专利名称：：一种枇杷叶总三萜酸的制备方法及其降血糖功能的制作方法
技术领域：
：本发明涉及从中药枇杷叶中提取制备总三萜酸的方法，以及该提取物在降血糖方面的应用。
背景技术：
：糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，在中医学中属消渴症范畴，是继心血管疾病及癌症之后危害人类健康的第三大疾患。据世界卫生组织报告全球范围内糖尿病患者高达1.25亿，预计这一数字到2025年将增加到2.99亿。由于人口基数大，现在我国的糖尿病患者约3000万以上，绝对患病人数居世界首位。由丁-糖尿病具有患病率、致残率及并发症高的特点，因此己成为医学界颇为重视的一种疾病。在糖尿病的治疗中，主要是通过药物控制血糖升高和防治并发症。在治疔糖尿病的药物中，西药在降血糖方面表现突出，中药在治疗并发症方面独具特色，二者各有所长。从目前临床所用药物来看，西药都有一定的局限性和不良反应，甚至是很严重的不良反应，如导致低血糖、乳酸中毒等。因此，国内外一直很S视从大然产物尤其是药用植物(中草药)中发掘和开发降血糖效果好、副作用小、对并发症有效的药物制剂。枇杷叶是蔷薇科枇杷属植物枇杷En'oto^7aJa;w"/ca(Thunb.)Lindl.的干燥叶，是一味常用中药，收载于历版中国药典供中医临床使用。枇杷叶归肺、胃经，贝-清肺止咳、降逆止呕作用，用于治疗肺热咳嗽、气逆喘气、宵热呕逆、烦热口渴，症状。新近的研究发现从枇杷叶中分离得到的二萜酸类化学成分具有显著的降血糖活性。
发明内容本发明的目的在于提供一种枇杷叶总三萜酸的制备方法，该制备方法不仅工艺简单，得率高，而且使各三萜酸组分的得率提高。本发明的另一目的在于提供一种治疗糖尿病的植物药物制剂。1.枇杷叶总三萜酸的制备方法(1)将枇杷叶干燥粉碎。(2)用30-95%乙醇或30-95%甲醇浸渍提取，料液比h310，提取两次，每次1530天；或加热回流提取，料液比l:3~10,提取两次，每次1至5小时。(3)合并提取液，减压浓縮至含醇量《50%的低醇度浓缩液。(4)低醇度浓縮液在1500-5000转/分钟的速度下离心沉降10-30分钟，得沉淀。(5)向沉淀部分加入2-10倍量乙醇，加热使之溶解后，加入0.5-3倍量硅藻土加热回流脱色，趁热过滤，滤液减压浓縮干燥；或向沉淀部分加入2-10倍量乙醇加热溶解后加入0.5-3倍量硅藻土拌样，过硅藻土柱，拌样硅藻土与空白硅藻土比为1:1~5，乙醇洗脱，乙醇洗脱液减压浓縮干燥，得枇杷叶总三砲酸提取物。2.枇杷叶总三萜酸的质量控制方法用本发明的制备方法所得枇杷叶总三萜酸的主要有效成分为熊果酸(ursolicacid)、齐墩果酸(oleanolicacid)、马斯里酸(maslinicacid)、科罗索酸(corosolicacid)、委陵菜酸(tormenticacid)。采用高效液相色谱方法(HPLC)检测各有效成分的含量，色谱条件为色谱柱固定相碳十八烷基硅胶，流动相甲醇-0.04%磷酸溶液(88:12)，流速lml/min，检测波长208tim。按此方法检测，委陵菜酸、马斯里酸、科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸的保留时间分别为4.4min、8.9min、9.6min、15.8min、16.7min(见附图)，以重量百分比计算，枇杷叶总三萜酸中五个指标成分的总含量大于50%,其中委陵菜酸的含量应达到10-30%,马斯里酸的含量应达到4-20%，科罗索酸的含量应达到5-20%,齐墩果酸的含量应达到1-10%,熊果酸的含量应达到5-20%。3.枇杷叶总三砲酸的降血糖活性对正常小鼠、四氧嘧啶和链脲佐菌素所致的糖尿病小鼠的药效研究结果表明，本发明中的枇杷叶总二萜酸能极显著地降低正常小鼠、四氧嘧啶和链脲佐菌素糖尿病小鼠的血糖水平，提高血清胰岛素水平，提示其可用于治疗糖尿病。实验一、枇杷叶总三萜酸对正常小鼠空腹血糖的影响实验方法取正常雄性ICR小鼠(18~22g)90只，随机分为9组，分别按10ml/kg体重经口给予枇杷叶总二萜酸300mg/kg、格列齐特50mg/kg、参芪降糖颗粒2000mg/kg以及等体积的0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，每天给药1次，连续7d。末次给药时，各组禁食4h后给药，再继续禁食2h。小鼠眼眶后静脉丛取血，分离血清，以葡萄糖氧化酶法测定血糖。结果如表1所示，与正常组相比，枇杷叶总三萜酸300mg/kg和格列齐特50mg/kg均极显著地降低了正常小鼠的空腹血糖(PO.Ol)，参芪降糖颗粒2000mg/kg对正常小鼠的空腹血糖无明显影响。表lEJ-1正常小鼠空腹血糖的影响(X士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>"P<O.01vs正常组实验二、枇杷叶总三萜酸对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖和血清胰岛素的影响实验方法随机取正常雄性ICR小鼠(18~22g)IO只作为正常组，其余小鼠禁食16-17h后，尾静脉注射四氧嘧啶65mg/kg,注射后72小时眼眶后静脉丛取血，分离血清，预测血糖，选空腹血糖M2mmol/L的小鼠90只，随机分为9组，分别按10ml/kg体重经口给予枇杷叶总三萜酸300mg/kg、格列齐特50mg/kg、参芪降糖颗粒2000mg/kg以及等体积的0.5%CMC-Na，每日1次，连续给药I4天。其中，第7次给药前各组禁食4h，给药后继续禁食2h，然后小鼠眼眶后静脉丛取血，分离血清，测定血糖。末次给药前禁食4h,给药后2h,小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒方法测定血糖和血清胰岛素。结果如表2所示，与正常组相比，四氧嘧啶糖尿病小鼠的空腹血糖水平极显著升高，血清胰岛素水平极显著降低(PO.Ol)。与模型组相比，枇杷叶总三萜酸300mg/kg在给药后第7天和第14天分别显著(PO.05)和极显著(PO.01)地降低了糖尿病小鼠的空腹血糖，极显著(PO.Ol)地升高了糖尿病小鼠的血.清胰岛素水平。表2枇杷叶总三萜酸对四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖和血清胰岛素的影响(X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实验三、枇杷叶总三砲酸对链脲佐菌素糖尿病小鼠血糖和血清胰岛素的影响实验方法随机取出正常雄性ICR小鼠(18~22g)10只作为正常组，其余小鼠禁食16-17h后，尾静脉注射链脲佐菌素160mg/kg，注射后72小时眼眶后静脉丛取血，分离血清，预测空腹血糖，选空腹血糖〉12mmol/L的小鼠90只，随机分为9组，分别按10ml/kg体重经口给予枇杷叶总三萜酸300mg/kg、格列齐特50mg/kg、参芪降糖颗粒2000mg/kg以及等体积的0.5Q/。CMC-Na,每日1次，连续给药14天。其中，第7次给药前各组禁食4h,给药后继续禁食2h，然后小鼠眼眶后静脉丛取血，分离血清，测定血糖。末次给药前禁食4h，给药后2h，小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒方法测定血糖、血清胰岛素。结果如表3所示，与正常组相比，链脲佐菌素糖尿病小鼠的空腹血糖水平极显著升高，血清胰岛素水平极显著降低(PO.Ol)。与模型组相比，枇杷叶总三萜酸300mg/kg在给药后第7和14天均极显著地降低了糖尿病小鼠的空腹血糖(PO.Ol)，极显著(PO.01滩升高了糖尿病小鼠的血清胰岛素水平。表3枇杷叶总三萜酸对链脲佐菌素糖尿病小鼠血糖和血清胰岛素的影响(X±SD)组别剂量给药动物数空腹血糖(mmol/L)胰岛素(mg/kg)途径(只)第7天第14天(HlU/mL)正常组p.o106.75±0.866.60±0.7929.68±9.47模型组p.o1022.76±4.21##21.96±4,82##10.05±6.23##枇杷叶总三萜酸300p.o1013.44±3.39**11.47士3.65"18.51±2.35**参芪降糖颗粒20000p.o1018.16±5.8116.29土5.32'16.54±6.75*格列齐特50p.o916.72士5.88'15"0±4.46*15.11±3.56*尸<0.01ra正常组；'PO.05,"iM).Olw模型组附图为本发明方法制备的枇杷叶总三萜酸样品的HPLC图，其中保留时间为4.4min、8.9min、9.6min、15.8min、16.7min对应的组分分别为委陵菜酸、马斯里酸、科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸。具体实施例方式实施例l:干燥枇杷叶l.Okg粉碎成粗粉，依次用80。/q乙醇8L，6L冷浸两次，每次15天，合并浸渍液合并，减压浓縮至醇度约30%的浓縮液，冷却，置离心机沉降离心(转速4000转/分钟，15分钟)，得沉淀46g，加入95。/。乙醇230ml加热溶解，再加92g硅藻十拌样，取92g硅藻土装柱，上样后，以95%乙醇2000ml洗脱，洗脱液合并，减压回收乙醇，蒸干，得淡黄色粉末35g，即为枇杷叶总三萜酸提取物。枇杷叶总n萜酸提取物经HPLC分析，委陵菜酸2].7%，马斯里酸10.5%，科罗索酸13.6%，齐墩果酸3.1%，熊果酸10.6%。实施例2:干燥枇杷叶l.Okg粉碎成粗粉，依次用80。/。乙醇6L，4L加热回流提取2次，合并提取液，减压浓縮至醇度约20%的浓縮液，冷却，置离心机沉降离心(转速2000转/分钟，15分钟)，得沉淀41g，加入95。/。乙醇205ml加热溶解，再加41g硅藻土拌样，取82g硅藻土装柱，上样后，以95%乙醇2000ml洗脱，洗脱液合并，减压回收乙醇，蒸干，得淡黄色粉末32g,即为枇杷叶总三萜酸提取物。枇杷叶总三萜酸提取物经HPLC分析，委陵菜酸20.9%,马斯里酸10.1%，科罗索酸14.2%，齐墩果酸3.0%，熊果酸8.9%。实施例3:干燥枇杷叶l.Okg粉碎成粗粉，依次用80。/。乙醇6L，4L加热回流提取2次，合并提取液，减压浓縮至醇度约20%的浓縮液，冷却，置离心机沉降离心(转速2000转/分钟，15分钟)，得沉淀43g，加入95。/。乙醇2]5ml加热溶解，再加43g硅藻土拌样，加热回流脱色，趁热过滤，减压回收乙醇，蒸干，得淡黄色粉末34g，即为枇杷叶总三萜酸提取物。枇杷叶总二萜酸提取物经HPLC分析，委陵菜酸18.3%,马斯里酸10.4%，科罗索酸14.7%,齐墩果酸2.6%，熊果酸8.9%。权利要求1.一种从枇杷叶中提取和制备总三萜酸的方法，根据该方法所制备的总三萜酸具有显著的降血糖功能。2.根据权利要求1所述的枇杷叶总三萜酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤枇杷叶经30-95%乙醇或30-95%甲醇浸渍提取或加热回流提取，除醇后得到低醇度浓縮液，浓縮液经高速离心，分离，得沉淀，沉淀经乙醇溶解、硅藻土回流或拌样后柱层析脱色，得枇杷叶总三萜酸提取物。3.根据权利要求1所述的枇杷叶总三萜酸，其特征在于按重量百分比计算，五个指标成分熊果酸(ursolicacid)、齐墩果酸(oleanolicacid)、马斯里酸(maslinicacid)、科罗索酸(corosolicacid)、委陵菜酸(tormenticacid)的总含量大于50%，其中委陵菜酸的含量应达到10-30%，马斯里酸的含量应达到4-20%，科罗索酸的含量应达到5-20%,齐墩果酸的含量应达到1-10%，熊果酸的含量应达到5-20%。4.根据权利要求1所述的枇杷叶总三萜酸具有显著的降血糖功能，可以直接i^用^"治疗糖尿病或作为治疗糖尿病药物制剂的原料。全文摘要本发明涉及一种枇杷叶总三萜酸的制备方法及其降血糖功能，制备方法包括将干燥枇杷叶经一定浓度乙醇或甲醇提取后，回收至低浓度醇沉降，离心，沉淀用硅藻土回流脱色，或经硅藻土柱层析、乙醇洗脱后减压回收，干燥得到总三萜酸。该总三萜酸中熊果酸(ursolicacid)、齐墩果酸(oleanolicacid)、马斯里酸(maslinicacid)、科罗索酸(corosolicacid)、委陵菜酸(tormenticacid)的总含量达50％(以重量计)以上，其中委陵菜酸的含量应达到10-30％，马斯里酸的含量应达到4-20％，科罗索酸的含量应达到5-20％，齐墩果酸的含量应达到1-10％，熊果酸的含量应达到5-20％。本发明方法制备的枇杷叶总三萜酸，可应用于治疗糖尿病或制备治疗糖尿病及其并发症的药物制剂。文档编号A61K36/73GK101224246SQ200810018820公开日2008年7月23日申请日期2008年1月25日优先权日2008年1月25日发明者寒吕,李维林,剑陈申请人:江苏省中国科学院植物研究所