专利名称：一种从灵芝子实体中高效制备灵芝酸a的方法
技术领域：
本发明涉及一种从灵芝子实体中高效制备灵芝酸A的方法。背景资料灵芝是我国传统中药材之一，在我国具有悠久的药用历史，据《本草纲目》记载，灵芝能“治胸中结、溢心气”，“入心生血、助心冲脉”，“安神”，“保神”，“益肺气”，“益脾气”，“益精气”，“补肝气”等，可用于治疗多种疾病。我国灵芝资源丰富，据《真菌词典》第八版记载， 全世界灵芝科有100种以上，我国已知灵芝属69种，是世界灵芝科真菌物种多样性最丰富的国家之一。目前的研究表明，灵芝的化学成分有多种，主要包括三萜类、多糖类、核苷类、呋喃类衍生物、留醇类、生物碱类、多肽氨基酸类、油脂类、无机离子、有机锗等。其中，主要活性成分为三萜类和多糖类。灵芝三萜属于高度氧化的羊毛留醇烷衍生物，目前已发现近二百种三萜类存在于灵芝中，其他植物中也含有三萜类，但是灵芝所含有的特殊三萜类(或称 “灵芝酸”)为其他生物所没有。三萜类灵芝酸具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、细胞毒性、 抗HIV-I型病毒、护肝、解毒等作用，诱导NADPH的作用、改善记忆力等功能等，因而具有良好的药用前景。灵芝酸也是灵芝商品及灵芝制品质量品质保证的重要物质基础，三萜类灵芝酸含量越高，灵芝产品质量越好。目前国内外对于灵芝三萜酸的研究主要集中在构型、理化特征，生理活性以及新的三萜种类的发现，生产工艺和灵芝子实体、菌丝体，灵芝孢子等灵芝商品及各种灵芝制品的质检质控方法标准等各个方面，而要对上述各方面进行深入研究，就必须首先进行分离纯化，获得灵芝三萜化合物的纯品。目前对于灵芝酸分离纯化方面的研究工作进行得不多， 实验室中的各种三萜类物质研究的标准品制备依然存在问题；同时由于没有相应的工业化制备方法，无法将之应用于医药工业之中，严重制约了灵芝三萜类物质的研究和生产应用。现有的关于分离纯化的研究只是针对灵芝三萜类物质极少量的分离，方法主要为使用硅胶柱层析法反复分离法，薄层色谱法，制备或半制备高效液相色谱法等。硅胶柱层析法反复分离法是目前灵芝酸分离纯化最基本的方法，也是最主要的方法，但这种分离方法较为繁琐，时间较长，而且所使用的试剂都是有毒有机溶剂，所获得的产品纯度较低，不是最佳分离途径；薄层色谱法分离效率不高，产率低，难以作为常规制备的有效方法使用。制备HPLC法用于制备灵芝酸是个很好的选择，但是目前的HPLC法分析和制备多是采用梯度洗脱法，这给制备过程带来诸多不便，尤其是需要进行多次和反复制备的生产性制备，所使用的溶剂多为较为昂贵的乙腈和2%乙酸混合溶液，使得生产成本极为高昂，同时乙腈的毒性较强对操作者极为有害。另外当前的制备方法中，样品上样量较低，单次制备需要较长时间，生产效率低下。所分离的量只能满足极少实验室中某些分析、实验之用，不能为大多数的实验室，更不能为工厂所能接受。而高速逆流色谱(high-speed counter current chromatography, HSCCC)是近年来迅速发展起来的新型液-液分配色谱技术。它是一种不用任何固态支撑体或载体的液液分配层析法，能够完全排除固体载体导致的不可逆吸附和对样品的玷污、失活、变性等影响，能实现对复杂混合物中各组分的高纯度制备量分离。目前，该法已经被广泛地应用于天然产物、抗生素、食品、无机物等物质的分离与纯化，尤其是在植物活性成分的研究开发方面显示出强大的优势。而利用高速逆流色谱分离纯化灵芝三萜类化合物的研究却极少。本专利是利用高速逆流色谱设备的“制备”和可实现“色谱”行为的优势，同时结合超临界二氧化碳萃取技术对于灵芝三萜成分的高度选择性，形成从灵芝三萜类化和物中单体成分灵芝酸A的高效制备工艺，以简化操作步骤，降低制备成本，为灵芝三萜类化合物的构型、理化特征，生理活性等以及新的三萜种类的发现，生产工艺和灵芝子实体、菌丝体， 灵芝孢子等灵芝商品及各种灵芝制品的质检质控方法标准等各个方面研究提供方便，使灵芝产业发展进一步扩大推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种从灵芝子实体中高效制备灵芝酸A的方法。为实现上述目的，本发明采用以下设计方案一种从灵芝子实体中高效制备灵芝酸A的方法，它包括(1)采用超临界二氧化碳萃取装置萃取灵芝粉得超临界(SFE)萃取物。(2)配制逆流色谱的溶剂体系为氯仿甲醇水，分离上、下相，分别作为逆流色谱的固定相和流动相。( 将固定相、流动相依次泵入逆流色谱仪，使体系充分平衡。(4)将SFE 萃取物溶解于甲醇中，由逆流色谱仪进样，同时调节紫外检测器于254nm处，根据检测器谱图接收目标成分，得HSCCC分离物。其中氯仿甲醇水体系的用量体积比为14 10 7 10。 具体实施例1.将IOOOg的灵芝片经超微粉碎后，超临界二氧化碳萃取仪(HA221-50-02，江苏南通华安超临界萃取有限公司)于压力50Mpa，温度40°C条件下，萃取1. 0h，将所得萃取液于温度60°C条件下旋转蒸发浓缩至浆状，得到SFE萃取物，39. 6g。2.用高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)分离SFE萃取物上样量 15mg，甲醇溶解定容至10ml，溶剂体系及用量比为氯仿甲醇水=14 10 7 10(体积)，柱体积为300ml，转速800rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速为2ml/min，固定相保留值64. 2%，检测波长254nm。操作步骤是按各种溶剂体积比配制溶剂体系，在分液漏斗中静置分层，分离上、 下相，上相为固定相、下相为流动相。先将固定相泵入逆流色谱仪，使逆流色谱仪的柱子中充满固定相，然后将逆流色谱仪主机的转速调至800 850r/min，泵入流动相，当出液口流出下相时，继续泵液至体系充分平衡；由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分。3.将HSCCC分离物经旋转蒸发仪浓缩至浆状，约ang，经甲醇溶解后，HPLC定量分析HSCCC分离物中灵芝酸A的含量；HPLC的检测条件为安捷伦LC1200高效液相色谱仪， 灵芝酸A标准品(购自中国医学科学院药物研究所)，色谱柱Z0RBAX SB-C18(4.6X150mm, 5um)，流动相A 醋酸水溶液，B甲醇，A B = 40% 60% ；流速0. 5ml/min ；紫外吸收波长2Mnm ；柱温25°C ；进样量5ul。本发明优点本发明采用超临界二氧化碳萃取仪和高速逆流色谱仪，并配以合适的溶剂体系，具有制备时间短，制备量大，效率高等特点，分离得到灵芝酸A，纯度在95%以上。
权利要求
1.一种从灵芝子实体中高效制备灵芝酸A的方法，其特征在于它包括(1)采用超临界二氧化碳萃取装置萃取灵芝粉得SFE萃取物。( 配制逆流色谱的溶剂体系分离上、下相，分别作为逆流色谱的固定相、流动相，溶剂体系由氯仿甲醇水组成；C3)将(1)得到 SFE萃取物溶解于甲醇中，由逆流色谱仪进样，调节紫外检测器于254nm处，根据检测器谱图接收目标成分，得HSCCC分离物。
2.根据权利要求1所述的一种从灵芝子实体中高效制备灵芝酸A的方法，其特征在于 步骤O)中所述的溶剂体系氯仿、甲醇、水的体积比为14 10 7 10。
全文摘要
一种从灵芝子实体中高效制备灵芝酸A的方法，它包括(1)采用超临界二氧化碳萃取装置对灵芝粉进行萃取得SFE萃取液。(2)配制逆流色谱的溶剂体系为氯仿∶甲醇∶水，分离上、下相，分别作为逆流色谱的固定相和流动相。(3)将固定相泵入逆流色谱仪至主机出液口有液体流出，然后调转速至800r/min，泵入流动相，当出液口流出下相时，继续泵液至体系充分平衡；(4)将浆状SFE萃取物溶解于甲醇中，进样，同时调节紫外检测器于254nm处，根据检测器谱图接收目标成分。采用超临界二氧化碳萃取仪和高速逆流色谱仪，并配以合适的溶剂体系，具有制备时间短，制备量大，效率高等特点，分离得到灵芝酸A，纯度在95％以上。
文档编号C07J9/00GK102532231SQ20111044348
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者刘连强, 周永斌, 唐柳, 张志军, 李凤美, 李淑芳, 王玫, 罗莹, 訾惠君, 陈晓明, 魏雪生 申请人:天津市林业果树研究所