来源于大豆的根特异性启动子GmTIPp-253及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种来源于大豆的根特异性启动子GmTIPp-253及其应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是基因的组成部分，控制基因表达的起始和表达程度。在转基因育种中，夕卜 源基因在植物体中的精确调控主要是通过合适的启动子实现的。目前，在基因工程中广泛 使用的是组成型启动子，但是由于组成型启动子驱使目的基因在植物组织中的表达是恒定 和持续的，不受时空和外界因素的限制，会过度消耗细胞内的物质和能量，产生大量异源蛋 白质或代谢产物，破坏了植物原有的生理代谢平衡，导致植物生长异常甚至死亡。与组成型 启动子相比，根特异性启动子它所驱动的外源基因在受体植物根中表达，克服了组成型启 动子由于持续、高效的启动外源基因非特异性表达而造成的细胞物质的过度消耗。随着转 基因植物安全标准的提高，包括所有商业化转基因农作物在内，要求必须对所用启动子的 表达活性、潜在重组能力、对周边环境以及安全性影响进行详细的研究。
[0003] 大豆是一种重要的粮油饲兼用作物，在我国大豆产区大多处于干旱、盐碱及高寒 等区域，应用的大豆品种耐逆性不强，严重的旱涝病虫害等非生物和生物逆境胁迫显著影 响大豆产量。目前在转基因大豆中使用的都是CaMV35S启动子，根特异启动子应用到大豆 转基因中，为大豆转基因研究提供更加丰富的启动子元件，同时也为培育耐旱、耐盐、耐冷 等转基因大豆新品种提供一种手段。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。
[0005] 本发明所提供的具有启动子功能的DNA分子，来源于豆科大豆属栽培大豆 (Glycine max (L. )Merr· ) Williams82,是下述 a) -c)中任一 DNA 片段：
[0006] a)至少含有序列表中序列2的第1802-2054位核苷酸序列，并且从序列2的第 1082位开始按照序列2的核苷酸序列向序列2的5'端延长，得到长度为253至1201bp的 任意一个DNA片段；
[0007] b)与a)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；
[0008] c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片 段。
[0009] 上述严格条件可为在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1%SDS 和 I X SSC，(λ 1%SDS 各洗膜一次。
[0010] 所述启动子的最后一位核苷酸是序列2的第2054位。
[0011] 在本发明中，所述具有启动子功能的DNA分子为序列表中序列2的第1802-2054 位核苷酸所示的DNA分子，命名为GmTIPp-253。
[0012] 其中，序列2由2054个核苷酸组成，为序列1的第1-2054位。
[0013] 含有所述DNA分子(启动子)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本 发明的保护范围。
[0014] 在本发明中，所述重组载体为在PC13P1载体的多克隆位点(如Kpn I和Pst I )插 入所述DNA分子得到的重组质粒。
[0015] 所述pC13Pl载体是以pCAMBIA1301载体为基础改造得到的环形载体，所述pC13Pl 载体上不含有任何启动子的序列，用来满足研究启动子功能的需要。
[0016] 具体而言,所述PC13P1载体的序列如序列表中序列3所示。
[0017] 所述表达盒可以由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的 目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所 述目的基因与所述转录终止序列连接。
[0018] 在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为⑶S基因（来源于所述pC13Pl载 体）；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子(来源于所述pC13Pl载体)。
[0019] 所述DNA分子在植物中启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。
[0020] 在所述应用中，所述表达为根特异性表达。
[0021] 进一步，所述根特异性表达为根中高表达，具体为根中的表达量显著高于其他组 织(如叶柄、叶片主脉、花、果荚外壳)，在其他组织中表达量极低。
[0022] 在所述应用中，所述目的基因可为GUS基因。所述植物可为双子叶植物或单子叶 植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥或大豆。
[0023] 在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥（Arabidopsis thaliana(L.) Heynh. ) Columbia。
[0024] 另外，扩增所述DNA分子(启动子）的引物对也属于本发明的保护范围。
[0025] 在本发明中，扩增所述DNA分子(启动子）的引物对为如下：
[0026] 5' -GGTACCCTGAAAAGAGTATACTAAGG-3'；
[0027] 5' -CTGCAGTTTGGCACCTCACCTCAC-3'。
[0028] 实验证明，本发明所提供的GmTIPp-253启动子能够有效启动目的基因在根中的 特异性表达。本发明为植物在根部的分子改良提供了一种手段，对植株的抗逆研究就有一 定意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
【附图说明】
[0029] 图1为第一轮PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。箭头所示为目的条带。
[0030] 图2为第二轮PCR产物GmTIPp-2054的琼脂糖凝胶电泳图。箭头所示为目的条带。
[0031] 图3为GmTIPp-1201和GmTIPp-253启动子的PCR检测结果。其中，泳道M为 DL2000plus的DNA分子量标准；泳道1、2分别为用引物对F-1201/R和F-253/R进行PCR扩 增所得的PCR产物的电泳图。
[0032] 图 4 为重组质粒 pMD18-GmTIPp-1201 和 pMD18-GmTIPp-253,以及 pC13Pl 载体的 Kpn I和Pst I双酶切电泳图。其中，泳道M为DL2000plus的DNA分子量标准；泳道1、2、 3 分别为 pMD18-GmTIPp-1201、pMD18-GmTIPp-253 和 pPC13Pl。
[0033] 图5为pC13Pl载体的质粒图谱。
[0034] 图6为pC13 (Delta)⑶S载体的质粒图谱。
[0035] 图7为转基因拟南芥T1代的分子检测结果。其中，A、B分别代表转 pCAM-TIPp-1201、pCAM-TIPp-253拟南芥植株检测结果。A和B中，泳道M为DL2000plus的 DNA分子量标准；泳道CK+为阳性对照；泳道CK-为阴性对照；其他泳道分别为不同转基因 株系，有目的条带(箭头所示位置）出现的为阳性。
[0036] 图8为转基因拟南芥T3代的营养生长阶段不同发育时期GUS染色结果。
[0037] 图9为转基因拟南芥T3代的生殖生长阶段不同发育时期⑶S染色结果。
[0038] 图10为转基因拟南芥T3代的植株根和叶中的GUS活性定量测定结果。其中， WT表示未转基因的野生型拟南芥Columbia ;T1201-3、T1201-10、T1201-64是三株鉴定阳 性的转pCAM-TIPp-1201拟南芥植株；Τ253-17、Τ253-21、Τ253-43是三株鉴定阳性的转 pCAM-TIPp-253拟南芥植株。
【具体实施方式】
[0039] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0041] 下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的 引物合成及测序工作均由华大公司完成。
[0042] 栽培大豆（Glycine max(L. )Merr. ) Williams82 :记载于"许硕·野生大豆盐胁迫 相关microRNA的功能分析.2011年中国农业科学院硕士论文"一文，由中国农业科学院作 物科学研究所供给。
[0043] pC13Pl载体和pC13 (Delta)⑶S载体：均为环形载体，由中国科学院亚热带农业 生态研究所Pedro S. C. F. Rocha研究员提供。pC13Pl载体上不含有任何启动子，但含有⑶S 报告基因(如图5) ;pC13 (Delta)⑶S载体不含有⑶S基因，但含有卡那霉素抗性和潮霉素 抗性(如图6)。pC13Pl载体的序列如序列表中序列3所示；pC13 (Delta)⑶S载体的序列 如序列表中序列4所示。
[0044] 拟南芥（Arabidopsis thaliana(L. )Heynh. ) Columbia :记载于"郭晓 丽.Columbia型拟南芥愈伤组织培养研究.河南农业科学，2009年01期"一文，由中国农 业科学院作物科学研究所供给。
[0045] 根癌农杆菌GV3101 :记载于"赵湛，李文生.不同根癌农杆菌菌株类型对木霉菌 遗传转化效率的影响.北方园艺，2006年03期" 一文，由中国农业科学院作物科学研究所 供给。
[0046] 实施例1、GmTIPp全长启动子的克隆及序列测定
[0047] 以栽培大豆（Glycine max(L. )Merr. ) Williams82为材料，采用CTAB法提取大豆 根系基因组DNA。根据大豆基因组数据库查找TIP基因及其上游序列，设计特异引物上游引 物Fl和下游引物R1，以提取的总DNA为模板，进行PCR扩增。
[0048] Fl ：5' -