专利名称：：具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及中药灵芝子实体提取物，具体地说是涉及一种具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物，以及这种具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物的制备方法。
背景技术：
：灵芝为多孔菌科真菌，有几千年的药用历史，收载于中国最早的本草学专著《神农本草经》。两千多年以来，人们一直用灵芝来预防、治疗肿瘤；现代科学研究也表明，灵芝有较强的抗肿瘤作用。灵芝三薛类成分被公认为灵芝抗胂瘤的有效成分之一。关于灵芝三辟类成分的提取，常用乙醇加热回流提取，其存在有机溶剂残留多、提取温度高、成本相对较高等缺点。超临界C02流体技术是提取灵芝三辟类成分的最新技术，克服了以上缺点。中国专利200510047263.9公开了CCVSFE在提取灵芝子实体中三萜类物质上的应用。虽然目前关于灵芝子实体超临界C02萃取三萜类组分的提取工艺研究较多，但对三辟类組分的純化研究却相对较少，临床多以超临界C02萃取物直接用药，或将纯化后的灵芝三萜酸类成分用于治疗。李保明(参见:李保明，刘超,王洪庆,等.灵芝总三萜酸含量测定方法的研究[J].中国中药杂志,2007,32(12)1234-1236.)报道将灵芝子实体用乙醇加热回流提取，氯仿溶解，饱和碳酸氬钠溶液碱提，盐酸酸化，氯仿萃取的方法获得灵芝三碎酸类成分；中国专利200310117112.7公开了一种灵芝三辟类抗肿瘤组分的提取方法，它将灵芝子实体用甲醇或乙醇超声循环浸提，然后用饱和碳酸氢钠溶液石威提，盐酸酸化，再用氯仿萃取将酸化后的三辟酸类成分，减压蒸干得到三辟酸类组分。以上报道有一个共同之处，即均将饱和碳酸氢钠溶液碱提之后的氯仿层弃掉，仅保留饱和碳酸氢钠溶液碱提液中的三辟酸类成分，将之酸化并萃取出。
发明内容本发明的目的，是提供一种具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物，这是一种从灵芝子实体超临界C02萃取物中获得的具有抗肿瘤活性的提取物。本发明还提供这种具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物的制备方法。本发明将克服以往普遍使用灵芝三辟中三辟酸类成分，而忽略其中含有的其它具有抗肿瘤活性成分利用的问题。完成本申请第l个发明任务的方案是，一种具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物，其特征在于，其中三萜类成分的含量为30~70wt%;同时，该提取物中含有的有效成分还用以下方法表征用高效液相色谱条件1表征提取物，由色谱峰保留时间在80128min之间的成分组成(图1);用高效液相色谱条件2表征提取物，主要包含色谱峰保留时间为14.8915.67min、30.7431.35min、34.3634.98min、37.03~37.64min、39,47~40.01min的5个成分(图2)。所述的高效液相色镨条件1为ZORBAXSB-C18柱(4.6mmx250mm，5pm);流动相A:乙腈，B:0.05%磷酸水溶液，线性梯度洗脱，0min:27°/oA;40min:27%A;60min:35%A;80min:450/0A;90min:65%A;100min:75%A;110min:85%A;120min:100%A;128min:100%A;流速:l.OmL.min-1;检测波长254nm;柱温30。C。在此条件下，灵芝子实体超临界C02萃取的粗提物由色谱峰保留时间在0128min之间的所有成分组成(图3);该粗提物的碳酸氬钠萃取层(即以往普遍使用的灵芝三薛酸类成分)由色语峰保留时间在0~80min之间的所有成分组成(图4),色谱峰保留时间在80~128min之间的所有成分组成本提取物。高效液相色镨条件2为ZORBAXSB-C18柱(4.6mmx250mm，5jim);流动相A:乙腈，B:0.05。/。磷酸水溶液，线性梯度洗脱，0min:60%A;25min:90%A;40min:1000/oA;45min:100%A;;危速:l.OmL.min画l;才企测波长240nm;柱温30。C。三碎类成分含量测定方法用分光光度法，以熊果酸为对照品，在检测波长为543nm下测定，供试品及空白样品的光语扫描图见图'5、图6、图7。申请人研究发现灵芝子实体用超临界C02萃取技术提取出的粗提物，经饱和碳酸氢钠溶液碱提后的氯仿层，即以上报道中弃去的物质，亦具有很强的抗肿瘤活性。所以，本发明建立了一种从灵芝子实体中提取灵芝三碎酸以外提取物的方法，获得一种具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物。更具体和更优化地说，本发明所述的具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物是指采用以下方法制备得到的提取物(1)灵芝子实体粉碎成粗粉，过筛；(2)将灵芝子实体粗粉以乙醇为夹带剂用超临界C02萃取技术进行萃取，得到灵芝子实体粗提物乙醇溶液，减压回收溶剂，得到灵芝子实体粗提物；(3)将灵芝子实体粗提物用醋酸乙酯溶解，饱和碳酸氢钠溶液萃取，分别得到饱和碳酸氢钠层和醋酸乙酯层；(4)取醋酸乙酯层减压回收溶剂，真空干燥，得灵芝子实体抗肿瘤提取物。本发明的另一目的是提供上述提取物的制备方法，其特征在于，步骤如下(1)灵芝子实体粉碎成粗粉，过筛；(2)将灵芝子实体粗粉以乙醇为夹带剂用超临界C02萃取技术进行萃取，得到灵芝子实体粗提物乙醇溶液，减压回收溶剂，得到灵芝子实体粗提物；(3)将灵芝子实体粗提物用醋酸乙酯溶解，饱和碳酸氢钠溶液萃取，分別得到饱和碳酸氢钠层和醋酸乙酯层；(4)取醋酸乙酯层减压回收溶剂，真空干燥，得灵芝子实体抗肿瘤提取物。在上述步骤(1)中，灵芝子实体并分碎时，过10~50目筛。在本发明的优选实例中，灵芝子实体粗粉过12目筛。在上述步骤(2)中，超临界C02萃取条件为萃取压力为25MPa,萃取温度为45。C，萃取时间为1.5h，夹带剂乙醇用量为3mL.g"生药。在上述步骤(2)中，灵芝子实体粗提物乙醇溶液回收乙醇时，温度控制在30~60。C，最优温度控制在50。C。在上述步骤(3)中，用醋酸乙酯溶解时，灵芝子实体粗提物与醋酸乙酯两者的比例为灵芝子实体粗提物质量(g):醋酸乙酯(mL)-l:10l:100,优选为1:401:80,最优选为1:50。在上述步骤(3)中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取醋酸乙酯溶液，萃取次数为18次，优选萃取次数为2~6次，最优选萃取次数为4次。在上述步骤(3)中，用饱和碳酸氬钠溶液萃取醋酸乙酯溶液时，醋酸乙酯与饱和碳酸氢钠溶液体积比为1:33:1，优选为1:22:1，最优选为1:1。在上述步骤(4)中，回收醋酸乙酯溶剂和真空干燥提取物时，温度控制在30~60。C,优选为50。C。在上述步骤(4)中得到的黑褐色固体即为灵芝子实体抗胂瘤提取物。本发明的灵芝子实体提取物的药用用途是以所述的灵芝子实体提取物作为抗胂瘤活性成分，加入药学上可接受的辅料，制成的任何一种剂型的药物。本发明的有益效果1.本发明使用超临界co2流体技术萃取灵芝子实体的活性组分，可以大幅度减少有机溶剂产生的环境污染，保护环境。2.本发明抗肿瘤提取物比以往普遍使用的灵芝三辟酸类成分具有更好的抗肿瘤效果，充分利用本发明提取物可以更好、更充分合理的利用灵芝这味珍贵药材。图1为本发明提取物HPLC图语(色谱条件1);图2为本发明提取物HPLC图镨(色镨条件2);图3为灵芝子实体超临界C02粗提物HPLC图谱(色谱条件1);图4为灵芝子实体超临界C02粗提物的碳酸氢钠萃取层的HPLC图谱(色谱条件1);图5为熊果酸对照品的光镨扫描图；图6为供试品的光语扫描图；图7为空白样品的光谱扫描图。图8为从灵芝子实体中获得一种具有抗肿瘤活性的提取物的制备方法流程图。具体实施例方式下面结合实例对本发明作进一步详细说明，但本发明的范围并不受这些实例的限制。实施例1将灵芝子实体粉碎，过12目筛，取100g置于超临界萃取装置中的1L萃取釜中，设定萃取釜温度为45°C,分离釜I温度为50。C,分离釜II温度为36。C,打开C02钢瓶(需保持出口压力在4MPa以上)，同时调节萃取釜压力为25MPa、分离釜I压力为7MPa、分离釜II压力为4MPa，调节C02流量为30L/h，萃取时间1.5h,夹带剂乙醇用量为300mL。使超临界<:02流体在设定的压力、温度下进行萃取循环，当达到试验设定的萃取时间后，从分离釜I和分离釜II出料口接收萃取液；将得到的提取液，50。C减压回收溶剂，得到灵芝子实体粗提物。将上述所得到的灵芝子实体粗提物，用50倍醋酸乙酯溶解；再用饱和碳酸氢钠溶液萃取4次，萃取时饱和碳酸氢钠溶液与醋酸乙酯体积比为1:1,得到碳酸氢钠溶液层和醋酸乙酯层；5(TC减压回收醋酸乙酯溶剂，并于50。C真空干燥，得黑褐色固体粉末1.06g。本发明提取物中三萜类成分含量测定取灵芝子实体抗肿瘤提取物50mg,用无水乙醇定容到50mL,用可见分光光度法测定三碎类成分的含量。对照品溶液的制备精密称取熊果酸对照品2.21mg，置于10mL量瓶中，加无水乙醇适量使溶解，定容，摇匀，即得。显色方法及检测波长的确定取上述熊果酸对照品溶液0.5mL，置10mL具塞试管中，沸水浴中挥干溶剂，依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.5mL，高氯酸0.8mL,密塞，于60。C水浴中加热15min,取出，水水浴中冷却5min，加冰醋酸5mL，摇匀。用UV-2802型可见分光光度仪进行全波长扫描，在543nm处有最大吸收峰，故选择检测波长为543nm。标准曲线的制备分别精密吸取熊果酸对照品溶液0.2,0,3,0.4，0.5，0.6,0.7,0.8mL,按上述条件及步骤在543nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标(y)，熊果酸对照品含量(吗)为横坐标(Z)，绘制标准曲线，线性方程为0.0035,产0.9995，结果表明熊果酸在44.2154.7吗呈现良好的线性关系。含量测定取上述制备的灵芝子实体抗肺瘤提取物乙醇溶液60^L,按"显色方法"项下测定吸光度，根据标准曲线计算灵芝三薛的含量。结果见表2。固形物的含量测定精密量取上述灵芝子实体抗肿瘤提取物乙醇溶液IOmL，置已干燥恒重的蒸发亚中，水浴挥干溶剂，置105。C烘箱中恒重，称定，计算固形物的含量，结果见表l。表1本发明提取物的三萜含量、固形物含量的测定样品固形物含量/%三砲含量/%本发明提取物__53.49实施例2将灵芝子实体粉碎，过10目筛，取100g置于超临界萃取装置中的1L萃取釜中，设定萃取釜温度为45°C，分离釜I温度为50°C，分离釜II温度为36。C,打开C02钢瓶(需保持出口压力在4MPa以上)，同时调节萃取釜压力为25MPa、分离釜I压力为7MPa、分离釜II压力为4MPa,调节C02流量为30L/h,萃取时间1.5h,夹带剂乙醇用量为300mL。使超临界C02流体在设定的压力、温度下进行萃取循环，当达到试验设定的萃取时间后，从分离釜I和分离釜II出料口接收萃取液；将得到的提取液，30。C减压回收溶剂，得到灵芝子实体粗提物。将上述所得到的灵芝子实体粗提物，用IOO倍醋酸乙酯溶解；再用饱和碳酸氢钠溶液萃取6次，萃取时饱和碳酸氢钠溶液与醋酸乙酯体积比为2:1,得到碳酸氬钠溶液层和醋酸乙酯层；4(TC减压回收醋酸乙酯溶剂，并于40。C真空干燥，得到黑褐色固体粉末0.95g。实施例3将灵芝子实体粉碎，过50目筛，取100g置于超临界萃取装置中的1L萃取釜中，设定萃取釜温度为45°C,分离釜I温度为50°C，分离釜II温度为36。C，打开C02钢瓶(需保持出口压力在4MPa以上)，同时调节萃取釜压力为25MPa、分离釜I压力为7MPa、分离釜II压力为4MPa，调节C02流量为30L/h，萃取时间1.5h,夹带剂乙醇用量为300mL。使超临界C02流体在设定的压力、温度下进行萃取循环，当达到试验设定的萃取时间后，从分离釜I和分离釜II出料口接收萃取液；将得到的提取液，50。C减压回收溶剂，得到灵芝子实体粗提物。13将上述所得到的灵芝子实体粗提物，用10倍醋酸乙酯溶解；再用饱和碳酸氢钠溶液萃取2次，萃取时饱和碳酸氢钠溶液与醋酸乙酯体积比为1:3，得到饱和碳酸氬钠溶液溶液层和醋酸乙酯层；30。C减压回收醋酸乙酯，30°C真空干燥，得到黑褐色固体粉末1.31g。实施例4将灵芝子实体粉碎，过12目筛，取100g置于超临界萃取装置中的1L萃取釜中，设定萃取釜温度为45°C,分离釜I温度为50°C,分离釜II温度为36。C,打开C02钢瓶(需保持出口压力在4MPa以上)，同时调节萃取釜压力为25MPa、分离釜I压力为7MPa、分离釜II压力为4MPa，调节C02流量为30L/h,萃取时间1.5h，夹带剂乙醇用量为300mL。使超临界C02流体在设定的压力、温度下进行萃取循环，当达到试验设定的萃取时间后，从分离釜I和分离釜II出料口接收萃取液；将得到的提取液，60。C减压回收溶剂，得到灵芝子实体粗提物。将上述所得到的灵芝子实体粗提物，用80倍醋酸乙酯溶解；再用饱和碳酸氢钠溶液萃取5次，萃取时饱和碳酸氢钠溶液与醋酸乙酯体积比为3:1，得到饱和碳酸氬钠溶液和醋酸乙酯层；60。C减压回收醋酸乙酯，60。C真空干燥，得到黑褐色固体粉末0.81g。实施例5将灵芝子实体粉碎，过12目筛，取100g置于超临界萃取装置中的1L萃取釜中，设定萃取釜温度为45°C，分离釜I温度为50°C，分离釜II温度为36。C,打开C02钢瓶(需保持出口压力在4MPa以上)，同时调节萃取釜压力为25MPa、分离釜I压力为7MPa、分离釜II压力为4MPa，调节C02流量为30L/h，萃取时间1.5h，夹带剂乙醇用量为300mL。使超临界C02流体在设定的压力、温度下进行萃取循环，当达到试验设定的萃取时间后，从分离釜I和分离釜II出料口接收萃取液；将得到的提取液，50。C减压回收溶剂，得到灵芝子实体粗提物。将上述所得到的灵芝子实体粗提物，用40倍醋酸乙酯溶解；再用饱和碳酸氬钠溶液萃取4次，萃取时饱和碳酸氳钠溶液与醋酸乙酯体积比为1:2，得到饱和碳酸氢钠溶液层和醋酸乙酯层；40。C减压回收醋酸乙酯溶剂，40°C真空干燥，得到黑褐色固体粉末U9g。实施例6将灵芝子实体粉碎，过12目筛，取100g置于超临界萃取装置中的1L萃取釜中，设定萃取釜温度为45°C,分离釜I温度为50°C,分离釜II温度为36。C,打开C02钢瓶(需保持出口压力在4MPa以上)，.同时调节萃取釜压力为25MPa、分离釜I压力为7MPa、分离釜II压力为4MPa,调节C02流量为30L/h，萃取时间1.5h，夹带剂乙醇用量为300mL。使超临界C02流体在设定的压力、温度下进行萃取循环，当达到试验设定的萃取时间后，从分离釜I和分离釜II出料口接收萃取液；将得到的提取液，50。C减压回收溶剂，得到灵芝子实体粗提物。将上述所得到的灵芝子实体粗提物，用60倍醋酸乙酯溶解；再用饱和碳酸氢钠溶液萃取5次，萃取时饱和碳酸氬钠溶液与醋酸乙酯体积比为1:1，得到饱和碳酸氢钠溶液层和醋酸乙酯层；60。C减压回收醋酸乙酯溶剂，60。C真空干燥，得到黑褐色固体粉末0.90g。实施例715将灵芝子实体粉碎，过12目筛，取100g置于超临界萃取装置中的1L萃取釜中，设定萃取釜温度为45°C，分离釜I温度为50°C，分离釜II温度为36。C,打开C02钢瓶(需保持出口压力在4MPa以上)，同时调节萃取釜压力为25MPa、分离釜I压力为7MPa、分离釜II压力为4MPa,调节C02流量为30L/h,萃取时间1.5h,夹带剂乙醇用量为300rnL。使超临界C02流体在设定的压力、温度下进行萃取循环，当达到试验设定的萃取时间后，从分离釜I和分离釜II出料口接收萃取液；将得到的提取液，50。C减压回收溶剂，得到灵芝子实体粗提物。将上述所得到的灵芝子实体粗提物，用80倍醋酸乙酯溶解；再用饱和碳酸氢钠溶液萃取8次，萃取时饱和碳酸氢钠溶液与醋酸乙酯体积比为1:1，得到饱和碳酸氢钠溶液层和醋酸乙酯层；50。C减压回收醋酸乙酯，50。C真空干燥，得到黑褐色固体粉末0.76g。实施例8将灵芝子实体粉碎，过12目筛，取100g置于超临界萃取装置中的1L萃取釜中，设定萃取釜温度为45°C，分离釜I温度为50°C,分离釜II温度为36。C，打开C02钢瓶(需保持出口压力在4MPa以上)，同时调节萃取釜压力为25MPa、分离釜I压力为7MPa、分离釜II压力为4MPa，调节C02流量为30L/h，萃取时间1.5h，夹带剂乙醇用量为300mL。使超临界C02流体在设定的压力、温度下进行萃取循环，当达到试验设定的萃取时间后，从分离釜I和分离釜II出料口接收萃取液；将得到的提取液，60。C减压回收溶剂，得到灵芝子实体^L提物。将上述所得到的灵芝子实体粗提物，用70倍醋酸乙酯溶解；再用饱和碳酸氢钠溶液萃取l次，萃取时饱和碳酸氢钠溶液与醋酸乙酯体积比为1:1，得到饱和碳酸氢钠溶液层和醋酸乙酯层；40。C减压回收醋酸乙酯，40。C真空干燥，得到黑褐色固体粉末1.79g。实施例9本发明提取物的体外抗肿瘤实验人肝癌BEL-7402细胞林取对数生长期人肝癌BEL-7402细胞(购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库)用胰酶消化，用含小牛血清RPMI1640培养基配制成一定浓度的细胞悬液，细胞的浓度为5xl(^个/mL，然后接种于96孔板，每孔加入100pL，置37°C、5。/。C02培养箱及饱和湿度条件下培养24h，然后弃去含小牛血清的培养基，每孔加入90pL无血清培养基，及10jiL不同浓度的药物，阳性药物组给予60jig.mL"的顺柏溶液，空白组加入等体积的PBS緩冲盐溶液，另每组各设两个本底孔(即不含肿瘤细胞，只含对应的培养基与药物)，以去除培养基及药液颜色的影响。受试药分别为本发明提取物(即醋酸乙酯层)和灵芝子实体三辟酸提取物(即饱和碳酸氢钠层)，均设5个剂量组，分别用PBS稀释至浓度为20、5、1.25、0.3125、0.0781吗提取物'mL-l,每组设3个平行孔。于37。C、5。/。C02培养箱培养48h后，每孔加MTT溶液(5mg.m!/1)10pL，继续培养4h，终止培养，吸弃孔中上清液，然后每孔加100jxLDMSO溶解MTT曱瓒颗粒，用微型振荡器振荡10min后，于酶联免疫检测仪570nm波长测定光密度值(OD),实验重复3次，取平均值，计算药物对肿瘤细胞的抑制率，结果见表2。药物抑制率=[OD对照组一OD药物组]/OD对照组xl000/0表2本发明提取物和灵芝子实体三萜酸提取物.对人肝癌BEL-7402细胞的增殖抑制作用比较(-±s，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注阳性对照顺铂组细胞生长抑制率分别为(70.47±0.65)%"--"表示抑制率均小于50%，不能计算IC50结果表明，本发明提取物有较强的抑制人肝癌BEL-7402细胞增殖的活性；并且在同样浓度下，比灵芝子实体三萜酸提取物抑制率高，具有更好的抑制人肝癌BEL-7402肿瘤细胞增殖的活性。人肺癌SPC-A-1细胞抹取对数生长期人肺癌SPC-A-1细胞(购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库)用胰酶消化，使其脱壁，用10。/。胎牛血清RPMI1640培养液重悬成单细胞悬液，细胞的浓度为5xl(^个/mL，然后接种于96孔细胞培养板，每孔加入100pL。受试药分别为本发明提取物(即醋酸乙酯层)和灵芝子实体三辟酸提取物(即饱和碳酸氢钠层)，均设5个剂量组，分别用PBS稀释至浓度为20、10、5、1.25、0.3125吗提取物'mL-l，每组设3个平行孔。其余操作与人肝癌BEL-7402细胞的相同，计算药物对肿瘤细胞的抑制率，结果见表3。表3本发明提取物和灵芝子实体三萜酸提取物对人肺癌SPC-A-1细胞的增殖抑制作用比较(5±&n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注阳性对照顺铂组细胞生长抑制率分别为(74.08±0.59)%"---"表示抑制率均小于50%，不能计算ICso所得结果表明本发明提取物有较强的抑制人肺癌SPC-A-1的增殖活性；并且在同样浓度下，比灵芝子实体三萜酸提:f又物抑制率高，具有更好的抑制SPC-A-1肿瘤细胞增殖的活性。实施例10本发明提取物的体内抗肿瘤实验选择接种7d，生长良好的荷Heps肝癌小鼠，颈推脱臼处死，无菌抽取腹水，以无菌生理盐水按l:4比例稀释成2xl(^个/mL的瘤细胞悬液，接种于健康小鼠右前肢皮下，每只0.2mL。接种次日，按体重随机分为6组，分别为生理盐水空白对照组；环磷酰胺阳性对照组；本发明提取物高低剂量组(140mg提取物'kg-l'd-l、70mg提取物'kg-l'd-l);灵芝子实体三薛酸提取物高低剂量组(140mg提取物'kg-l'd-l、70mg提取物'kg-l'd-l)。环磷酰胺阳性对照组为腹腔注射UOmg'kg^d-1),其它组为灌胃给药，均为每曰1次，连续7d。期间，每日观察小鼠的一般活动、皮毛、粪便等情况。与末次给药后24h后颈推脱臼处死小鼠剥取瘤组织，同时剖耳又小鼠脾脏、胸腺，称重，计算抑瘤率、脾指数、胸腺指数，结果见表4、表5。抑瘤率(％)=(l-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)xioo%;脾指数=脾重(mg)/小鼠体重(g);胸腺指数=胸腺重(mg)/小鼠体重(g)。表4本发明提取物和灵芝子实体三萜酸提取物对Heps移植性肿瘤的抑制作用比较(5±力<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注与阴性对照组比较承P0.05结果表明本发明提取物有较强的抑制小鼠体内肝癌Heps肿瘤的生长作用，其高、低剂量组与对照组的瘤重相比均有显著性降低(P〈0.05);并且在相同浓度下，比灵芝子实体三萜酸提取物抑瘤率高，具有更好的抑制小鼠体内肝癌Heps肺瘤的生长的活性。表5本发明提取物和灵芝子实体三萜酸提取物对荷瘤小鼠免疫器官的影响比较(5±力组别提取物给药量(mg.kg".d誦1)脾指数(mg/g)胸腺指数(mg/g)空白组06.93±1.542.64±0.47环磷酰胺组203.73±1.15*1.46±0.55*本发明1406.77±0.932.49±0.88提取物组706.42±1.222.53±0.86灵芝子实体1406.81±1.302.64±0.72三萜酸提取物组707.20±1.002.61±0.61注与阴性对照组比较*P<0.05实验结果表明，本发明提取物组的脾指数和胸腺指数与空白组比较无显著性差异，即表明灵芝子实体提取物对荷瘤小鼠的免疫器官物无毒副作用，可以保持机体的免疫活性。权利要求1、一种具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物，其特征在于，其中三萜类成分的含量为30～70wt％；同时，该提取物中的有效成分还用以下方法表征用高效液相色谱条件1表征提取物，由色谱峰保留时间在80～128min之间的成分组成；用高效液相色谱条件2表征提取物，包含色谱峰保留时间为14.89～15.67min、30.74～31.35min、34.36～34.98min、37.03～37.64min、39.47～40.01min的5个成分；所述的高效液相色谱条件1为ZORBAXSB-C18柱；流动相A乙腈，B0.05％磷酸水溶液，线性梯度洗脱，0min27％A；40min27％A；60min35％A；80min45％A；90min65％A；100min75％A；110min85％A；120min100％A；128min100％A；流速1.0mL·min-1；检测波长254nm；柱温30℃；所述的高效液相色谱条件2为ZORBAXSB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A乙腈，B0.05％磷酸水溶液，线性梯度洗脱，0min60％A；25min90％A；40min100％A；45min100％A；流速1.0mL·min-1；检测波长240nm；柱温30℃。2、根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物，其特征在于，该具有抗肺瘤活性的灵芝子实体提取物是指采用以下方法制备得到的提取物(1)灵芝子实体粉碎成粗粉，过筛；(2)将灵芝子实体粗粉以乙醇为夹带剂用超临界C02萃取技术进行萃取，得到灵芝子实体粗提物乙醇溶液，减压回收溶剂，得到灵芝子实体粗提物；(3)将灵芝子实体粗提物用醋酸乙酯溶解，饱和碳酸氢钠溶液萃取，分别得到饱和碳酸氬钠层和醋酸乙酯层；(4)取醋酸乙酯层减压回收溶剂，真空干燥，得灵芝子实体抗肿瘤提取物。3、一种权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物的制备方法，其特征在于，步骤如下(1)灵芝子实体粉碎成粗粉，过筛；(2)将灵芝子实体粗粉以乙醇为夹带剂用超临界C02萃取技术进行萃取，得到灵芝子实体粗提物乙醇溶液，减压回收溶剂，得到灵芝子实体粗提物；(3)将灵芝子实体粗提物用醋酸乙酯溶解，饱和^f友酸氢钠溶液萃取，分别得到饱和碳酸氬钠层和醋酸乙酯层；(4)取醋酸乙酯层减压回收溶剂，.真空干燥，得灵芝子实体抗肿瘤提取物。4、根据权利要求3所述的具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物的制备方法，其特征在于，在所述步骤(l)中，灵芝子实体粉碎时，过1050目筛；'在所述步骤(2)中，超临界C02萃取条件为萃取压力为25MPa，萃取温度为45。C，萃取时间为1.5h，夹带剂乙醇用量为3mL.g"生药；灵芝子实体粗提物乙醇溶液回收乙醇时，温度控制在3060°C;在所述步骤(3)中，用醋酸乙酯溶解时，灵芝子实体粗提物与醋酸乙酯两者的比例为灵芝子实体粗提物质量(g):醋酸乙酯(mL)-l:10~1:100;在所述步骤(3)中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取醋酸乙酯时，萃取次数为1~8次；在所述步骤(3)中，用饱和碳酸氬钠溶液萃取醋酸乙酯时，醋酸乙酯与饱和碳酸氬钠溶液体积比为醋酸乙酯饱和碳酸氬钠溶液=1:3~3:1;在所述步骤(3)中，用饱和碳酸氬钠溶液萃取醋酸乙酯时，萃取次数为18次。5、根据权利要求4所述的具有抗胂瘤活性的灵芝子实体提取物的制备方法，其特征在于，在所述步骤(l)中，灵芝子实体粗粉过12目筛；在所述步骤(2)中，灵芝子实体粗提物乙醇溶液回收乙醇时，温度控制在50°C;在所述步骤(3)中，用醋酸乙酯溶解时，灵芝子实体粗提物与醋酸乙酯两者的比例为灵芝子实体粗提物质量g:醋酸乙酯容积mL为1:401:80;在所述步骤(3)中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取醋酸乙酯时，萃取次数为2~6次。6、根据权利要求5所述的具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，用醋酸乙酯溶解时，灵芝子实体粗提物与醋酸乙酯两者的比例为灵芝子实体粗提物质量g:醋酸乙酯容积mL为1:50。在所述步骤(3)中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取醋酸乙酯时，萃取次数为4次。7、根据权利要求4~6之一所述的具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，用饱和碳酸氬钠溶液萃取醋酸乙酯时，醋酸乙酯与饱和碳酸氢钠溶液体积比1:33:1;在所述步骤(4)中，回收醋酸乙酯溶剂和真空干燥提取物时，温度控制在3060。C。8、根据权利要求7所述的具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取醋酸乙酯时，醋酸乙酯与饱和碳酸氢钠溶液体积比为1:22:1。在所述步骤(4)中，回收醋酸乙酯溶剂和真空干燥^是:取物时，温度控制在50。C。9、根据权利要求8所述的具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，用饱和^f友酸氬钠溶液萃取醋酸乙酯时，醋酸乙酯与饱和碳酸氢钠溶液体积比为1:1。全文摘要具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物及其制备方法，其中灵芝子实体提取物中三萜类成分的含量为30～70wt％；同时提取物中含有以下方法表征的有效成分用条件1表征提取物，由色谱峰保留时间在80～128min之间的成分组成；用条件2表征提取物，包含色谱峰保留时间为14.89～15.67min、30.74～31.35min、34.36～34.98min、37.03～37.64min、39.47～40.01min的5个成分。本发明克服了现有技术使用灵芝三萜中三萜酸类成分忽略其它具有抗肿瘤活性成分利用的问题，可以更好、更充分利用灵芝药材。并大幅度减少有机溶剂产生的环境污染，保护环境。文档编号A61K36/06GK101559083SQ200910027230公开日2009年10月21日申请日期2009年5月25日优先权日2009年5月25日发明者宋师花,贾晓斌,彦陈申请人:江苏省中医药研究院