基于高通量测序构建鼠bcr重链文库的多重pcr引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及基于高通量测序构建鼠 BCR重链文库的多重 PCR引物，还涉及利用该引物构建鼠 BCR重链文库的方法。
【背景技术】
[0002] 得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基 因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。同时，这一新兴的技术领域已经被应用于T细 胞和B细胞受体的免疫组库测序。在获得性免疫中，T细胞和B细胞通过表面的T细胞受 体和B细胞受体特异性的识别抗原肽-主要组织相容性复合物（pMHC)进而启动免疫系统 活化。通过测序淋巴细胞受体的⑶R3免疫组库，确定T、B淋巴细胞中受体分子的组成，可 以用以评价免疫组库的多样性等特征参数，并进一步研究获得性免疫系统的应答发生过程 及其发生机制。B细胞受体（BCR)由两条重链和两条轻链，共四条肽链组成，重链由IGH基 因编码，轻链分别由IGL(Lamda链）和IGK(Kappa链）编码，同时由于重链具有更复杂的 内部组成因而能更好的反映 BCR的组成状况。IGH基因的胚系基因由多个开放阅读框依次 排列而成，可划分为IGHV，IGHD，IGHJ，IGHC四组片段，在B淋巴细胞发育过程中通过体细 胞重排实现不同片段间随机组合产生成熟的IGH分子，为BCR的多样性提供了分子遗传基 础。在IGHD-IGHJ，IGHV-IGHD的连接处，由于非模版核苷酸的随机插入与缺失，大大增加 了 BCR分子的多样性程度。B细胞活化过程中，由于体细胞超突变（即亲和力成熟）及重组 类型转换的作用，BCR的多样性进一步增加。而IGH基因的互补决定区3 (CDR3)刚好覆盖 IGHV-Junction-IGHD-Junction-IGHJ区域，包括了 IGH基因几乎全部的多样性信息，因此， 对于B淋巴细胞IGH基因⑶R3区域的序列组成进行测序可以很好的反映 BCR免疫组库的 组成及应答状况。
【发明内容】
[0003] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于高通量测序构建鼠 BCR重链文库的多 重PCR引物；本发明的目的之二在于提供利用所述多重PCR引物构建鼠 BCR重链文库的方 法。
[0004] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0005] 1、基于高通量测序构建鼠 BCR重链文库的多重PCR引物，所述多重PCR引物如SEQ IDN0. 2 ?SEQ ID NO. 10 所示。
[0006] 2、利用所述多重PCR引物构建鼠 BCR重链文库的方法，先提取鼠脾腺组织或外周 血总RNA，然后以SEQ ID NO. 1所示序列为反转录引物反转合成cDNA，再以合成的cDNA为 模板，SEQ ID NO. 2?SEQ ID NO. 10所示序列为引物进行多重PCR，回收PCR产物，将PCR 产物进行微乳滴PCR，然后进行PGM测序，得鼠 BCR重链文库。
[0007] 优选的，所述多重PCR的扩增条件为：95°C预变性IOmin ;95°C变性30s，59°C退火 90s，72°C延伸90s，循环35次；最后72°C后延伸lOmin。
[0008] 本发明的有益效果在于：本发明公开了构建鼠 BCR重链文库的多重PCR引物，该引 物能够扩增IGH基因 CDR3区，获得鼠 BCR重链文库；本发明还公开了构建鼠 IGH基因 CDR3 区测序文库的操作流程，实现了 B细胞受体免疫组库的稳定检测，对进一步了解免疫组库 变化规律、揭示疾病发病机制有重要意义。
【附图说明】
[0009] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0010] 图1为凝胶成像检测目的条带图（1、2 :鼠 BCR重链文库条带；2 :DL2000)。
[0011] 图2为鼠 BCR重链文库统计结果。
【具体实施方式】
[0012] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0013] 实施例1、提取鼠组织中总RNA
[0014] 鼠组织中总RNA的提取方法，包括如下步骤：
[0015] a.取鼠脾腺组织和外周血加入Trizol后吹打，室温静置5min，直接提取RNA或放 入-80°C冰箱冻存；
[0016] b.按每微升Trizol加入200 μ 1氯仿，颠倒混勻（30s)，室温放置3min，然后于 4°C、12000g 离心 15min ;
[0017] c.取水相，按每微升Trizol加入200 μ 1氯仿颠倒混勻（30s)，室温放置3min，然 后于4°C条件下12000g离心15min ;
[0018] d.再取上层水相，按每微升Trizol加入0. 5ml异丙醇，颠倒混勻，室温放置 lOmin，然后于4°C条件下12000g离心lOmin，弃上清；
[0019] e.沉淀按每微升Trizol加入Iml体积分数为75%乙醇，温和震荡，悬浮沉淀，然 后于4°C、8000g离心5min，吸去上清，沉淀于室温（18?25°C )晾干；
[0020] d.晾干后用无 RNA酶水溶解,得鼠总RNA。
[0021] 将提取所得RNA用epoch测定RNA浓度和质量。检测结果显示，0D260/0D280在 1. 8?2. 0左右。
[0022] 再利用变性胶电泳检测28s，18s和5s。检测结果显示，条带明显，28s/18s在2. 0 左右。
[0023] 上述检测结果表明本实施例提取的RNA质量满足建库需求，能够用于后续建库。
[0024] 实施例2、逆转录和多重PCR
[0025] 将实施例1获得的总RNA样本分别进行逆转录，逆转录使用RevertAid First Strand cDNASysthesis kit,具体操作按试剂盒说明书进行，其反应体系为：总RNA 0. 1? 5yg，浓度为 20pmol 的反转录引物（5'-tgactggagttcagacgtgtggaagacggatgggctctgt_3' (SEQ ID NO. I)) 1 μ L，加入DEPC处理水定容至12 μ L，然后将混合液在PCR仪中65°C孵育 5111；[11，然后迅速放入冰浴中5111；[11，然后加入5\代3(31：；[011131^€614以1^，1?；[1301001^ 1111?似86 抑制剂（20u/yL)lyL，lmM dNTPMix 2yL，revertAid TM M-MuLV 反转录酶 200u/yL I μ L，混匀后，离心，然后在42°C条件下孵育lh，得第一链cDNA。
[0026] 根据B淋巴细胞受体重链（IGH基因）体细胞重排、非模版随机插入缺失、体细胞 超突变和类型转换重组的规律，设计多重PCR引物，为方便测序在正向引物和反向引物的 上游添加的测序接头，具体引物如表1所示：
[0027] 表1、鼠 BCR重链文库的多重PCR引物
[0028]
【主权项】
1. 基于高通量测序构建鼠 BCR重链文库的多重PCR引物，其特征在于：所述多重PCR引 物如 SEQ ID NO. 2 ?SEQ ID NO. 10 所示。
2. 利用权利要求1所述多重PCR引物构建鼠 BCR重链文库的方法，其特征在于：先提 取鼠脾腺组织或外周血总RNA，然后以SEQ ID NO. 1所示序列为反转录引物反转合成cDNA， 再以合成的cDNA为模板，SEQ ID NO. 2?SEQ ID NO. 10所示序列为引物进行多重PCR，回 收PCR产物，将PCR产物进行微乳滴PCR，然后进行PGM测序，得鼠 BCR重链文库。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述多重PCR的扩增条件为：95°C预变性 IOmin ;95°C变性 30s，59°C退火 90s，72°C延伸 90s，循环 35 次；最后 72°C后延伸 lOmin。
【专利摘要】本发明公开了基于高通量测序构建鼠BCR重链文库的多重PCR引物和方法，其引物序列如SEQ？ID？NO.2～SEQ？ID？NO.10所示，该引物是根据B淋巴细胞受体重链体细胞重排的规律设计，并在正向引物和反向引物的上游添加测序接头，该引物能高效扩增模板，能够用于构建免疫组库；本发明还公开了构建鼠BCR重链文库的方法，该方法简单，能够快速构建鼠BCR重链文库，对进一步了解免疫组库变化规律、揭示疾病发病机制有重要意义。
【IPC分类】C40B40-08, C12Q1-68, C12N15-12, C12N15-11, C12N15-10
【公开号】CN104560979
【申请号】CN201510027852
【发明人】贾罄竹, 万瑛, 陈钢, 于海礼, 关鹏, 张建阳
【申请人】中国人民解放军第三军医大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月20日