专利名称：一种慢病毒载体及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种慢病毒载体，具体涉及一种慢病毒介导的针对FoxP3基因 的RNA干扰技术(RNA interfirence, RNAi)，以及带有shRNA的慢病毒载体。
背景技术：
FoxP3是一种转录抑制因子，是forkhead/winged-helix家族成员，和细胞 生长发育的调控有关，后来越来越多的证据表明FoxP3可能是一种 CD4+CD25+Treg免疫抑制性调节细胞发育、分化的至关重要的基因，并在其表 型和功能的维持中其非常关键的作用。
研究表明调节性T细胞(Treg)可以通过对效应T细胞的调控达到影响 机体对肿瘤监控的作用。作为Treg细胞的主要标志物，叉头状/翅膀状蠊旋转录 因子(forkhead/winged helix transcription factor, FoxP3)对Treg发挥功能 是必需的，是Treg细胞发育的一个重要开关。研究发现将FoxP3基因转导入 小鼠外周CD4+CD25-未致敏T细胞，可使其分化为具有与nTreg (天然调节性 T细胞)相似的表型与功能。而且还有大量研究也发现，肿瘤浸润T细胞中存 在着大量的FoxP3高表达，而且数量与患者肿瘤进展和预后成负相关。
现有技术中，有学者通过使用小分子药物(雷帕霉素)调控基因表达网络 的方式来降低FoxP3的表达。由于这些方法本身无法直接作用FoxP3蛋白，作 用的对象处于基因调控的中心位置，将会影响到其他无关基因的表达异常，即 专一性不强，有较大的副作用，而且其本身对FoxP3的抑制作用并不显著；同 时，由于RNA千扰(RNA interfirence， RNAi)技术具有高效而专一地抑制基 因表达的特性，因此，在基因功能研究发面得到了广泛的应用，也为某些难以 治疗的疾病提供一种新的治疗手段。
由于FoxP3是一种转录因子，因此无法通过抗体等方法攻击该蛋白，而慢 病毒介导基因沉默技术给我们提供了一条行之有效的方法，史艳侠，韩文杰等 人发表的文章，使用oligoengine软件设计FoxP3基因shRNA序列，化学合成法合成4条shRNA序列，构建含FoxP3的耙序列的慢病毒载体；构建出表达 FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶 点，结果成功包装了 4条FoxP3基因耙序列相应的慢病毒颗粒；成功构建了表 达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞在工具细胞上筛选出2条RNAi效率 分别为91.3%和95.6%的有效耙点(参见史艳侠，韩文杰等.中山大学学报(医 学科学版).2007年11月，第28巻第6期)；上述文献针对的是通过基因克隆技 术，人工改造过的FoxP3基因片段，并且该基因片段为融合基因(加载了 FLAG 标签)，根据该文献提供的数据无法判断该融合基因的产物是否具有生物学活 性，或者说与天然的产物之间是否存在着功能差异；此外，人工合成的FoxP3 融合基因的表达系统应该属于"过"表达的"瞬时"系统，它的表达量远远超 过正常细胞中的表达量而且是很不稳定的，所以文献中的提到的抑制率对正常T 细胞的作用是不足以直接说明的；文献中作用的细胞是293T细胞系，并不是天 然的细胞系。FoxP3基因只有在T调节细胞中才能发挥其生物学功能，在293T 细胞中是没有任何作用的。而且没有直接证据证明，可以降低293T细胞中的融 合基因的表达就一定可以降低天然调节T细胞中FoxP3基因的表达。
发明内容
本发明目的是提供一种针对小鼠FoxP3基因序列的特异性短发卡RNA (short hairpin RNA, shRNA)以及载有该shRNA的慢病毒载体，抑制Treg 细胞中的FoxP3基因的表达，降低Treg细胞的功能，抑制黑色素瘤。
为达到上述目的，本发明具体技术方案是，一种针对小鼠FoxP3基因序列 的特异性短发卡RNA，所述短发卡RNA包括一正义链和一反义链组成，其中，
正义链序列为5' - CAC CGC CAT GGC AAT AGT TCC TTC CCG AAG GAA GGA ACT ATT GCC ATG GC-3';
反义链序列为5' - AAA AGC CAT GGC AAT AGT TCC TTC CTT CGG GAA GGA ACT ATT GCC ATG GC -3';
为达到上述目的，本发明具体技术方案是，载有上述针对小鼠FoxP3基因 序列的特异性短发卡RNA的慢病毒载体，所述慢病毒载体的制备方法包括以下 步骤(1) 将上述短发卡RNA载入pENTR/U6质粒中，得到pENTR/U6-FoxP3 -ShRNA;并通过LR Clonase II Enzyme Mix与pLenti6/BLOCK-IT-DEST质粒 进行重组，得到pLenti-FoxP3-shRNA重组质粒。
(2) 使用Lentivirus shRNA expression vectors系统在293FT细胞中，对步骤 (l)获得的重组质粒进行慢病毒包装，得到载有短发卡RNA的慢病毒载体；
进一步的技术方案中，将上述载有短发卡RNA的慢病毒载体导入 CD4+CD25+的Treg细胞中，从而降低Treg细胞的功能。
本发明还包括上述载有短发卡RNA的慢病毒载体在制备治疗黑色素瘤的药 物中的应用。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
1、 本发明设计了针对FoxP3基因的特异性短发卡RNA,采用慢病毒的方 法导入CD4+CD25+的Treg细胞中，有效的抑制Treg细胞中的FoxP3的表达， 并且抑制Treg细胞的功能，从而抑制了黑色素瘤的生长。
2、 本发明中设计的特异性短发卡RNA针对的是天然存在于T调节细胞中 的FoxP3基因，是具有其完整生物学功能的基因；本发明中的慢病毒载体作用 的细胞是天然的T调节细胞，FoxP3基因只有在T调节细胞中才能发挥其生物 学功能。
图1、实施例二中的pENTR/U6-FoxP3-ShRNA的示意图； 图2、实施例二中pLenti6/BLOCK-iT-DEST质粒的示意图； 图3、实施例二中含shRNA的重组质粒pLenti-FoxP3-shRNA的示意图； 图4、实施例二中构建含shRNA的重组质粒pLenti-FoxP3-shRNA流程示 意图5、实施例四中的CFDA SE检测结果； 图6、实施例四中的体内实验数据图6a为各组老鼠肿瘤大小的数据图；图6b为各组老鼠存活数的数据图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 实施例一
根据小鼠FoxP3mRNA序列(NCBI NM—054039)，使用BLOCK-iT RNAi Designer在线软件设计1条50nt的核苷酸序列作为RNAi靶点。序列编号为 ShRNA-FoxP3。
正义链5，- CAC CGC CAT GGC AAT AGT TCC TTC CCG AAG GAA GGA ACT ATT GCC ATG GC -3'
反义链5，誦AAA AGC CAT GGC AAT AGT TCC TTC CTT CGG GAA GGA ACT ATT GCC ATG GC -3'
实施例二参见图1 图4，参照Lentivirus-shRNA系统的说明书，构建 重组质粒
取实施例一中合成并纯化的shRNA片段各lOlig，退火成互补双链。 pENTR/U6质粒和shRNA以1:2用T4连接酶链接，转化感受态菌One Shot TOPIO，用卡那霉素筛选位点，形成pENTR/U6-FoxP3-ShRNA(如图1所示)。 使用ABI-7700测序，与合成片段对比后确认合成序列正确，无基因突变。
将序列正确的pENTR/U6-FoxP3-ShRNA使用BLOCK-iT Lentiviral RNAi Expression System与pLenti6/BLOCK誦iT-DEST重组(如图2所示)， 通过氨苄青霉素筛选得到含有目的shRNA的重组质粒pLenti-FoxP3-shRNA (如图3所示)，整个过程如图4所示。
实施例三参照Lentivirus-shRNA系统的说明书，制备重组慢病毒 pLenti-FoxP3-shRNA
(1) 在100mm培养皿(Corning)中接种106个293FT细胞，待细胞长至 70%-80%融合时做1:3传代，用含10。/。小牛血清的DMEM (GIBCO)作为培 养基，在37" Sn/。C02培养箱中培养24h。
(2) 待细胞达70%融合时，将pLenti-FoxP3-shRNA质粒和慢病毒载体的包 装质粒一起，用磷酸钙共沉淀进行转染。
(3) 待细胞生长24h后换细胞培养基，置37" 5D/。C02培养箱中培养，24h后获病毒上清，换细胞培养基。(4) 收获转化后72h病毒上清，用漂白剂处理细胞培养皿以破坏病毒生产细胞。(5) 将病毒上清做50000rpm超速离心，吸取病毒上清层。(6) 测病毒滴度，用PBS调整病毒滴度为1012VP/ml。<7)使用0.22"m的滤膜进行超滤，然后包装入2ml的西林瓶中。-80卩的 深低温冰箱保存。(8)对病毒进行热源检测、微生物检测，同时用PCR法检测是否有野生病 毒复制(RCL)，确保无热源，无细胞、真菌、病毒等微生物污染，无野生病 毒复制。实施例四重组慢病毒感染T调节细胞抗恶性黑色素瘤实验(1) CD25+淋巴细胞的分选通过手术取得6-8周龄的雌性C57BL老鼠脾脏， 破开包膜后，细胞悬液过70m孔径的尼龙细胞塞(BD Bioscience),使用红细 胞裂解液除去其中的红细胞后，使用CD25-PE抗体对细胞进行标记。然后对 以标记的细胞加标anti-PE的磁珠。使这些细胞通过磁性分选装置，将CD25+ 和CD25-的细胞分离开。(2) 细胞培养B16 (恶性黑色素瘤)细胞均使用含有10%FBS、 100 g/ml 青霉素和链霉素的DMEM培养基。(3) 病毒感染搭载有FoXP3特异性的shRNA的慢病毒(lX107TU)与CD25+ 淋巴细胞(1X106)共培养12小时。换无病毒培养基120小时后，检测(流 式细胞仪法)CD25+淋巴细胞中FoxP3的表达状况。流式细胞检测发现 CD25+T细胞中的FoxP3显著下降，没有被沉默的CD25+T细胞中的FoxP3 表达量是被沉默的CD25+T细胞中的FoxP3表达量的10倍以上(5.67 ± 1.08 vs. 0.43 ± 0.25; P = 0.020)。(4) T细胞体外活化CD25+ (FoxP3-/+)培养于CD3 (lng/ml)、 CD28 (10ng/ml)抗体标记的培养板中。5天后，该T细胞与丝裂霉素处理过的B16、TC1和CD25-T细胞共培养3天。CCK8法检测体外活化T细胞增殖情况，表 一是CCK8实验结果表一、CCK8法检测体外活化T细胞增殖实验(OD，M
6 0.68±0.66 2,02±0.11 1.84±0.28* 1.46±0.16
6 0,22±0.01 0,68±0,060.65土0.09** 0.49±0,10
6 0.46±0.06 0,71±0.11 0.60±0.08*** 0.47+0.03
其中，*与shRNA-LacZ组间存在显著差异p<0.017 **与shRNA-LacZ组间存在显著差异 p<0.001 ***与shRNA-LacZ组间存在显著差异 p<0.004 "**未检测
A) 阴性对照(只有CD25阴性细胞，无CD25阳性细胞和丝裂霉素处理后 的B16细胞)
B) 阳性对照(CD25阴性细胞+丝裂骞素处理后的B16细胞，伹无CD25 阳性细胞)
C) CD25阴性细胞+ shRNA-FoxP3处理后CD25阳性细胞+丝裂霉素处 理后的B16细胞
D) CD25阴性细胞+ shRNA-LacZ处理后CD25阳性细胞+丝裂每素处理 后的B16细胞
E) 丝裂赛素处理后的B16细胞
F) 培养基
表一的结果表明FoxP3沉默大幅降低T调节细胞，对T效应细胞增生具 有抑制作用；同时，CFDASE检测也发现FoxP3沉默的T调节细胞对肿瘤效 应细胞增殖的抑制作用显著下降(图5).
(5)体内实验体外活化CD25+T细胞与CD25-T细胞分别与B16细胞注射 到C57BL老鼠皮下。
FoxP3沉默组比对照组中，肿瘤生长速度显著减慢(P<0.05,图6a、 6b), 从图6a中可以发现，慢病毒载体组的肿瘤的尺寸相对其他对比组生长速度显 著减慢；从图6b中可以发现，慢病毒载体组的老鼠的存活数大于其他对比组。
8SEQUENCE LISTING<110> 苏州大学<120> —种慢病毒载体及其制备和应用<140> 2009100276364<141> 2009-05-15<160> 2<170> Patentln version 3.5<210> 1<211> 50<212> DNA<213> 人工序列<400> 1caccgccatg gcaatagttc cttcccgaag gaaggaacta ttgccatggc 50<210> 2<211> 50<212> DNA<213> 人工序列<楊> 2aaaagccatg gcaatagttc cttccttcgg gaaggaacta ttgccatggc 50
权利要求
1.一种针对小鼠FoxP3基因序列的特异性短发卡RNA，所述短发卡RNA包括一正义链和一反义链组成，其特征在于其中，正义链序列为5’-CAC CGC CAT GGC AAT AGT TCC TTC CCG AAGGAA GGA ACT ATT GCC ATG GC-3’；反义链序列为5’-AAA AGC CAT GGC AAT AGT TCC TTC CTT CGGGAA GGA ACT ATT GCC ATG GC-3’。
2. 载有权利要求1所述特异性短发卡RNA的慢病毒载体，其特征在于 所述慢病毒载体的制备方法包括以下步骤(1) 将权利要求1所述短发卡RNA载入pENTR/U6质粒中；(2) 使用Lentivirus shRNA expression vectors系统在293FT细胞中，对步骤 (l)获得的质粒进行慢病毒包装，得到载有短发卡RNA的慢病毒载体。
3. 权利要求2所述慢病体载体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一慢病毒载体，首先设计针对小鼠FoxP3基因序列的特异性短发卡RNA，所述短发卡RNA包括一正义链和一反义链组成，然后将上述短发卡RNA载入pENTR/U6质粒中；再使用Lentivirus shRNA expression vectors系统在293FT细胞中进行慢病毒包装，得到载有短发卡RNA的慢病毒载体；将上述载有短发卡RNA的慢病毒载体导入CD4+CD25+的Treg细胞中，从而降低Treg细胞的功能，从而抑制了黑色素瘤的生长。
文档编号A61P35/00GK101575604SQ20091002763
公开日2009年11月11日 申请日期2009年5月15日 优先权日2009年5月15日
发明者周翊峰 申请人:苏州大学