白肉灵芝提取物的制备抗病毒药物的用途及抗病毒药物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种白肉灵芝提取物的新用途，具体涉及一种白肉灵芝提取物的用于制备抗病毒药物的用途。本发明的有益效果是：本发明提供一种白肉灵芝的新用途，能有效抑制疱疹病毒，用于制备抗病毒药物特别是用于制备抗疱疹病毒药物，具有很好的药用价值。CCTCC NO：M201608720160307
【专利说明】
白肉灵芝提取物的制备抗病毒药物的用途及抗病毒药物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种白肉灵芝提取物的新用途，具体涉及一种白肉灵芝提取物的抗病 毒用途。
【背景技术】
[0002] 灵芝(Ganoderma)在中国有悠久的药用历史，长期被人们用于气管炎、肝炎、高血 压、肿瘤、免疫力紊乱等病症的辅助治疗。现代的药理和临床研究结果也表明灵芝含有抑制 肿瘤和调节免疫的活性成分。自D0NK(1948)建立灵芝科(Ganodermataceae)以来，目前全世 界已报道的灵芝科大型真菌共200余种，我国有记载的灵芝有103种，其中14种已被人们所 利用。目前在国内应用广泛的品种包括赤芝（Ganoderma lucidum)，紫芝（Ganoderma sinense)等，灵芝属的许多其它种类也具有类似的效果，值得进一步研究。
[0003] 单纯疱疹病毒(Herpes simple Virus，HSV)是一个发病率高、全球广泛分布的人 类疱疹病毒，人类是唯一的天然寄主。感染后可以造成皮肤、口腔和生殖器等部位的原发/ 复发性疱疹，出现皮肤溃疡、丘疹、炎症等现象。单纯疱疹病毒属于疱疹病毒科中的α-疱疹 病毒亚科，有HSV-1和HSV-2两个血清型。HSV病毒颗粒由内核、衣壳、被膜和囊膜组成。HSV-1 主要感染躯体上半部，典型症状为口腔疱疹、疱疹性角膜炎脱落和疱疹性脑炎。免疫缺陷者 或新生儿被感染会导致严重疾病如中枢神经系统疾病。HSV-1导致的脑炎若不及时治疗可 能会危及生命。抗HSV药物经历50多年的发展，早期的抗HSV药物以碘苷为代表，其选择性 低，对正常细胞毒性大。现在临床上用于治疗HSV的药物常为阿昔洛韦(ACV，ac ycl〇Vir)，但 因其抗病毒谱窄，易产生耐药性且价格昂贵，严重的限制了临床应用。
【发明内容】
[0004] -方面，本发明提供一种白肉灵芝提取物的用于制备抗病毒药物用途。
[0005] 优选的，上述提取物为有机溶剂提取物。
[0006] 优选的，上述提取物为醇提取物，进一步优选为乙醇提取物。
[0007] 优选的，上述病毒为疱疹病毒，进一步优选为HSV病毒，例如HSV-1病毒。
[0008] 优选的，上述白肉灵芝为白肉灵芝Ganoderma leucocontextum HMGIM-Z110122， 保藏编号为CCTCC NO: Μ 2016087。
[0009] 本发明上述的白肉灵芝采自西藏林芝地区波密县扎西岗乡的阔叶林中，经鉴定为 白肉灵芝新菌种，并且组织分离获得原始菌株，命名为白肉灵芝Ganoderma leucocontextum HMG頂-Z110122,已于2016年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心（简 称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山），保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2016087)。
[0010] 上述白肉灵芝CCTCC Μ 2016087新菌种的栽培方法，包括组织分离菌种后制作母 种，制作原种，制作生产种，栽培培养及出芝管理。
[0011] 在一个优选的实施例中，上述白肉灵芝新菌种的栽培方法中制作母种的培养基为 综合PDA培养基，所述综合PDA斜面的配方按质量百分比计为马铃薯18-20%、葡萄糖1.5-2%、琼脂2-2.5%、磷酸二氢钾0.15-0.3%、硫酸镁0.05-0.15%、维生素 B1微量，其余为水。
[0012] 在一个优选的实施例中，上述白肉灵芝新菌种的栽培方法中制作原种的原种料的 原料组成按质量百分比计为高粱75-79%、小米16-20%、CaC0 3l-2%、含水量55-60%。
[0013] 在一个优选的实施例中，上述白肉灵芝新菌种的栽培方法中制作生产种的生产种 料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳87-89%、麸皮10-12%、CaC0 3l-2%或棉籽壳48-52%、木肩25-30%、麸皮18-20%、碳酸钙1-2%、硫酸钙1-2%，含水量55-60%。
[0014] 在一个优选的实施例中，上述白肉灵芝新菌种的栽培方法中栽培料的原料组成按 质量百分比计为木肩75-78%、麸皮20-22%、CaC0 3l-2%，含水量60-65%
[0015]本发明提供一种优选的白肉灵芝CCTCC Μ 2016087新菌种的栽培方法，包括以下 步骤：
[0016] (1)制作母种:采集组织分离的菌种白肉灵芝，将菌种无菌接至综合roA斜面，置于 20-25Γ培养箱中恒温暗培养，直至菌丝长满斜面即得生产母种，其中所述综合TOA斜面的 配方按质量百分比计为马铃薯18-20%、葡萄糖1.5-2%、琼脂2-2.5%、磷酸二氢钾0.15_ 0.3%、硫酸镁0.05-0.15%、维生素 B1微量，其余为水；
[0017] (2)制作原种：将生产母种无菌接入原种袋中，置于25°C培养箱中恒温暗培养，至 菌丝吃满料后即得原种，其中原种料的原料组成按质量百分比计为高粱75-79%、小米16_ 20%、0&0)31-2%、含水量55-60%，将所述原种料装入菌种袋中，制得原种袋 ；
[0018] (3)制作生产种：将原种无菌接入生产种袋中，置于25°C培养箱中恒温暗培养，至 菌丝吃满料后即得生产种，其中生产种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳87-89%、麸 皮10-12%、CaC03l-2%或棉籽壳48-52%、木肩25-30%、麸皮18-20%、碳酸钙1-2%、硫酸 钙1-2%，含水量55-60%，将所述将生产种料装入菌种袋中，制得生产种袋；
[0019] (4)接种栽培:将生产种无菌接入栽培料袋中，在25°C±rC培养室中避光培养，待 栽培袋中的菌丝长满栽培料后，继续遮光后熟培养至菌丝完成后熟期，其中栽培料的原料 组成按质量百分比计为木肩75-78 %、麸皮20-22 %、CaC03l-2%，含水量60-65 %，将所述栽 培料装入菌种袋中，制得栽培袋；
[0020] (5)出芝管理：调节温度为20-21°C、湿度85-90%、光照100-2001UX，不通气，保持 C〇2含量在2000ppm以上至长出原基，调整温度为26-28°C、空气相对湿度85-90%、光照约 200-3001ux，不通气，继续保持C0 2含量在2000ppm以上，待菌柄伸长期结束并进入菌盖生长 期时，通气，调整温度为26-28°C，湿度85-95 %，光照300-5001ux，通气，保持⑶2含量小于 1200ppm，至菌盖的白边完全变黄时，采摘。
[0021] 优选的，上述步骤(4)中的培养室的空气相对湿度为60-70%。
[0022] 本发明的白肉灵芝CCTCC Μ 2016087子实体具有以下的形态特征和外观特征： [0023] 菌盖10-20*5-10cm,近柄处厚2_3cm，扇形或半圆形扇形，大部分红至红褐色，幼嫩 时及成熟时边缘白至浅黄色，渐变黄至红褐色，成熟后接近菌柄部分呈暗红褐色、暗紫红褐 色或几乎黑红褐色，具漆样光泽，具同心环纹，常有弱的放射状皱纹。
[0024] 孔口表面新鲜时白色至奶油色，受伤处带褐色至褐色。孔口近圆形，每毫米4-6个。 菌管长达4-6_，不分层，赭色到淡灰褐色或灰褐色。
[0025]菌肉厚达2.2cm，白色，干后白至近白色或微带奶油色，软木栓质至木栓质，近表皮 有一薄的带褐色紧密层(皮壳）。
[0026] 菌柄5-8*3.5-5.5cm，圆柱形至略扁，侧生至偏生，有时近无柄，暗红褐色至暗紫褐 色，具光泽，内部白色。
[0027] 孢子广椭圆形，顶端平截，浅褐色，双层壁，内壁具小刺，非淀粉质，包括最外孢层 时为9.5-12.5*7-9μπι，不包括最外孢层时为8.0-9.0*5-6.5μπι。
[0028] 本发明的另一方面还提供一种抗病毒药物，包括上述的白肉灵芝提取物和药学上 可接受的载体。
[0029] 本发明的有益效果是:本发明提供一种白肉灵芝的新用途，能有效抑制疱疹病毒， 用于制备抗病毒药物，特别是用于制备抗疱疹病毒药物，具有很好的药用价值。
【附图说明】
[0030] 图1是实施例1的白肉灵芝的栽培得到的子实体图。
【具体实施方式】
[0031] 以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0032] 实施例1:
[0033]白肉灵芝(CCTCC Μ 2016087)的人工栽培方法，包括以下步骤：
[0034] 1)按质量百分比计为马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁 0.15 %及微量维生素 Β1、其余为水的原料组成常规制作综合PDA斜面，0.1 IMPa大气压、121 °C高温高压湿热灭菌30min;
[0035] 2)按质量百分比计为高粱78%、小米20%、CaC032%的原料组成，含水量60%，制 作原种料，将原种料装入13cmX25cm的耐高温透明聚丙烯菌种袋中，用小木棒在袋料中打 洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑料环，并扣上配套的盖子，制得原种袋，折合每原种袋装干 料300g;
[0036] 3)按质量百分比计为棉籽壳89%、麸皮10%、CaC03l %的原料组成，含水量55%， 制作生产种料，将生产种料装入15cmX3〇Cm的耐高温透明聚丙烯菌种袋中，用小木棒在袋 料中打洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑料环，并扣上配套的盖子，制得生产种袋，折合每生 产种袋装干料350g;
[0037] 4)按质量百分比计为木肩78%、麸皮20%、CaC032%的原料组成，含水量60%，制 作栽培料，将栽培料装入17cmX 35cm的耐高温透明聚丙烯菌种袋中，用小木棒在袋料中打 洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑料环，并扣上配套的盖子，制得栽培袋，折合每袋装干料 500g；
[0038] 5)制作母种:采集组织分离的菌种白肉灵芝CCTCC Μ 2016087,将菌种无菌接至综 合PDA斜面，置于25°C培养箱中恒温暗培养，直至菌丝长满斜面(约7天左右）即得生产母种；
[0039] 6)制作原种:将生产母种无菌接入原种袋中，接种时确保母种料块埋入原种料中， 然后置于25°C培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后(约25天左右）即得原种；
[0040] 7)制作生产种:将原种无菌接入生产种袋中，置于25°C培养箱中恒温暗培养，至菌 丝吃满料后即得生产种；
[0041 ] 8)接种栽培:将生产种无菌接入栽培料袋中，在25 °C ± 1°C、空气相对湿度60-70 % 的培养室中避光培养，待栽培袋中的菌丝长满栽培料后(大约30-35d)，继续遮光后熟培养 15d至菌丝完成后熟期，切下套环及老种块；
[0042] 9)出芝管理：调节温度为20-2TC、湿度85-90%、光照100-20011^，不通气，保持 C〇2含量在2000ppm以上至长出原基，调节温度为26-28°C、空气相对湿度85-90%、光照约 200-3001ux，不通气，继续保持C02含量在2000ppm以上，待菌柄伸长期结束并进入菌盖生长 期时，通气，调整温度为26-28°C，湿度85-95 %，光照300-5001ux，通气，保持⑶2含量小于 1200ppm，至菌盖的白边完全变黄时，采摘。
[0043] 本实施例栽培得到的白肉灵芝如图1所示。
[0044] 实施例2:抗病毒试验
[0045] 1、试剂及仪器
[0046] 非洲绿猴肾细胞（African green monkeykidney，Vero)(ATCC CCL-81TM)来源于 美国菌种保藏中心(ATCC);
[0047] HSV-1 病毒受赠于COHEN和EISENBERG(University of Pennsylvania)，保存于中 国科学院广州生物医药与健康研究院实验室；
[0048] Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)培养液、胰酶和乙二胺四乙酸(EDTA); 组织培养板;胎牛血清(FBS);噻唑蓝(MTT)二甲基亚砜(DMS0)均为商购；
[0049] Olympus 1X71显微镜;Synergy HT多功能微孔板检测仪。
[0050] 2、试验方法
[00511 2.1乙醇提取物的获得:将待提取样品以粉碎机粉碎后，用95 %乙醇在80 °C回流提 取3小时、2小时及1小时，合并三次滤液经旋转蒸发浓缩至膏状，60°C以下烘干，得到待提取 样品的乙醇提取物。
[0052] 2.2非洲绿猴肾细胞细胞(代仰细胞)培养:加入10%质量百分比的?83至01^1培养 液中，接种非洲绿猴肾细胞至培养液中，接种浓度为每毫升1.5 X 105个，将接种的细胞悬液 再接种于96孔组织培养板上，每孔100yL，置于37 °C、5 % C02的组织培养箱中培养24h;
[0053] 2.3病毒抑制率测定方法：
[0054]将待侧样品的乙醇提取物用DMEM培养液倍比稀释成5个浓度(分别为5000ug/ml、 2500ug/ml、1250ug/ml、625ug/ml和312 · 5ug/ml)，得到稀释好的样品液，阳性对照ACV为 12.5ug/ml浓度的抗病毒药物阿昔洛韦，），阴性对照为不加入提取物的培养液(空白溶剂）。 [0055]取对数生长期且生长状态良好的Vero细胞以1.5 X104个/孔的密度接种96孔细胞 培养板，过夜培养，至长成细胞单层。
[0056] 将病毒HSV-1用DMEM培养液稀释成0.5M0I/50ul溶液。向上述得到的细胞单层中分 别加入稀释好的样品液或对照，每孔加入50ul，随后立即加入稀释好的病毒液，每孔50ul。 轻轻振荡均匀。37 °C、5 % C02培养箱培养24h后进行β-Gal糖苷酶活性检测。
[0057] β-Gal糖苷酶活性检测：吸弃混合液，每孔加入100ul 1 %NP40细胞裂解液，放置5- 10min，中途十字振荡三次。每孔吸取50ul裂解物加到96孔酶标板或96孔细胞培养板上，随 后加入50ul的β-Gal活性检测底物缓冲液，轻轻振动混匀。超级酶标仪上进行570nm动态光 吸收的测定。测定条件为37°C，测570nm光吸收值，每2min读数一次，连续25次读数，中途振 荡。结果单位为milli-optical density units per min(m0D/min)。根据公式计算每个浓 度样品乙醇提取物对病毒的抑制率：
[0058] 抑制率=(阴性对照孔测量值一样品孔测量值)/阴性对照孔测量值X 100%
[0059] 利用SPSS19的probit regression计算样品乙醇提取物对HSV-1病毒的半数抑制 浓度IC50。
[0060] 3、抑制病毒试验：
[0061] 本实施例的样品分别为：
[0062] 样品1:实施例1栽培得到的白肉灵芝Ganoderma leucocontextum;
[0063] 样品2:商购的灵芝Ganoderma lingzhi(广东粵微）；
[0064] 样品3:人工栽培得到的赤芝Ganoderma lucidum
[0065] 样品4:人工栽培得到的重伞灵芝Ganoderma multipileum
[0066] 样品5:人工栽培得到的铜色灵芝Ganoderma cupreum。
[0067] 采用2.1的乙醇提取物的方法分别对样品1至样品5分别进行乙醇提取物的提取， 得到样品1至样品5的乙醇提取物。
[0068] 采用2.2的方法对￥6仰细胞进行培养，再将批￥_1病毒和培养的￥6仰细胞共培养 72h后，收集细胞于-80°C保存。
[0069]采用2.3的方法测定病毒抑制率，计算得到各样品乙醇提取物的半数抑制浓度 IC50,结果如表1所示。
[0070] 表1:5个样品的乙醇提取物的IC50结果
[0071]
[0072]表1可以发现，本发明的白肉灵芝乙醇提取物对HSV-1的半数抑制浓度显著低于灵 芝和赤芝的乙醇提取物及其他的重伞灵芝及铜色灵芝等的乙醇提取物，与其他四个样品相 比，本发明的白肉灵芝乙醇提取物均显示出更强的对HSV-1的抑制性能，这表明，白肉灵芝 乙醇提物抗HSV-1病毒的活性远大于赤芝、灵芝、重伞灵芝及铜色灵芝等乙醇提取物的抗 HSV-1病毒的活性。
[0073]以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 白肉灵芝提取物的用于制备抗病毒药物的用途。2. 根据权利要求1的所述的白肉灵芝提取物的用于制备抗病毒药物的用途，其特征在 于，所述提取物为有机溶剂提取物。3. 根据权利要求2的所述的白肉灵芝提取物的用于制备抗病毒药物的用途，其特征在 于，所述提取物为醇提取物。4. 根据权利要求3所述的白肉灵芝提取物的用于制备抗病毒药物的用途，其特征在于， 所述醇为乙醇。5. 根据权利要求1至4中任一权利要求所述的白肉灵芝提取物的用于制备抗病毒药物 的用途，其特征在于，所述病毒为疱疹病毒。6. 根据权利要求5所述的白肉灵芝提取物的用于制备抗病毒药物的用途，其特征在于， 所述疱疹病毒为HSV病毒。7. 根据权利要求6所述的白肉灵芝提取物的用于制备抗病毒药物的用途，其特征在于， 所述疱疹病毒为HSV-1病毒。8. 根据权利要求1至权利要求7中任一权利要求所述的白肉灵芝提取物的用于制备抗 病毒药物的用途，其特征在于，所述白肉灵芝为白肉灵芝Ganoderma leucocontextum HMG頂-Z110122,保藏编号为CCTCC Μ 2016087。9. 根据权利要求8所述的白肉灵芝提取物的用于制备抗病毒药物的用途，其特征在于， 所述白肉灵芝的栽培方法包括组织分离菌种后制作母种，制作原种，制作生产种，栽培培养 及出芝管理。10. -种抗病毒药物，包括如权利要求1-9中任一权利要求所述的白肉灵芝提取物和药 学上可接受的载体。
【文档编号】A61K36/074GK105832777SQ201610246680
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】胡惠萍, 谢意珍, 黄龙花, 李向敏, 刘远超
【申请人】广东省微生物研究所, 广东粤微食用菌技术有限公司