置换；转移的正链延伸到整个基因組。对于中心终止突变体，中心链置换事件不再被突变的CTS序列控制，而且与不连续的野生型DNA三链体相比，产生更长的随机分布的正链重叠(Charneau等，1994)。cPPT或CTS顺式作用序列中的突变严重损害HIV复制，表明中心三链体在逆转录生命周期中的直接作用(Charneau等，1992;Hungnes等，1992;Char廳u等，1994)本发明揭示，在病毒DNA转移通过核孔之前即刻、或过程中HIV-1基因组向核输入的后期步骤涉及HIV-l的中心DNA三链体.因此，慢病毒逆转录的该独特特征至少部分地解释了在逆转录病毒中慢病毒在非分裂相比细胞中复制的特有能力。本发明还揭示，缺乏中心DNA三链体的HIV基因转移载体显示强烈的向核输入缺陷。本发明证明，HIV-1基因组中心顺式作用序列插入前人描述的HIV载体(Naldini等，1996)中通过弥补原始载体DNA的向核输入缺陷到野生型水平增加了转导效率.该发现提供了中心DNA三链体在HIV-1向核输入中的作用的又一独立证据。DNA三链体描述成慢病毒的向核输入决定因子，对于设计有效的慢病毒载体具有重要意义。因为慢病毒感染非分裂耙细胞依赖于它们在主动向核输入途径中的应用，所以优选在衍生的载体结构中保留该慢病毒向核输入决定因子。传统的逆转录病毒载体结构是置换型载体，其中LTRs中间的整个病毒^码序列被缺失，并替代以目的序列(MillerAD，1997)。对于慢病毒载体，这种传统策略导致中心顺式作用序列cPPT和CTS的缺失。三链体在HIV向核输入中的重要作用暗示，这种置换载体结构不是最佳的。该发现确立了如下事实，即该DNA三链体向核输入决定因子在HIV-1衍生慢病毒载体的异源环境中是可操作的。尤其是来自天然HIV-1基因组环境的DNA三链体可促进异源DNA序列的向核输入(PCT法国9805197，1998年4月24日)。DNA三链体序列的存在诱导造血干细胞中基因转导效率的显著增加。因此，一方面，本发明提供能参与三链体核酸结构(即三链核酸)的核酸(DNA或RNA，或其类似物)。在本发明的一些实施方案中，该核酸是慢病毒序列。在一些实施方案中，该核酸通过例如定向诱变(即有意缺失、插入、或替代至少一个核普酸)或选择性压力诱变从慢病毒序列衍生而来。本发明的核酸允许高效转移核酸到宿主细胞，尤其是宿主细胞核中。由于具有该能力，与本发明核酸可操作地或物理地连接的基因可以以高水平和/或在高百分数的暴露于该核酸的细胞中表达。根据本发明插入在慢病毒基因组三链区中的DNA在该结构中尤其稳定，并有助于实现高水平的转导和转染。在一个优选实施方案中，本发明提供慢病毒cPPT和CTS区诱导的三链DNA序列，其能诱导载体DNA高比率地进入宿主细胞细胞核，或能增加载体DNA的向核输入的比率。在一些实施方案中，该三链DNA序列可与异源核酸序列如报道基因或其它目的基因共价相连.例如本发明核酸可包含编码肽、多肽或蛋白质的的异源核酸序列。在一些实施方案中，异源核酸序列存在于三螺旋区内，在一些实施方案中，异源核酸序列与三螺旋区存在于相同核酸上，但在三螺旋之外.在一些实施方案中，单个核酸包含慢病毒cPPT和CTS区诱导的一个以上三链序列，另一方面，本发明提供含有至少一个能参与三链体核酸结构形成的序列的载体，如穿梭载体、表达载体、整合载体、转座子、反转录转座子和类似物。在一些实施方案中，载体含有能参与三链体核酸结构形成的单个序列。在一些实施方案中，载体含有至少一个能参与三链体核酸结构形成的序列。该载体可用于将本发明的核酸从一个细胞转移到另一个，用于帮助产生大量本发明的核酸，和用作其它目的核酸序列(如报道基因、治疗基因)可以插入其中的基本分子。在另一方面，本发明提供用含有至少一个能参与三链体核酸结构的序列的病毒核酸序列高效感染、转染、或转导细胞的方法。在一些实施方案中，该方法包括将细胞、或多个细胞暴露给至少一个拷贝的本发明核酸、载体、病毒、或细胞。在一些实施方案中，暴露细胞给本发明核酸、载体、病毒、或细胞的步骤在这样的条件下进行，使得本发明的核酸、载体、病毒、或细胞能进入靶(宿主)细胞。在优选实施方案中，该条件是使得高水平的本发明核酸、载体、病毒、或细胞进入扭细胞的条件。在一些实施方案中，该方法是高效的，允i午本发明核酸插入到30%或更多暴露给该核酸的细胞中。在一些实施方案中，摄取本发明核酸的细胞核的百分数是40%或更高，例如50%或更高，60%或更高，70%或更高，80%或更高，或90%_10%。在优选实施方案中，摄取本发明核酸的细胞核的百分数是大于80%,更优选大于85%,最优选大于90%，例如大于95%。在一些实施方案中，该细胞用含本发明核酸的全病毒(包括噬菌体)或细菌感染或转染。在一些实施方案中，本发明核酸采用机械的和/或化学的方法(如电穿孔、脂质体融合)导入细胞中。在一些实施方案中，靶宿主细胞摄取棵的本发明核酸。因此，在一个实施方案中，本发明提供含有cPPT和CTS区域的核苷酸序列的用途，其在慢病毒或逆转录转座子载体中在逆转录后采取三链DNA结构(三链体)，并刺激载体DNA进入转导细胞的细胞核中，还刺激载体DNA向核输入到转导细胞的细胞核中的比率.在本发明的一个方面，提供含有本发明核酸或载体的重组细胞。重組细胞可以是任何细胞(原核的或真核的)，包括其后代或衍生物。因此，本发明包括用本发明的细胞创建的细胞。在一些实施方案中，该细胞是真核细胞。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞，如HeLa细胞或造血细胞，如造血干细胞。因此，在一些实施方案中，本发明提供转导真核细胞的方法，其中该方法包括使用由慢病毒cPPT和CTS区域诱导的三链DNA序列，其能诱导载体DNA高比率地进入宿主细胞核，或能增加载体DNA向核输入的比率。因为本发明重组细胞能高水平地表达目的异源基因，所以这些细胞可用于许多应用中。这些应用包括但不限于在细胞培养中生产高水平的目的蛋白质(如有治疗价值的蛋白质)和通过将本发明的重组细胞导入需要该蛋白的个体内来体内原位生产目的蛋白。该个体可以是动物或人。因此，本发明具有兽医应用和医疗应用。在一些实施方案中，本发明的该方面提供通过将靶细胞暴露给本发明的核酸、载体、或病毒并经过例如转导、转化、或转染等允许该靶细胞摄取本发明的核酸，而生产目的重组蛋由质的方法.在核酸导入耙细胞后，细胞在一定条件下培养，籍此由该耙细胞表达、并因而产生目的重组蛋白质，该靶细胞现在被认为是根据本发明的重组细胞。尽管该方法可以在单个的个别细胞上实施，但4艮明显，如果在所有细胞都是克隆的细胞群上实施的话，该方法将常常更为实用。这里所用的"细胞"是指单个细胞或相同细胞的群体。该方法可以还包括从重組细胞或细胞培养液中纯化或分离目的蛋白质.在这样的方法中，可采用本领域技术人员已知的蛋，一质表达和纯化技术。这些技术是本领域技术人员熟知的，因此不需要在此详述。在一个优选实施方案中，本发明的该方面提供体外表达目的基因的方法，其中该方法包括a)在一定条件下将靶细胞暴露给含有目的基因和至少一个拷贝的逆转录病毒cPPT和CTS顺式作用区域的分离或纯化核酸，其中cPPT和CTS区域可诱导三链DNA结构，所述条件允许该核酸被乾细胞摄取以产生重组细胞，和b)在允许至少一部分该核酸转移到重组细胞的细胞核并允许目的基因表达的条件下培养重組细胞.在一些实施方案中，该方法使用根据本发明的载体，因此，本发明提供在例如组织培养物中体外表达目的基因的方法。在一些实施方案中，该方法包括在靶细胞能摄取含有目的基因的本发明分子的条件下将乾细胞暴露给本发明的核酸、载体、病毒、或细胞。然后在目的基因表达的条件下使由此制备的重组细胞生长和复制。在一些实施方案中，基因表达的体外方法与纯化或分离目的蛋白质的方法偶联。在这些实施方案中，可采用本领域技术人员已知的技术，包括但不限于液层色谱、沉淀、离心、凝胶过滤和亲和层析，从其它细胞组分中纯化或分离目的蛋白质。适当的技术对于本领域技术人员是已知的，不需要详细描述。因此，本发明还提供在例如需要目的基因表达的蛋白质的个体内体内表达目的基因的方法。在一些实施方案中，体内表达基因的方法包括在该个体外通过将宿主细胞暴露给本发明的核酸、栽体、病毒、或细胞制备根据本发明的重组细胞来制备重组细胞。然后将本发明的该重组细胞施用、导入、或以其它方式暴露给该个体，由此表达此目的基因。例如，该方法可包括将含有本发明核酸的重组细胞施用给个体，并允许该重组细胞在该个体体内表达该核酸。在一个优选实施方案，重组细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，该重组细胞首先从非重组细胞中纯化或分离，然后施用、导入、或以其它方式暴露给该个体，在其它实施方案中，体内表达基因的方法包括将该个体暴露(例如施用、导入等)给本发明的核酸、载体和/或病毒。在一些实施方案中，此核酸、载体、和/或病毒转染/转导/感染该个体的至少一个细胞，由此表达该目的基因。例如，该方法可包括将本发明的核酸、栽体、或病毒以足以导致目的基因在个体体内表达的量和形式施用给该个体。优选地，该方法导致目的基因在靶组织或细胞内表达.在一个实施方案，本发明的该方面提供了治疗患有、或很有可能发展具有遗传基础的疾病或病症的个体的方法.该方法包括给该个体施用含有a)编码治疗性蛋白质的核酸和b)至少一个拷贝的逆转录病毒cPPT和CTS顺式作用区域的逆转录病毒载体，其中cPPT和CTS区可诱导三链DNA结构，所施用的载体量足以导致表达足以治疗该疾病或病症的量的治疗性蛋白质。该治疗可以是预防性的、改善性的、或治疗4生的。该方法可治疗血液疾病或病症、脑或神经系统疾病或病症、或发育疾病或病症。体内导入和/或表达基因的技术是本领域技术人员已知的。实施者可以选择最适于给定蛋白质或靶组织或细胞的技术。因此，本发明提供治疗宿主的方法，包括使用含有由慢病毒cPPT和CTS区域诱导的三链DNA序列的逆转录病毒载体，其能诱导载体DNA高比率地进入宿主细胞核，或能增加载体DNA向核输入的比率。根据本发明的上述各方面，本发明提供试剂盒。该试剂盒能包含本发明的至少一个核酸、至少一个载体、至少一个病毒、或至少一个细胞、或这些的任何或所有组合。该试剂盒能在单个组合物中一起提供、或分开地(例如在不同容器中)提供本发明上述实施方案的每一个。在一些实施方案中，该试剂盒包含将本发明核酸、载体、病毒和细胞用于期望目的所必需试剂和物资的一些或全部。本发明公开了HIV-1向核输入的独创机制，在该机制中三链DNA结构，DNA三链体，起到关键作用。HIV-1进化了一套复杂的逆转录策略，由此，与逆转录的中心起始和终止连续的中心链置换事件在未整合线性HIV-1基因组的中心创建了一个DNA三链体。该DNA三链体反过来又充当HIV-1基因组向核输入的顺式作用决定因子。本发明显示，HIV-1逆转录的两个独特步骤，中心起始和终止，解释了HIV-1感染非分裂靶细胞的能力。本发明的实施例进一步显示，DNA三链体的缺乏导致产生在分裂或非分裂细胞中几乎无感染性的病毒.结构cPPT中的突变不影响病毒DNA合成的速率或其体外整合的能力，但cPPT突变病毒的大部分逆转录DNA分子随着时间的过去积累成非整合的线性DNA。相反，野生型病毒的线性DNA几乎全部加工成整合的前病毒和DNA环。cPPT突变病毒的细胞内DNA分布图表明向核输入的缺陷，病毒DNA由于不能到达其能整合或环化的核区室而导致积累成线性分子.最可能影响通过NPC的转运的病毒DNA输入的最后缺陷，被感染细胞的分级分离和细胞内病毒DNA的直接观察(FISH)所证实。三链体缺陷的线性DNA分子与核膜相联。本发明集中在cPPT突变病毒的分析，其特征在于没有中心DNA三链体。本文给出的大多数实验也用先前描述的CTS突变病毒(Charneau等，1994)来进行，得到相同的结果(数据未显示)。在CTS突变病毒中，逆转录产生含有比野生型病毒的不连续中心DNA三链体更大的、随机分布的正链重叠的线性DNA分子。因此，DNA三链体的存在及其结构的完整性是HIVDNA向核输入重要的。本发明显示，DNA三链体在基于HIV-1的载体系统中是有效的。它插入没有三链体的载体中可逆转载体DNA向核输入的强烈缺陷到野生型的向核输入水平。中心DNA三链体是慢病毒共同的向核输入决定因子。对于HIV-1，中心DNA三链体的位置已精确地定义。中心链置换起始于cPPT序列之后的第一个核苷酸(Charneau和Clavel，1991)，一般终止于下游99个核普酸，CTS的ter2位点处(Charneau等，1994)。三链体三DNA链的三维构型还不清楚。然而，在基因组中心存在DNA三链体可以推及所有慢病毒。PPT的中心拷贝是所有慢病毒基因组的共有特征，并且在约100核苷酸下游还存在由(A)n和(T)n序列段的存在所揭示的推测CTS终止子元件(Charneau等，1994)。最近已表征了有蹄类动物慢病毒EIAV的中心DNA三链体(Stetor等，1999)。通过Sl核酸酶切割揭示VISNA病毒DNA中的中心链不连续性，称作缺口，但最可能是中心链置换造成的切口(Harris等，1986)。因为许多慢病毒已描述了不依赖有丝分裂的复制(Gartner等，1986;Thormar，1963)，所以这里对HIV-1所描述的DNA三链体在向核输入中的作用可推及所有慢病毒。不受限制地，本发明提供中心DNA三链体在HIV-1向核输入中作用的机制假说如下充当向核输入顺式决定因子的三链DNA结构是一种没有已知的细胞或病毒对应物的新生物学现象.因此，说明中心DNA三链体在HIV向核输入中的作用的任何分子机制假说都是推测的.中心三链体可能充当通过核孔的HIVDNA丝摄取起始的病毒决定因子。这可能通过DNA三链体与核孔成分的直接相互作用，或作为替代，通过三链体与在宿主细胞的胞质和核之间穿梭并可能牵引HIV基因组到核内的细胞或病毒蛋白质的相互作用来实现。在识别HIV-1DNA丝一端起始摄取后，9.7kbHIV基因组转运通过最大直径26nm的核孔必须以特定方向发生。信使RNA的核输出中出现类似的情形，在此，RNA丝摄取通过核孔是由5，帽子结构指导的(Hamm和Mattaj，1990)。尽管HIV-1PIC的构象尚不十分清楚，但已经证实的是，可能在与LTR顶端结合的整合酶蛋白质二聚化后，线性DNA的末端桥接在一起(Miller等，1997)。有趣的是，在所有慢病毒基因组中，在中心位置都发现cPPT和CS顺式作用序列。慢病毒PIC的一个合理结构是双DNA丝，通过整合酶二聚化在中心三链体的每一侧对称折叠(图6B)。然后三链体将构成丝状HIV-1PIC的一个端点，整合酶二聚体构成另一个端点。在cPPT突变体的PIC中，没有DNA三链体将导致它们不被核孔机器或穿梭蛋白质识别。鉴定中心DNA三链体的蛋白质配体将对于我们理解HIV-1PIC向核输入和最终开发靶向HIV复制的该步骤的药物十分重要.另一个解释三链体突变病毒的性质的机制假说涉及病毒DNA转运到核内之前HIV衣壳成熟为PIC中的缺陷。根据该模型，三链体缺陷的病毒DNA将被俘获为完整病毒衣壳，而不能转运.逆转录病毒的逆转录在被感染细胞细胞质中病毒成分高度稀释时不能发生，而需要逆转录复合物的结构环境，在这里病毒成分被限定在衣壳蛋白装置中。HIV衣壳大小超过核孔的排除直径(Dworetzky等，1998;Gelderblom,1991)。因此，病毒DNA能进入核之前，HIV逆转录复合物必须经过变为大小与转运通过核孔相适应的PIC的成熟过程(Karageorgos等，1993)。核转运之前病毒衣壳的成熟在一些其它病毒系统中已十分明确，在这些病毒系统中复制周期涉及DNA基因组转运通过宿主细胞的核膜(Whittaker和Helenius，1998).尽管对MLV而言在病毒衣壳内逆转录已经过物理学的证实(Bowerman等，1989),但这对于HIV-1还不可能，这可能是因为HIV-1衣壳的易脆性(Borroto-Esoda和Boone，1990)。HIV逆转录复合物包含许多拷贝的RT聚合酶(每个衣壳约30-50个)(Panet等，1975)。由于HIV-l逆转录酶的重要分布，酶与病毒RNA模板的高化学计量是在正链和负链合成及中心三链体的准确形成过程中克服许多逆转录限制步骤(如链转移或聚合中止)所必需的(Klarmann等，1993;Char廳u等，1994)。这强烈提示，慢病毒逆转录的最后事件一一中心终止，发生在完整衣壳结构内。标志病毒DNA合成结束的中心终止可能是病毒DNA去衣壳和随后转运到核内的必需信号。DNA三链体介导的HIV-1向核输入的这两个推测的分子机制不是相互排斥的。中心DNA三链体的形成可能触发病毒衣壳成熟为PIC，因此使DNA三链体可接近穿梭蛋白质。中心DNA三链体的完整性为HIV-1基因组进入宿主细胞核所必需的事实表明，DNA合成的整个过程，包括最后中心链置换事件，在HIVPIC转运通过核孔之前完成。慢病毒逆转录的亚细胞分布目前仍有争论，HIV复制是否在特定细胞区室内发生仍然是一个有待解决的问题。基于分级分离研究，已报道，HIV逆转录可完全在细胞核内发生(Bukrinsky等，1993a)。但是分级分离技术不能区分核内定位和与核膜相联。相反，另一些作者提出，逆转录复合物与细胞骨架相联是病毒DNA合成的前提(Bukrinhkaya等，1998)。HIV-1DNA合成的动力学研究和其与核组分相连表明，后一过程比前者快得多，逆转录单个周期的过程中HIV-1DNA的合成仅在感染后24-48小时到达平台，而95%以上的HIV-1DNA在早在感染后4-6小时与感染细胞的细胞核分级分离(Barbosa等，1994).因此，我们赞同第三种可能性，即慢病毒逆转录主要在核膜和NPC的紧靠附近、在病毒衣壳内发生，尽管需要进一步的实验证实该假说.细胞有丝分裂不提供三链体缺陷性病毒DNA进入宿主细胞核的替代途径。本发明实施例显示，中心三链体突变体病毒在非分裂细胞和分裂细胞中的复制能力都被强烈妨碍.相反，在基于HIV-l的栽体中插入DNA三链体序列刺激在分裂和非分裂细胞两者中的基因转导。这与已公开的MA/Vpr突变病毒的表型不同，在MA/Vpr突变病毒中复制缺陷只描述于非分裂细胞中(Bukringsky等，1993b;Heinzinger等，1994;vonSchwedler等，1994)。因此，MA/Vpr病毒突变体的行为类似有丝分裂依赖性胂瘤病毒。中心三链体突变体不同行为的一个可能解释是，这些病毒在向核输入过程的一个晚期步骤中有缺陷，结果，三链体缺陷性DNA分子与核膜相连。这种密切相连在有丝分裂过程中一直持续。突变病毒DNA可能被捕获于有丝分裂的核膜小泡内，这样它就不能达到细胞染色体，例如对NLS-LacZ蛋白所报道的情况(Bo匿rot等，1987)。然而，抑制与karyopherins相互作用的细胞NLS中的突变已知i秀导突变蛋白质的细胞质积累(Kalderon等，1984;Lanford和Butel，1984)。因此，正如先前所述的(Gulizia等，1994),有利于HIV-1PIC亲核特性的NLS序列中的突变应当诱导病毒DNA的细胞质滞留。因此，在有丝分裂过程中MA/Vpr突变病毒的PIC有可能在核膜破裂后到达细胞染色体.然而，慢病毒DNA基因组有丝分裂依赖性向核输入途径还没有直接证据。正如MA/Vpr突变病毒的公开表型必须谨慎看待一样，同样应谨慎看待慢病毒核转运缺陷应仅在非分裂细胞中导致复制缺陷的该起始假设。慢病毒是否能够采用有丝分裂依赖性核输入策略，或慢病毒基因组是否在分裂和非分裂细胞中均有主动核输入，仍是一个待研究的问题。本发明提供慢病毒载体的设计方案。由于慢病毒引起的非分裂把细胞感染依赖于它们对主动细胞核输入途径的使用，因此在衍生的载体结构中保留慢病毒向核输入决定因子是重要的。经典的逆转录载体结构是置换型载体，其中两个LTR之间的整个病毒编码序列被缺失并替换为目的序列，对于慢病毒，这种经典策略导致中间的顺式作用序列cPPT和CTS的缺失.该三链体在HIV向核输入中的重要作用提示这种置换型载体结构不是最佳的.因此，HIVDNA三链体在HRGFP置换型载体(Naldini等，1996)中的插入由于弥补了HR载体基因组的向核输入缺陷而增强了其基因转导效率，达到近似于野生型HIV-1的DNA转运率。值得一提的是，尽管缺少DNA三链体的HIV载体仍能够进行基因转导(图2C、2D)，但在cPPT中发生突变的病毒的残余复制等于零或极低(图6A、6B)。一个可能的解释是独立于三链体的向核输入可以发生在小载体基因组(对于HR-GFP,约4kb)上，但DNA三链体的存在对于9.7kb的天然HIV-1基因组的输入是必须的。实际上，活跃的，虽然相对低效的，3-4kb大小的DNA分子的向核输入已有报道(Hagstrom等，1997)。在所有慢病毒基因组的中央均发现了负责该DNA三链体形成的顺式作用序列。该中央位置可能基于其对于PIC构象的结构含义而进化，以致围绕该三链体的线性DNA分子的左臂和右臂的对称折叠可能是其通过NPC有效进入所必须的(图7B)。如果这对于病毒是对的话，那么该DNA三链体的中央位置也可能是载体基因组有效向核输入所要求的。实施例本发明将通过以下实施例进一步阐明，这些实施例旨在纯粹作为本发明的示例。实施例1:实验步骤细胞MT4细胞是HTLV-1转化的人CD4+T细胞，允许急性致细胞病变性HIV-1感染(Harada等，1985)。H9细胞不太适合HIV，但可在感染后进行慢性生产。MT4和H9细胞被维持在补加了10。/。胎牛血清(FCS)的RPML1640培养基中。从健康供体获得外周血淋巴细胞(PBLs)，用lfig/ml植物凝集素(Wellcome)刺激，并在白介素2(10%lymphocult;BiotestDiagnostics)存在下维持。293T细胞培养在补加10%FCS的DMEM培养基中.P4指示细胞是HIV可感染的HeLaCD4+细胞，带有处于HIV-1LTR控制下的LacZ基因(Charneau等，1994).P4细胞培养在补加10%FCS和500pg/mlG418的DMEM培养基中.细胞的收集和分级分离在母亲的知情同意下收集脐带血液样品。CD34+细胞按前人所述(Robin,C.等，1卯1)采风miniMACS免疫磁珠分离系统(MiltenyBiotec)纯化。磁珠分离的CD34+细胞的纯度大于75%。CD34+CD381o/-组分采用抗CD34-PE-Cy5(I咖unotech)和CD38-PE(BectonDickinson)的鼠源单克隆抗体(MoAbs)以及装配有氩离子激光的FACSVantageTM(BectonDickinson)通过细胞分拣进一步纯化。CD34+细胞在含有10%DMSO(Sig迈a)的胎牛血清(FCS,干细胞)中冻存，或立即使用。DNA结构前病毒质粒按前人所述(Kunkel,1985)在带有来自感染性分子克隆pLAI3的EcoRI1.lkb插入片段(4684-5779)的M13mpl8中进行定点诱变。诱变引物如下cPPT-AG5'pCAATTTTAAAAGAAGAGGGGGGATT3'(SEQIDNO:l)cPPT-D:5'pATTCATCCACAACTTCAAGCGCCGCGGTGGTATTGGGGGGTAC3'(SEQIDNO:2).通过将该突变的EcoRI片段克隆回pLAI3中构建pcPPT-AG、pcPPT-D、pcPPT-25和pCTS。栽体质粒载体质粒来源于HR，CMVLacZ(Naldini等，1996)。用EGFP基因(Clontech)替换该LacZ报道基西.EGFP基因采用Pfu聚合酶(Stratagene)从pEGFP-Nl质粒中通过PCR扩增，并分别在5，和3，末端加上BamHI和XhoI限制性位点.PCR引物如下B咖GFP:5'CCGGATCCCCACCGGTCGCCACC3'(SEQIDNO:3)XhoGFP:5'CCCTCGAGCTAGAGTCGCGGCCG3'(SEQIDNO:4).通过将该PCR片段克隆回pHR，CMVLacZ的BamHI和Xhol位点中，以EGFP替换该LacZ0RF，构建HRGFP栽体.TRIPAU3CMVGFP和TRIPAU3PLCMVGFP:首先，构建含有单一LTR的亚克隆，命名为pUCLTR,将TRIPGFP中包含其3，LTR的Kpnl/Xbal片段克隆至pUC18中。然后，通过补平破坏该EcoRI位点，产生载体pUCLTRRI-。为了扩增除U3序列的启动子和增强子之外的整个质粒，在pUCLTRRI-上进行背驰PCR。引物是DU3-:5'CGGAATTCGGATCCGCGGCCGCATCGATCTTGTCTTCGTTGGGAGTG3'(SEQIDNO:5)DU3+:5'CGGAATTCAGCCGTCTCGAGAGATGCTGCATATAAGCAGC3'(SEQIDNO:6).引物含有插入替代U3序列的限制性位点，其中包括存在于每个引物上的EcoRI位点。用EcoRI消化该PCR产物，然后用于转化感受态细菌。由此构建的质粒命名为pLTRAU3RI-。pLTRAU3RI-中插入替代U3序列的多聚接头是Clal-Notl-BamHI-EcoRI-MluI-XhoI。用pLTRAU3RI-的Kpnl/Xbal片段替代TRIPGFP中含有3'LTR的Kpnl/Nhel片段(Nhel和Xbal限杀U生产物是相容的)，构建TRIPAU3PLGFP质粒。然后通过Clal/Xhol消化和补平从pLTRAU3RI-中缺失该多聚接头(PL)。采用pLTRU3APLRI-的Kpnl/Xbal片段交换TRIPGFP的Kpnl/Nhel片段，构建TRIPAU3GFP质粒。PCR扩增pLAI3中包含cPPT和CTS的178bp片段(4793-4971)为了将该片段插入HRGFP的单一ClaI位点中，在引物的5，添加Narl限制性位点NarTRJP+:5'GTGGTCGGCGCCGAATTCACAAATGGCAGTATTCATCC3'(SEQIDNO:7)NarTRIP-:5'GTCGTCGGCGCCCCAAAGTGGATCTCTGCTGTCC3'(SEQIDNO:8)按正确方向插入该三链体序列产生TRIPGFP质粒载体，而相反方向插入产生TRIPinvGFP'或者，从pcPPT-AG、pcPPT-D、pcPPT-225和pCTS质粒扩增此相同的三链体片段，以产生在cPPT或CTS中含有与相应病毒相同突变的载体.TRIPEFlaGFP和TRIPAU3EFlaGFP:用EFla启动子替换TRIPGFP的CMV启动子。首先用部分重叠引物分别扩增该三链体和EF1a启动子.采用引物NarTRIP+和MluTRIP-在pLai基质上扩增三链体序列，并采用引物MluEFl+和BamEF1-在模板pEFpgkneo上扩增EFla启动子。NarTRJP+:5'GTCGTCGGCGCCGAATTCACAAATGGCAGTATTCATCC3'(SEQIDNO:9)—IDNO:10)MluEF1+:5'CTGATACGCGTCGTGAGGOTCCGGTG3'(SEQIDNO:11)BamEF1-:5'CGGGATCCTG丁GTTCTGGCGGCAAAC3'(SEQEDNO:12)然后采用外部引物NarTRIP+和BamEF1-,对头两次PCR产物的混合物进行二次PCR。通过该技术将三链体序列和EFla启动子粘结起来。用EcoRI/BamHI消化的PCR产物TRIPEFla(NarTRIP+引物在其5，末端中具有EcoRI位点)替换含有三链体序列和CMV启动子的TRIPGFP的EcoRI/BamHI片段，构建质粒TRIPEFlaGFP。为了构建TRIPAU3EFlaGFP质粒，将含有三链体和EFla启动子的TRIPEFlaGFP的EcoRI/BamHI片段插入TRIPAU3GFP中，替换含有三链体序列和CMV启动子的EcoRI/BamHI片段。病毒和载体制备对于图1-6中报道的研究，通过磷酸钙共沉淀技术瞬时转染HeLa细胞产生病毒。按前人所述(Naldini等，1996)，通过用载体质粒和包装质粒(p8.2)及VSV包膜表达质粒(pHCMV-G,(Yee等，1994))瞬时共转染293T，产生载体颗粒，所有病毒和载体上清用DNasel(lug/ml,含有luMMgCl2)37X:处理15分钟。慢病毒颗粒制备对于图7-9报道的研究，按前人所述(Naldini等，1996)，通过用载体质粒、包装质粒(p8.2)和VSV包膜表达质粒(pHCMV-G，(Yee等，1994))瞬时共转染293T,制备病毒。所有的病毒和载体上清液用DNasel(ljig/ml,含有ljiMMgCl2)37K处理15分钟.病毒和载体滴定对于图1-6报道的研究，采用等量颗粒(每孔lngp24病毒抗原)，在存在20pMDEAE葡聚糖时，通过感染接种在96孔板中的P4细胞，重复三次进行一个周期的病毒滴定。在整个实验过程中加入蛋白酶抑制剂Saquinavir(Roche)(lpM)，以将分析限制于单个的感染周期。在感染前一天，通过蚜栖菌素(8nM)处理抑制细胞有丝分裂。感染后48小时采用化学发光(5-Gal报道基因测试(Boehringer)测量(3半乳糖芬酶活性。用等量载体颗粒(每孔5ngP24)感染HeLa细胞，重复三次。在转导后的48小时，用200^1TNB(Tris50mMpH7.5，NaCl150mM)代替培养基，并采用微滴定板荧光计(Victor2,Wallac)和EGFP适应的滤波器(激发485nm，发射520nm)定量生活细胞的荧光。转导步骤对于图7-9报道的研究，根据厂家说明书用纤连蛋白(Bio-WhittakerEurope)包被24孑L或96孑L纟且纟只培养板。将人CD34+群体在纯化或融解后按2-3xl(f细胞/ml立即接种在无血清培养基(含有11.5jiMa-硫代甘油、1.5%BSA(两者均来自Sigma)、经超声的脂质和铁饱和的人转铁蛋白的IMDM)或含有10%FCS的a-MEM中，其中还存在4ng/mlpolybrene(Sigma)和4种重组(r)人(hu)细胞因子rhu-干细胞因子(SCF，100ng/ml，Amgen提供)、Flt3-配体(FL，100ng/ml，Diaclone)、IL-3(60ng/ml，Sandoz)、和聚乙二醇化(PEG-)rhu-巨细胞生长和分化因子(MGDF)(10ng/ml，Amgen)，以及100ng病毒P24/ml浓度的浓缩慢病毒，维持24小时。然后洗涤细胞，并在淋巴-骨髓条件(lympho-myeloidconditions)中培养48小时(在补加了10%人血清、5%FCS和下列7种细胞因子的RPMI中用MS5细胞预先包被组织培养板rhu-SCF(50ng/ml)、rhu-FL(50ng/ml)、PEG-rhu-MGDF(50ng/ml)、rhu-IL-3(10ng/ml)、rhu-IL-2(5ng/ml)、rhu-IL-15(10ng/ml)、和rhuIL-7(20ng/ml)(这三种IL来自Diaclone))。然后，采用CD34-PE-Cy5MoAb(Immunotech)评价CD34+细胞组分中的eGFP表达。采用Cellquest软件(BectonDickinson)在FACSScan上进行分析。克隆发生和长期培养(LTC)测定在含有30%FCS、1%去离子BSA、和10-4M2-巯基乙醇的0.8%甲基纤维素中，在存在50ng/mlrhu-SCF、10ng/mlrhu-GCSF(Amgen)、2ng/mlrhu—IL3矛口2U/mlrhu—EP0(Amersham)时，测定来自人新鲜CB细胞的克隆发生祖先细胞。按前人所述(PflumioF等，1996)，在存在rhu-SCF、-IL-3、-EPO、和-GM-CSF(10ng/ml)时，接种来自移植的NOD-SCID小鼠的骨髓(BM)细胞。根据已描述的标准(CroisilleL等，1994)在第14-16天对祖先细胞评分，并采用NikonEclipseTE300显微镜通过荧光显微术观察EGFP表达。按前人所述(IssaadC.等，1993),采用配有ACDU(BD)的FACSvantage在96孔板的有限稀释物中，或在含有鼠基质细胞系MS5汇合细胞层的24孔板的大量培养物中，进行长期培养(LTC)。5-10周后，收获粘着和非粘着细胞并接种用于克隆发生测定。对于克隆发生和LTC-IC测定，单独地分别挑取集落并在PCR分析前冻存。PCR分析从来源于克隆发生祖先细胞的集落或培养在淋巴骨髓培养物中的克隆获得基因组DNA，对其进行PCR分析。裂解细胞并在含有蛋白酶K(10jig/ml)、KC1(50mM)、Tris-HCl(10mM，pH8.3)、MgCl2(2,5mM)、明胶(O.lmg/ml)、NP40(0.45%)、和Tween20(0.45%)的20fil緩冲液中消化蛋白质。采用有义引物5，CCCTCGAGCTAGAGTCGCGGCCG3，(SEQIDNO:13)和反义引物5，CCGGATCCCCACCGGTCGCCACC3，(SEQIDNO:14)，以62t:的退火温度进行基因组DNA的扩增。扩增产生一800bp产物。病毒和载体DNA分析以高复数病毒(每106个细胞150ngp24)感染P4或MT4细胞，或用载体(每106个细胞25ngp24)进行转导，对于P4细胞还存在20fig/mlDEAE葡聚糖。在各种时间抽提来自感染或转导细胞的DNA，并作限制性分析和Southern印迹分析。在所有的情况下，通过DpnI消化从分析中除去污染的细菌质粒DNA。来自感染细胞的DNA通过Mscl和Xhol进行消化，而采用EcoNI、Avail和Xhol消化来自转导细胞的DNA。10jig消化DNA电泳和转移后，采用随机引发「P]标记DNA探针(RediprimeII，Amersham)对膜进行杂交。采用下列引物从pLAI3质粒模板PCR扩增病毒特异性DNA探针5Msc:5'AGAAGAAATGATGACAGCATG3'(SEQIDNO:15)3Msc:5'TGCCAGTTCTAGCTCTG3'(SEQIDNO:16).所获1680bpDNA片段(pLAI3的第1818-3498位)与病毒基因组第2655位Mscl限制性位点部分重叠。采用以下引物在pTRIPGFP上通过PCR合成载体探针5EcoNI:5'CAGGGACTTGAAAGCGAAAG3'(SEQIDNO:17)3EcoNl:5'GCTTGTGTAATTGTTAATTTCTCTGTC3'(SEQIDNO:18)载体探针是一个1027bp片段(pTRIPGFP第649-1676位)，与载体基因組第1156位EcoNI位点部分重叠。为了测定来自野生型和PPT-AG及cPPT-D病毒的逆转录DNA的量，进行类似的程度，不同的是用Mscl和DpnI消化感染后第12小时提取的DNA。杂交用的探针是pLAI3的Mscl1.9kb内部片段。杂交信号用磷光成像仪(MolecularDynamics)和ImageQuant软件定量。原位杂交以高复数(对于所有病毒均是每106个细胞2jigp24抗原)，在存在20fig/mlDEAE葡聚糖的情况下，感染P4细胞'在感染后24小时，胰蛋白酶消化细胞，充分洗涤(以便除去吸附在质膜中的病毒颗粒)，然后重新接种在24孔板中的盖玻片上。再培养细胞48小时，并室温在4。/。PFA/PBS固定20分钟.在PBS中洗涤细胞，并室温以PBS中的0.5%Triton/0.5%Saponin进行透化处理5分钟，用RNaseA(2xSSC中200jig/ml)处理脱水样品1小时，然后用蛋白酶K(PBS中6pg/ml)处理约5分钟。70。/。去离子甲酰胺/2xSSC70X:孵育2分钟，之后30。/。去离子甲酰胺/2xSSC70X:終育2分钟，使样品变性.采用切刻平移生物素化的pLAI3质粒，37X:过夜杂交(2xSSC中50%去离子甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、10ng/ml鲑精DNA、0.1%Tween20)。充分洗涤样品(在2xSSC/50X甲酰胺中室温然后50"作系列洗涤)。采用酪胺-链霉亲和素TSA-Direct试剂盒(NEN)根据厂家说明检测杂交的探针。实施例2:逆转录的中心起始是HIV-1复制周期的必需步骤在以前的工作中，我们显示了cPPT和CTS序列中的保守性突变严重地损害了病毒复制(Char腿u等，1992;Hung腦等，1992)。中心起始突变病毒(cPPT-225)和终止突变病毒(CTS)在一轮滴定实验中分别表现出4倍和IO倍的感染性降低。为了灭活cPPT的功能，在重叠的整合酶编码区域中引入半保守性突变。在突变病毒cPPT-D中，第188位赖氨酸到精氨酸的改变使得在PPT引物的19个核苷酸序列中引入总共10个突变(图1A)(Huber和Richardson,1990)。通过构建对照cPPT-AG突变病毒，检查该氨基酸改变对病毒复制的影响，在此对照突变病毒中嘌呤向嘌呤的单个突变，对于cPPT的多嘌呤性质而言，诱导相同的氨基酸改变。DNA三链体在逆转录野生型和cPPT-AG病毒DNA中的存在、以及在cPPT-D病毒DNA中的缺失，按照前人所述(Harris等，1981;Charneau和Clavel,1991)通过SI核酸酶切割来自感染细胞的HirtDNA进行验证。首先在经典动力学复制实验中采用细胞培养物评价病毒的感染性。用等量病毒颗粒感染PHA刺激的外周血淋巴细胞(PBLs)和MT4细胞，根据病毒上清液的衣壳蛋白(p24)含量进行标化，并在该培养物上清液中持续跟踪逆转录酶的活性一段时间(图IB)。在两种细胞系统中野生型HIV-1LAI和cPPT-AG对照病毒的生长曲线是相似的.K188R突变自然发生在一些HIV-1分离抹中，这一事实已经提示它对于整合酶和PPT功能几乎没有或没有影响.相反，当用cPPT-D突变病毒感染PBL时，在培养的15天内没有检测到复制.MT4细胞也是同样的，尽管它们对HIV感染高度敏感.cPPT-D突变病毒在永生化细胞系如H9或CEM中也是非感染性的(资料未显示)。然后通过基于单轮复制的滴定定量分析病毒感染性(图1C)。用同等量不同病毒的病毒颗粒感染P4指示细胞(HeLaCD4LTR-LacZ)(Charneau等，1994)。这些一周期滴定证实cPPT-D突变病毒几乎完全丧失感染性。在P4细胞中，cPPT-AG对照的感染性与野生型病毒的感染性一致，而cPPT-D突变体的感染性极大地降低至接近背景的水平。在蚜栖菌素处理的非分裂P4细胞中获得了相同结果(图1C，右图)。这些结果有力地提示，逆转录的中心起始是HIV在非分裂以及增殖细胞中复制所必需的。实施例3:cPPT中的突变不影响病毒生产我们检查到在cPPT-AG和cPPT-D质粒前病毒中引入的不同突变不影响复制周期的后期步骤。在HeLa细胞被前病毒质粒瞬时转染后，根据上清液中的P24含量，定量病毒的生产。cPPT突变病毒的生产被发现与野生型病毒的生产没有显著不同(图2A)。因此突变K188R没有影响HIV-1复制的晚期阶段。这样，cPPT-D突变病毒表型涉及的缺陷步骤必定早于病毒DNA的表达并属于HIV复制周期的早期阶段。实施例4:cPPT中的突变不影响HIV-1基因組的逆转录速率通过量化单轮逆转录中合成的DNA，评价cPPT中突变对病毒DNA合成的影响(图2B)。采用相应的MscIDNA片段作为探针，通过Southern印迹检测来自感染细胞的病毒DNA的内部MscI限制性片段并量化.由于该内部MscI片段对于整合的前病毒DNA和未整合的线性和环状分子是共同的，因此不管是整合还是未整合状态，它的定量都反映了病毒DNA的总量。为了将该分析限制于单周期逆转录，感染后12小时，再次感染周期起始前，从感染的P4细胞收获DNA.在单个周期的逆转录中逆转录的DNA总量在用cPPT-D突变体、cPPT-AG对照或野生型病毒感染后是相同的.这些实验说明，尽管cPPT中的突变造成病毒复制流产，但它们不影响DNA合成的速率。cPPT突变病毒的复制缺陷涉及病毒DNA合成的后续步骤。实施例5:缺少中心DNA三链体不影响HIV-1PIC的体外整合按Farnet所述(Farnet和Haseltine，1990)，稍加改动，在定量性体外整合测定中比较野生型HIV-1和中心起始突变体的PIC的体外整合能力(图2C)。由于HIV-1复制复合物仅瞬时存在于刚感染细胞的细胞质中(Barbosa等，1994)，制备足量的HIVPIC需要大量感染和4-6小时的细胞分级分离。这是通过共培养慢性感染了野生型或cPPT-225病毒的H9细胞和未感染的HUT78耙细胞来实现的。代替不能建立慢性感染的非感染性cPPT-D，cPPT-0225突变病毒(图1A)被选择用于这些实验。cPPT-225突变病毒的残余感染性低，但足于允许它在细胞培养物中緩慢增殖(Charneau等，1992)。从感染细胞的细胞质中分离HIVPIC,并在线性化Bluescript质粒靶DNA存在时进行孵育。对HIV-1探针有反应性的12.7kb片段(相应于中间整合了3kb靶DNA的9.7kb线性HIV基因组的预期大小)反映了整合的发生.整合在质粒DNA中的线性DNA的量在野生型和cPPT225突变病毒之间没有区别(图2C).因此，来自cPPT突变体的HIV-1PIC保留了其体外整合的全部能力。中心DNA三链体突变病毒的缺陷性复制步骤必定发生在逆转录之后但在线性HIV基因组整合至宿主细胞染色质中之前.实施例6:中心DNA三链体突变病毒的减弱的向核输入前述实验提示，中心DNA三链体突变病毒的复制缺陷与HIVPIC到达细胞靶标染色质有关.因此，我们测试了cPPT突变病毒DM的向核输入缺陷的假说.缺乏在病毒DNA水平上对向核输入的定量和可重复的分析妨碍了对HIV-1PIC向核输入的研究.一旦在细胞质中逆转录，逆转录病毒线性DNA即输入到核内，在核内它要么整合，要么环化。含有一个或两个LTR的非整合逆转录DNA环仅在核内发现，因而代表了病毒DNA向核输入的方便的标志。为了评价HIVDNA向核输入，以前的研究使用两个非整合LTRDNA环的PCR扩增。然而，正如本文和Barbosa等(1994)报道的，因为两个LTR的环代表被感染细胞中HIVDNA的很少一部分，所以它们的检测对于细胞生理或病毒感染性的较小改变十分敏感。因此，我们设计了一种新的测定方法，其允许通过Southern印迹对HIV-DNA合成、环化和整合进行定量跟踪。简而言之，在多个时间点从感染细胞制备DNA，用切割HIV-1基因组两次的限制酶MscI消化。^使用刚好重叠该5，MscI位点的PCR产生的DNA探针，揭示了几个特异的条带(图3A)。内部1.9kbMscI片段是所有病毒DNA种类共有的，无论其处于整合还是非整合状态，该条带的定量指示了感染细胞中病毒DNA的总量。2.6kb条带相应于非整合线性HIV-DNA的远端5，Mscl片段。为了使由于DNA环特异片段大小较大造成的转移偏差降低到最小，进一步用Xhol切割DNA。这样，一和两LTR的环状DNA分别出现在2.8和3.4kb。因为DNA探针刚好与5，Mscl位点重叠，所以每个条带的强度直接与相应病毒DNA种类的量成比例。整合的前病毒DNA的量通过从病毒DNA总量中减去非整合线性和环状病毒DNA的信号计算。在Hirt分级分离分开了低分子量非整合病毒DNA和高分子量整合前病毒DNA后，进行相同感染细胞群体的平行定量。这给出了相同的结果，因此证明一步减法计算是有效的。正如总病毒DNA(1.9kb内部条带)积累的动力学所表明的，病毒DNA合成在感染后进行24-48小时，反映了异步感染过程.cPPT-AG和cPPT-D突变病毒总病毒DNA的量与野生型HIV-1类似.正如先前的一样，cPPT中的突变不影响DNA合成速率.早在感染后6小时，细胞中就存在可检测量的全长非整合线性DNA(图3B).整合的前病毒和DNA环首先在感染后12小时检测到.整合和环化在再36小时后进行到完成.一个感染周期完成后，对于野生型病毒，约55。/。的病毒DNA整合到宿主细胞DNA中，约35%的环化成一个LTR的环，不到10%的小部分保持稳定的非整合线性DNA形式(图3C)。值得注意的是，尽管在感染后48小时可检测到，但两LTR的环状DNA仅以痕量存在。cPPT-AG对照病毒的DNA与野生型病毒的DNA的加工方式类似。对于cPPT-D突变病毒，细胞内病毒DNA模式有明显改变，非整合线性分子明显和持续积累。在感染后48小时，仅产生非常少量的一LTR环状DNA和整合的前病毒DNA，90%以上的cPPT-D突变DNA以非整合线性形式被阻断(图3C)。预期向核输入缺陷降低核病毒DNA种类(整合的前病毒和一或两LTR环)的比例，并同时增加非转移线性DNA分子的比例。因此，cPPT-D突变病毒的细胞内DNA分布图强烈说明病毒DNA向核输入的缺陷。实施例7:中心DNA三链体突变病毒的线性DNA在核膜附近积累为了进一步表征中心DNA三链体突变病毒的向核输入缺陷，我们研究了突变的线性DNA分子是否在特定亚细胞区室内积累的问题。向核输入过程可以分为两个主要阶段，核成分停靠在核膜上和其转移通过核孔复合物(NPC)。我们首先进行了被感染细胞的传统核/胞质分级分离，然后用Southern印迹检测病毒DNA。感染后24小时，所有病毒的全部病毒DNA都与被感染P4细胞的核相联(图4A),表明HIVDNA停靠核膜不被中心DNA三链体缺乏影响。为了证实中心三链体缺陷DNA分子在核膜积累，我们使用荧光原位杂交(FISH)直接显现HIV基因組的细胞内位置。P4细胞在一个周期的条件下被高复数感染，用全长HIV-l基因组探针杂交，并通过解巻积显徵镜(deconvolutionmicroscopy)观察，对于野生型病毒和cPPT-AG对照病毒，主要在核内发现特异斑点(图4B).因为FISH不能区分不同HIVDNA种类，所以这些核内病毒DNA分子可能是整合的前病毒或非整合的DNA环，一些稀少基因组与核膜相联，可能代表感染后相同时间用Southern印迹检测到的残余线性DNA.其它一些与质膜相联的点很可能来自含有部分逆转录基因组的膜吸附的缺陷颗粒(Lori等，1992)。相反，对于cPPT-D突变病毒，HIV基因组主要位于核膜处，并在核内几乎完全没有。由于Southern印迹DNA分布图表明几乎所有cPPT-DDNA都被阻断为线性形式，所以我们能推定，这些与核膜相联的HIV基因组是非整合的线性DNA分子。这种在感染细胞内直接观察病毒DNA分子证实，中心三链体突变体的病毒DNA与核膜相联。我们的FISH实验提示，cPPT突变病毒在其基因组转移通过NPC方面是缺陷性的。然而，通过突变病毒DNA定位于NPC胞质侧得到的转移缺陷的明确证明不可能通过FISH实验获得。总之，我们从这些结果得出结论，在逆转录过程中由中心起始和终止步骤产生的HIV-1的中心DNA三链体对于HIV-1PIC进入宿主细胞核而言是重要的。没有DNA三链体，病毒DNA向核输入在HIV-1DNA转移通过核孔之前即刻或过程中的一个阶段被严重削弱。实施例8:中心DNA三链体对基于HIV-1的载体系统的基因转导的影响鉴定了中心DNA三链体是HIV-1向核输入的关键决定因子后，我们测试了在前人描述的HRHIV-1载体(Naldini等，1996)中插入HIV-1的中心DNA三链体的影响(图5A)。为了监测基因转导，还插入编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因。含有DNA三链体序列的载体称为TRIPGFP。对照包括具有突变的cPPT或CTS和以反向无功能方向插入的野生型中心区域的类似结构(TRIPinvGFP)。DNA三链体在逆转录TRIPGFP载体DNA中的存在，以及在HRGFP、TRIPinvGFP和含有突变版本中心三链体序列的载体中的缺乏，通过从转导细胞分离的HirtDNA的SI核酸酶切割来证实。瞬时转染产生的载体颗粒数在转导前根据转染细胞上清中衣壳蛋白(p24)的水平、逆转录酶活性、和基因组载体RNA的量进行标化.获得了各种病毒的类似的生产，三个标化标准之间呈线性相关(数据未显示).因此，HIV-1基因组中心区域插入到HR载体中不影响基因组RNA壳体化的比率。以等价量的HR-GFP或TRIP-GFP载体颗粒转导分裂或非分裂(蚜栖菌素处理的)HeLa细胞，并通过荧光定量监测48小时后GFP的表达。由于融合载体颗粒直接递送GFP蛋白至耙细胞产生的GFP活性假转导这样计算用HIV-1RT抑制剂(1pMNevirapin，BoehringerIngelheim)处理过的细胞进行转导，并从荧光信号中减去该背景。由于载体上清中钙/磷酸DNA共沉淀引起的次级转染导致的非特异性荧光通过在转导前用DNaseI处理载体贮存液来消除。在这些条件下，在HIV载体中三链体序列的存在使GFP在HeLa细胞中的转导增加了10倍以上(图5B)。在其它耙细胞系如MT4或293T等中观察到基因转导的类似的增强(数据未显示)。如果三链体序列以相反方向插入(图5B)或在cPPT中突变(数据未显示)，则该效果丧失。实施例9:HIV-1载体中DNA三链体的存在增加载体基因组向核输入的比率到野生型水平然后希望确定，HIV载体中插入三链体序列诱导的GFP荧光增加是否是由于其对载体DNA向核输入的影响。为了回答这个问题，我们寸务改了细胞内病毒DNA的定量Southern印迹分析以适应载体系统.栽体转导细胞的DNA用EcoNI和Avail消化产生内部0.8kb片段，并用Xhol消化.使用刚好与EcoNI位点重叠的PCR产生的DNA探针，非整合线性栽体DNA、一和两LTRDNA环特异的信号预计分别在1.2kb、1.4kb和2kb。转导细胞后在各时间点分析载体DNA的加工。对于含有或缺乏DNA三链体的载体，转导细胞中合成的载体DNA的总量是可比较的(图5C).同样，以两种方向在HR载体中插入cPPT和CTS序列不影响其基因组逆转录的速率.磷光成象(phosphorimage)定量后，我们发现HR-GFP和TRIPinv-GFP载体(图5D)的DNA的细胞内命运与中心三链体缺陷病毒的DNA的细胞内命运非常类似，TRIP-GFP载体的DNA的命运与野生型HIV-1LAI病毒的DNA的命运相同(图3C)。DNA向核输入的缺陷在服-GFP和TRIPinv-GFP载体中明显。来自这些载体的DNA的细胞内命运的特征是，非整合线性分子的强烈积累，伴随少量整合的前病毒和一和两LTR环。这种DNA分布图使人强烈联想到cPPT-D突变病毒的分布。在转导细胞中载体DNA加工完成后，服-GFP和TRIPinv-GFP结构的DNA的70-80%保持为非整合线性分子形式，而仅10-15%为LTR环上的非整合型，5-10%为整合的前病毒。这种低而可检测量的整合载体DNA可解释用HR-GFP或TRIPinv-GFP载体获得的基因转导。该定量测定分4斤还显示HIVDNA的三链体序列以正确方向插入HR载体弥补了其向核输入缺陷，达到野生型水平。转导细胞中的TRIP-GFPDNA的最终状态与用野生型HIV-1病毒所观察到的类似50%或更多的载体DNA整合靶细胞的染色质，相当大一部分被环化，而很少分子保持非整合的线性DNA(比较图5D和3C)。相反，三链体序列插入到HR载体中内部CMV启动子上游不影响转录水平的GFP表达。这通过用pHR-GFP、pTRIP-GFP和pTRIPinv-GFP质粒转染HeLa细胞和荧光定量进行了检验(数据未显示)。从这些结果可以推断，用TRIP-GFP载体获得的GFP转导增加完全是由于三链体的存在对其向核输入的强烈刺激。实施例10:含有DNA三链体序列的HIV-1载体允许在造血干细胞中有效转移基因图7A和7B阐述了使用CD34+人脐带血细胞所作的两个成功转导实验的结果。它们显示，经过20或60小时的短转导程序后，分别有71.5%和大于90%的CD34+细胞强烈表达GFP报道蛋白，该表达反映了细胞的稳定转导，因为至少在相同比例上通过对从祖细胞来源的细胞集落提取的DNA进行PCR分析证实了病毒的整合，所述细胞集落是在克隆发生祖细胞分析中接种细胞后14天收集的.使用新鲜纯化的CD34+细胞或纯化后冷冻并在数周后解冻用于转导实验的相同CD34+细胞获得了相同的结果。我们还使用另一种造血干细胞来源，即在细胞因子刺激后经cytapheresis收集的外周血mobilized干细胞(PBMC)，获得了可比的转导效率。另外，或者在纯化后即刻或者在冷冻/解冻步骤后转导CD34+PBMC，获得了相同的结果。采用长期培养(LTC)和NOD-SCID种群恢复(repopulating)实验，我们显示，我们转化了具有淋巴-骨髓多潜能(multiplely即ho-myeloidpotentialities)和移植后4个月种群恢复NOD-SCID鼠骨髓能力的细胞。这些功能实验代表目前已有的评价人造血干细胞功能的最终实验。实施例11:在慢病毒载体中DNA三链体序列的存在强烈刺激向造血干细胞的基因转移图8中报道的剂量/反应实验(代表3个实验)被设计用于比较含有或缺乏DNA三链体序列的HIV-1载体在人造血干细胞中的转导效率。我们首先将获得的CD34+eGFP+细胞的百分数作为用于转导的载体浓度的函数作图(A),我们观察到，无论载体为何种剂量，TRIP+载体都比TRIP-载体更有效，对于每个载体500ng病毒P24/ml,分别有平均40±19%和15.4±12.5%的CD34+细胞是eGFP十的(n=3个实验)。用TRIP-GFP载体转导后获得的GFP+细胞的最终百分数比用HR-GFP载体转导后获得的结果增加4-6倍。当将荧光强度对病毒剂量作图时，两种载体之间效率的差别也很明显.TRIP-(HR-GFP)载体在剂量为100ngP24/ml时达到平台，而对于TRIP+载体，转导细胞中荧光强度随载体剂量的增加而增加.这可能反映了TRIP-载体整合前形式的向核输入的限制，以及用增加剂量的TRIP-GFP载^转导后每个细胞整合拷贝数增加。第三个闺合并了两个方面，并显示DNA三链体序列对人HSC中GFP荧光活性产生的影响.正如所显示的，在HIV载体中DNA三链体序列的存在诱导HSC中GFP生产增加IO倍以上.实施例12:—小部分整合拷贝的HIV载体基因组在人造血转导细胞中保持沉默有可能发生整合的转基因的失活。当用通过PCR分析整合慢病毒载体确定的转导祖先细胞来源的细胞集落的百分数来评价时，转移效率总是比用转导程序结束后48小时通过FACS分析确定的〔034+/60+细胞百分数评价时更好。这反映了由于其整合位点或在细胞增殖和分化时渐进和随机的前病毒失活出现了转录上失活的前病毒我们已观察到来自单个骨髓克隆发生祖先的集落，一些亚克隆可以是GFP光亮的，而其它是阴性的，反映了在该表现型均一的克隆祖先中整合转基因的随机转录失活。实施例13:含有U3区缺失版本的LTR和内部EFlct的HIV载体是转导造血干细胞的更有效系统在图9中，我们比较了包含DNA三链体序列的HIV-1来源的各种载体转导人脐带血CD34+细胞的能力。分析了缺失3，LTR大部分U3区域对GFP在CD34+细胞中转导和表达的影响。在CMV内部启动子或EFloc内部启动子(Kim等，1990)驱动GFP报道基因表达的条件下进行含完整HIV-1LTR或U3缺失版本的载体的比较。在用针对P24(衣壳蛋白)HIV-1抗原的市售ELISA分析(D叩ont)对载体贮藏液标化后，所有转导实验都使用相同浓度的载体颗粒(500ngP24/ml)。在24小时转导期后48小时(图9A)或120小时(图9B)进行流式细胞测定分析(FACS)。有趣的是，在所有情况下，在HIV-1载体中缺失LTR的U3区诱导了GFP阳性细胞百分数轻微增加。当在48小时分析时该增加为中等。此时，假转导机制可能负责小部分的GFP阳性细胞。假转导是通过融合逆转录病毒载体颗粒直接递送GFP蛋白到靶细胞，而不需逆转录病毒载体基因组的实际整合。用U3缺失版本HIV-1载体转导后GFP阳性百分数的增加在转导后120小时变得更显著(图9B).此时，用TRIP△U3-EFla-GFP载体转导后看到，与用含完整HIV-1LTR的等价载体获得的结果相比，GFP阳性相比百分数增加达两倍.更重要的是，HIV-1三链体载体中HIV-1LTR的U3区的缺失诱导了GFP报道蛋白的更好表达。对于U3缺失版本，当用FACS分析时转导的人HSC中荧光强度平均值总是比用含完整HIV-1LTR的栽体获得的相应值高3到5倍。无论CMV或EFla启动子用作HIV-l载体结构中的内部启动子，都观察到GFP表达的该增强。解释转导细胞中GFP蛋白表达增强的分子机制还不清楚。HIV-1LTR中一些序列可能对内部启动子驱动的表达有负影响。或者，HIV-1LTR起始的基础转录可能干扰内部启动子处转录的起始。该研究还显示，在人HSC中EFlot启动子是比CMV启动子更好的启动子。在图9B中，对于EFla启动子，GFP荧光强度平均值比CMV启动子相应值好3到5倍。本领域技术人员将明了，在本发明的实施中可以进行各种修改和改变，而不脱离本发明的范围或精神。本发明还公开了以下内容1.分离的或纯化的核酸，含有至少一个拷贝的逆转录病毒cPPT和CTS顺式作用区域，其中该cPPT和CTS区域诱导三链DNA结构。2.项目l的核酸，其中逆转录病毒是慢病毒。3.项目2的核酸，其中逆转录病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。4.项目3的核酸，其中HIV是HIV-1或HIV-2。5.项目2的核酸，其中慢病毒是VISM、EIAV、FIV、或CAEV。6.项目1的核酸，其含有单个拷贝的逆转录病毒cPPT和CTS区域。7.项目1的核酸，其中三链结构含有逆转录病毒的cPPT和CTS顺式作用序列。8.项目1的核酸，还含有异源核酸序列。9.项目8的核酸，其中异源核酸序列编码肽、多肽、或蛋白质。10.项目9的核酸，其中异源核酸序列编码治疗性蛋白质。11.含有项目1的核酸的栽体。12.项目ll的载体，其是表达载体、穿梭载体、整合栽体、转座子、或逆转录转座子。13.项目ll的载体，其是pTRIPAU3EFlctGFP。14.含有项目ll的栽体的重组细胞。15.含有项目1的核酸的病毒。16.项目15的病毒，其是逆转录病毒。17.项目16的逆转录病毒，其是慢病毒。18.含有项目l的核酸的重組细胞。19.项目18的重组细胞，其中该细胞是HeLa细胞或造血细胞。20.项目19的重组细胞，其是造血干细胞。21.将目的核酸插入至耙细胞的核内的方法，所述方法包括在允许摄取目的核酸至靶细胞内的条件下将含有至少一个拷贝的逆转录病毒cPPT和CTS顺式作用区域的分离或纯化的核酸暴露给靶细胞，其中cPPT和CTS区域^秀导三链DNA结构。22.项目21的方法，其中核酸插入至靶细胞核内的效率是30%或更高。23.项目21的方法，其中目的核酸存在于载体上。24.项目21的方法，其中目的核酸含有异源核酸序列。25.项目22的方法，其中异源核酸编码肽、多肽、或蛋白质。26.项目25的方法，其中蛋白质是治疗性蛋白质。27.项目21的方法，其中靼细胞是非分裂细胞。28.项目21的方法，其中靶细胞是HeLa细胞或造血细胞。29.体外表达目的基因的方法，所述方法包括a)在允许摄取核酸至靶细胞内的条件下，将靶细胞暴露给含有目的基因和至少一个拷贝的逆转录病毒cPPT和CTS顺式作用区域的分离或纯化的核酸，其中cPPT和CTS区域诱导三链DNA结构，和b)在允许至少部分核酸转移至该重组细胞的细胞核和允许目的基因表达的条件下培养重组细胞。30.项目29的方法，其中核酸存在于载体上。31.项目29的方法，其中在組织培养物中表达目的基因。32.项目29的方法，还包括纯化或分离目的基因的表达产物。33.体内表达目的基因的方法，所述方法包括将含有项目10的核酸的重组细胞施用给个体，并允许重组细胞在该个体体内表达该核酸。34.项目33的方法，其中重組细胞是造血干细胞。35.体内表达目的基因的方法，所述方法包括给个体施用足以导致目的基因在该个体体内表达的量和形式的项目IO的核酸。36.项目35的方法，其中目的基因在靶组织中表达。37.项目35的方法，其中目的基因存在于逆转录病毒载体内。38.治疗患有，或很有可能发展，具有遗传基础的疾病或病症的个体的方法，所述方法包括给所述个体施用含有a)编码治疗性蛋白质的核酸和b)至少一个拷贝的逆转录病毒cPPT和CTS顺式作用区域的逆转录病毒载体，其中cPPT和CTS区域i秀导三链DNA结构，施用的逆转录病毒载体的量足以导致所述治疗性蛋白质以足以治疗所述疾病或病症的量表达。39.项目38的方法，其中所述治疗是预防性的、改善性的、或治疗性的。40.项目38的方法，其中该方法治疗血液疾病或病症、脑或神经系统疾病或病症、或发育疾病或病症。41.试剂盒，其包含至少一个含有分离或纯化的核酸的容器，所述核酸含有至少一个拷贝的逆转录病毒cPPT和CTS顺式作用区域，其中该cPPT和CTS区域诱导三链DNA结构。项目41的试剂盒，其中核酸还包含编码治疗性蛋白质的异源核酸序列。43.项目41的试剂盒，其中核酸存在于载体上。参考文献这里所引用的所用参考文献特此完整地引入作为参考。Barbosa,P"Charneau^P.，Dumey，N"andClavel，F.(1994).KineticanalysisofHIV-1earlyreplicarivestepsinacoculturesystem.AIDSResearch&HumanRetroviruses.53-59.Bonnerot，C'，Rocancourt^D.，BriandjP.，Grimber，G.，andNicolas，J.(1987).Abeta-galactosidasehybridproteintargetedtonucleiasamarkerfordevelopmentstudies.Proc.Natl.AcacLofSci.USA5<6795-9.Bonoto-Esoda，K，andBoone，L.(1991).EquineinfectiousanemiavirusandhumanimmunodeficiencyvirusDNAsynthesisinvitro:characterizationoftheendogenousreversetranscriptasereaction.JournalofVirology65，1952-1959.Bowerman，B.，Brown,P-，Bishop,J.，andVarmus,H、(1989).AnucleoprateincomplexmediatestheintegrationofretroviralDNA.GenesandDevelopment3，469-78.Bukrinskaya,A-，Brichacek^B.，Mann^A"andStevenson,M.(1998).Establishmentofafunctionalhumanimmunodeficiencyvirustype1(HIY-1)reversetranscriptioncomplexinvolvesthecytoskeleton.JournalofExperimentalMedicine〗SS，2113-25.Bukrinsky,ML，SharovN"Dempsey,M.P"Stanwick,T.L.，BukrinskayaA,G"Haggcrty,S"andStevenson^M,(1992).Activenuclearimportofhumanimmunodeficiencyvimstype1preintegrationcomplexes,ProcNatlAcadSci狄65806584.Bukrinsky,M"Sharova,N"McDonald^T"Pushkarskay^T.,Taipley,W"andStevcilsoiijM.(1993a),Associationofintegrase，matrix,andreversetranscriptaseantigensofhumanimmunodeficiencyvirustype1withviralnucleicacidsfollowingacuteinfection.Proc.Natl.Acad,ofSci.USA卯，6125-9.Bukrinsky,M.i.,Haggerty,S.,Dempsey,M.P.,Sharova,N"Adzhubel,A.，Spitz,L"Lewis,P"Goldfarb，D"Emenn叫M.andStevensonM(1993b).AnuclearlocalizationsignalwithinHIV-1matrixproteinthatgovernsi:ifectionofnon-dividingcells.Nature3(J，666~669.CaseSS.PriceMA.JordanCT.YuXJ.WangL.BauerG.HaasDL.XuD.StripeckeR.NaldidL.KohnDB.CrooksGM.StabletransductionofquiescentCD34(+)CD38(-)humanhematopoieticcellsbyHIV-l-basedlentivira]vectors.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.96(6):2988-93，1999.Chanieau，P.,andClavel,F.(1991).Asingle-strandedgapinhumanimmunodeficiencyvirus■unintegratedlinearDNAdefinedbyacentralcopyofthepolypurinetract.JournalofVirologyChameau^P.，AlizorijM"andClavel,F.(1992).Asecondoriginofplusstrandsynthesisis■requiredforoptimalHTVreplication.JournalofVirology66,2814*2820.ChameaAP.，Mirambeau,G"Roux^P"Paulous，S"Buc,H"andClavel,F.(1994).HTVMreversetranscription:aterminationstepatthecenterofthegenome.JournalofMolecularBiology2仏651-662.Croisille,L.etal.(1994).Hydrocortisonedifferentiallyaffectstheabilityofmurinestromalcellsandhumanmairow^derivedadherentcellstopromotethedifferentiationofCd34++/CD38-long-termculture-initiatingcells.Blood84:4116~4124.Dworetzky,S.，Lanford^R_，andFeldherr，C.(1988).Theeffectsofvariationsinthenumberandsequenceoftargetingsignalsonnuclearuptake.JournalofCellBiology/07,1279-S7.Emerman,M.,Bukrioski，M.，andStevenson,M.(1994).HTV-Iinfectionofnon-dividingcells,replytoFreedEOandMartinMA.Nature3眠108.Evans"a/.，(June10,1999).HumGeneTherapy/0(9):1479-89.Farnet,C.，and—HaseltineiW，(1990).Integrationofhumanimmunodeficiencyvirustype1DNAinvitro.Proc.Natl.AcadofSci.USAS7,4164>8.Fouchier,R_A.,Meyer,B.E.，Simon^J.H.Fischer,U.,andMaiim，M.H.(1997).脂-linfectionofnonnlividingcells:evidencethattheamino-terminalbasicregionoftheviralmatrixproteinisimportantforGagprocessingbutnotforpost-eptrynuclearimport.EMBOJournal仏4531-4539.Freed,E.0"andMartin,M.A.(1994).HTV-linfectionofnon-dividingcells,/towreJ眠10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，其含有一个拷贝的cPPT-CTS顺式作用区域、在EFlct启动子控制下的GFP报告基因、和除去了其启动子和增强子的LTR的U3序列，且其是pTRIPAU3EFlccGFP。14.权利要求12的载体，其中所述异源核*列编码治疗性蛋白质。15.含有权利要求1至14中任意一项的载体的重组细胞。16.权利要求15的重组细胞，其中所述细胞是HeLa细胞或造血细胞。>17.权利要求15的重组细胞，其是造血干细胞。18.体外增加异源核酸序列向靶细胞核输入的比率的方法，所述方法包括在允许摄取所述载体至所述靶细胞中的条件下暴露权利要求1至14中任意一项的栽体。19.权利要求18的方法，其中所述异源核酸序列被输入到多于30%的宿主细胞，优选多于50%的宿主细胞，及更优选多于80%的宿主细月包的冲亥内。20.权利要求18至19中任意一项的方法，其中所述异源核酸序列编码肽、多肽或蛋白质。21.权利要求20的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。22.权利要求18至21中任意一项的方法，其中所述靶细胞是分裂细胞或非分裂细胞。23.权利要求18至21中任意一项的方法，其中所述靶细胞是HeLa细月包或造血细胞。24.权利要求18至21中任意一项的方法，其中所述靶细胞是造血干细l包。25.体外表达异源核酸序列的方法，所述方法包括a)在如下条件下将靶细胞暴露给权利要求1至14中任意一项的载体，所述条件允许摄取所述含有异源核酸序列的载体至靶细胞中，以产生重组细胞，及b)在表达异源核酸序列的条件下培养所述重组细胞。26.权利要求25的方法，其中所述异源核酸序列在组织培养中表达。27.权利要求25至26中任意一项的方法，还包括纯化或分离所述异源核酸序列的表达产物。28.含有权利要求1至14中任意一项的栽体的重组细胞在生产使所述重组细胞能在个体体内表达异源核酸序列的治疗性化合物中的应用。29.权利要求28的应用，其中所述细胞是造血干细胞。30.权利要求1至14中任意一项的载体在生产治疗性化合物中的应用，其中所述异源核^列取足以导致所述目的基因在个体体内表达的量和形式。31.权利要求30的应用，其特征在于所述异源核酸在靶组织中表达。32.权利要求1至14中任意一项的载体在生产用于治疗患有、或很有可能发展具有遗传基础的疾病或病症的个体的药物中的应用，其中所述载体的量足以导致所述异源核酸表达，所述异源核酸表达的量足以治疗所述疾病或病症。33.权利要求32在生产用于预防性治疗、改善性治疗或治愈性治疗的药物中的应用。34.权利要求33应用，用于治疗血液疾病或病症、脑或神经系统疾病或病症、或发育性疾病或病症。35.试剂盒，其含有至少一个含有权利要求1至14中任意一项的载体的容器。36.权利要求35的试剂盒，其中所述异源核酸序列编码治疗性蛋白质。全文摘要本发明提供含有三链体结构，如那些由在HIV-1线性DNA基因组中心处HIV-1逆转录的中心起始和终止产生的三链体结构，的核酸、载体、病毒和重组细胞。这些三链体结构可充当HIV-1DNA向核输入的顺式决定因子，允许感染非分裂靶细胞。一方面，在HIV载体中存在DNA三链体序列强烈刺激在造血干细胞中的基因转移。本发明还提供使用这些三链体结构制备重组细胞的方法，以及使用这些重组细胞体内和体外表达目的蛋白的方法。文档编号A61K31/7088GK101363029SQ20081021383公开日2009年2月11日申请日期2000年10月10日优先权日1999年10月12日发明者A·司尔温,库皮尔施密特A·杜巴特,F·皮弗鲁米欧,P·查尼奥,V·赞诺申请人:巴斯德研究所;国家健康医学研究所