专利名称：一种诱导型shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于功能基因组学研究领域，涉及一种慢病毒表达载体，尤其是一种诱导型shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。近几年来RNAi研究取得了突破性进展。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭目的基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。为了成功地实现RNAi，首先要获得有效的siRNA。RNAi的核心需要siRNA对相应mRNA进行有效的结合和作用。siRNA的设计可以通过检索,优先选用经过验证的siRNA或设计多对siRNA，同时设置阴性对照(排除非特异沉默现象)和阳性对照(确认整个实验体系的有效性)。体外化学合成siRNA最方便的，包括在体外合成相应序列的RNA片段，退火形成双链，再转入细胞内。化学合成方法的主要缺点是价格高，定制周期长。对化学合成法的改进是体外转录法。即合成相应的DNA链，在体外转录成相应的RNA。这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比较高的筛选siRNA的方法并且这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNA。以上两种方法都是先合成一定量的siRNA产物，在通过转染等方式进入细胞发挥作用。它们的共同缺点是，随着进入细胞内siRNA的降解，RNA干扰作用很快消失。·为了克服上两种方法的缺点，研究人员构建了 siRNA表达载体，转入细胞或体内表达成小发夹RNA (shRNA)，在Dicer酶的作用下形成siRNA。siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法一带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久，因此这种方法在生物学研究中得到广泛应用。随着RNAi技术的发展，研究人员经常需要shRNA能够可控地在细胞中表达，即诱导型表达。常用的诱导型表达载体为四环素诱导型表达载体。这类载体采用了一种四环素操纵子(Tet Operator, TetO)调控系统。当四环素阻遏蛋白(TetR)存在时，它能有效地结合TetO位点(或称为四环素应答元件)，从而阻止转录起始，当加入四环素(Tc)或其类似物强力霉素Dox (doxycycline)后,它能改变TetR蛋白的构像,这种改变导致TetR蛋白从TetO位点被释放出来，解除了对启动子的转录阻遏，使得siRNA得以表达，并且这种表达为四环素或其类似物剂量依赖的。但是采用这种载体系统，需要TetR表达载体的配合，研究者需要事先用TetR表达载体转染细胞以得到TetR稳定表达细胞株。因而对于绝大多数可诱导性系统，四环素诱导shRNA细胞株的设立需要分两阶段:第一，四环素阻遏蛋白(TetR)由任何转染或转导方法，被引入目标细胞株，筛选最高TetR表达的稳定细胞克隆；第二，向表达TetR的稳定细胞株转染/转导入四环素诱导的shRNA载体。使用这样的系统，通常需要筛选多个克隆细胞，以确定哪些细胞株已经取得成功转录，操作上比较困难。
因而，本领域亟需操作简单的诱导型shRNA表达载体系统，在引入细胞后，可通过四环素的存在与否(或剂量)来控制shRNA的表达，从而影响到目的基因的表达。
发明内容
本发明提供了一种诱导型shRNA慢病毒表达载体，其引入细胞后，可通过四环素或其衍生物强力霉素的存在与否来控制shRNA的表达，也可以通过四环素或其衍生物的剂量来控制shRNA的表达，从而影响到目的基因的表达。在没有四环素或其衍生物的情况下，shRNA表达是被持续性表达的TetR蛋白所抑制，在添加了四环素或其衍生物时，shRNA表达抑制被解除，导致了目的基因被抑制。这个调控系统可以大量产生稳定的感染细胞群，而无需生成和筛选个体克隆细胞，同样，只要用含有强力霉素的饮用水喂养动物，就可以在肿瘤异种移植中在体内诱导shRNA表达。本发明的诱导型shRNA慢病毒表达系统的优异且简便的功能，可用于诱导性基因沉默，并进行功能性缺失表型研究。本发明提供的诱导型shRNA慢病毒表达载体，包含:
a)shRNA表达框；所述shRNA表达框包含第一启动子、能与四环素阻遏蛋白结合的四环素应答元件、TATA盒和shRNA编码序列，其中当四环素应答元件未与四环素阻遏蛋白(tetR)结合时，第一启动子能够驱动所述shRNA编码序列的表达；
b)四环素阻遏蛋白表达框；所述四环素阻遏蛋白表达框包含第二启动子、四环素阻遏蛋白表达基因、内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列和标记基因。如上所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体,优选的是,所述第一启动子为RNA聚合酶III启动子。
更优选的是，所述RNA聚合酶III启动子为Hl启动子(SEQ ID I)或U6启动子(SEQ ID 2)。在上述任意方案中，优选的是，所述第二启动子为组成型启动子；所述组成型启动子在细胞中可起始四环素阻遏蛋白TetR编码序列的转录，从而在细胞内稳定生成四环素阻遏蛋白，并维持一定水平的四环素阻遏蛋白。在不存在四环素或其衍生物如强力霉素(Dox)时TetR与shRNA表达框中的TetR结合元件结合，阻止了第一启动子起始shRNA编码序列的转录，抑制了 shRNA的生成。因此，这种情况下，细胞内该shRNA目的基因的表达不被抑制。当向细胞培养基中加入四环素或其衍生物如强力霉素(Dox)时，这些脂溶性小分子可进入细胞核中与TetR结合，改变其构象，使其脱离shRNA表达框中的TetR结合元件，解除了对第一启动子的抑制作用，使第一启动子得以起始shRNA编码序列的转录，生成shRNA。该shRNA经细胞内Dicer处理后，形成siRNA，最终抑制了其目的基因的表达。更优选的是,所述组成型启动子为PGK启动子。在上述任意方案中，优选的是，所述标记基因为I3URO (SEQ ID 5)或ΝΕ0.本发明的另一目的，是提供一种诱导型shRNA慢病毒表达载体的构建方法；所述诱导型shRNA慢病毒表达载体的构建方法，步骤如下:
0.通过限制性内切酶从慢病毒载体中切除聚合酶III启动子，切除启动子后的载体骨架经纯化回收；
2).化学合成第一启动子，以合成的启动子为模板进行扩增，并引入四环素应答元件TRE序列、TATA盒序列和限制性内切酶酶切位点,产物经限制性内切酶消化后,进行纯化；3).步骤I)中的载体骨架与步骤2)中的纯化后的第一启动子进行连接，得到载体骨架 PKG ；
4).化学合成TetR融合蛋白的DNA序列(SEQID 3)，扩增引入酶切位点，即产生TetR的二联体。5).将步骤4)中所得TetR的三联体和步骤3)中所得载体骨架pKG 分别经酶切消化，将酶切消化后的TetR的三联体紧接PGK启动子的下游插入到经酶切消化后的表达载体骨架pKG 中，即可得到pKG -3xTetR ;其中，克隆的TetR序列由Clal和為al确定正确方向。6).内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列由化学合成(SEQ ID 4)并由聚合酶链反应扩增并引入酶切位点；
7).将步骤6)所得内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列和步骤5)中所得pKG -3xTetR分别经酶切消化，然后，将酶切消化后的内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列插入到经酶切消化后的pKG -3xTetR载体中，经DNA测序可证实该表达载体的正确序列。8).化学合成带有酶切位点的shRNA编码序列，可根据不同目的基因设计不同的shRNA编码序列，如特异性抑制癌基因PIK3CA的shRNA编码序列(SEQ ID 6)和特异性抑制癌基因KRAS基因的shRNA编码序列(SEQ ID 7)。9).将步骤8)中所得shRNA编码序列和步骤7)中所得表达载体分别经酶切消化后，分别进行纯化，然后，将纯化后的shRNA编码序列通过链接酶与纯化后的表达载体进行链接，得到本发明的诱导性shRNA慢病毒表达载体。所有阳性克隆由DNA测序证实shRNA的存在及正确序列。
上述方案中，优选的是，步骤I)中所述慢病毒表达载体为通过多步亚克隆改造含有表达载体的基本序列、多克隆位点序列、启动子序列和选择标记基因序列的慢病毒表达载体。更优选的是，所述多克隆位点包括Xhol酶切位点、Notl酶切位点、BglII酶切位点、Xbal酶切位点、BamHl酶切位点、EcoRl酶切位点、CZa I酶切位点和Zaa I酶切位点。更优选的是所述启动子为PGK启动子；所述选择标记基因为Pure或Neo。上述任意方案中，优选的是，步骤I)中所述限制性内切酶为为Xhol和Notl。上述任意方案中，优选的是，步骤I)中所述纯化回收方法为琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶萃取试剂盒(Qiagen)纯化回收。上述任意方案中，优选的是，步骤2)中所述第一启动子为四环素(Tet)诱导性聚合酶III启动子。更优选的是，所述聚合酶III启动子为Hl启动子(SEQ ID I)或U6启动子(SEQID 2)。上述任意方案中，优选的是，步骤2)中所述扩增为聚合酶链反应(PCR)技术扩增。上述任意方案中，优选的是，步骤2)中所述限制性内切酶切位点为限制性内切酶Xhol和Afoil酶切位点；所述限制性内切酶消化为限制性内切酶通ol和Afoil酶消化。上述任意方案中，优选的是，步骤2)中所述纯化为琼脂糖凝胶电泳凝胶纯化。上述任意方案中，优选的是，步骤4)中所述扩增为聚合酶链反应(PCR)技术扩增。上述任意方案中，优选的是，步骤4)中所述酶切位点为BglII和Xbal酶切位点；步骤5)中所述酶切消化是经BglII和Xbal酶切消化。上述任意方案中，优选的是，步骤6)中所述酶切位点为酶切位点，步骤7)中所述酶切消化为BamHl酶切消化。上述任意方案中，优选的是，步骤8)中所述酶切位点为及和通Ol酶切位点，步骤9)中所述酶切消化为和通ο I酶切消化。上述任意方案中，优选的是，步骤8)中所述shRNA编码序列为抑制癌基因PIK3CA的shRNA编码序列(SEQ ID 6)和抑制癌基因KRAS的shRNA编码序列(SEQ ID 7)。本发明还提供上述诱导型shRNA慢病毒表达载体在细胞里做基因功能缺失的研究方面的应用。pKG系统与传统的基因敲除方法相比，是一个更简单，而且具有诱导性的研究功能性缺失表型的方法，可用于诱导性基因沉默，并进行功能性缺失表型研究。本发明还提供上述诱导型shRNA慢病毒表达载体在构建shRNA文库方面的应用。随着各种模式生物体基因组计划的完成，研究人员可以非常方便地从大规模数据库中获得全基因组序列，从而找到感兴趣基因的序列，据此设计出使该基因沉默的dsRNA，这是研究疾病机理和鉴定候选药靶的关键步骤，也为将来可控地打开或关闭某一特定疾病相关基因奠定基础，为疾病的治疗开辟了新途径。由于本发明shRNA慢病毒表达载体简单高效，本领域技术人员可想到的是，利用该表达载体来高通量筛选针对目的基因的功能性shRNA，并进一步构建shRNA文库。本发明还提供上述诱导型shRNA慢病毒表达载体在肿瘤基因治疗药物方面的应用。在一方面，本发明的诱导型shRNA慢病毒表达载体可用于shRNA目的基因功能的研究，探寻特定疾病的药物靶点，另一方面，采用针对特定疾病基因的shRNA，本发明的诱导型shRNA慢病毒表达载体本身可能作为治疗疾病尤其是癌症的药物。本发明的诱导型shRNA慢病毒表达载体在单一载体下，包含了四环素阻遏蛋白表达序列以及诱导型shRNA表达序列`。与现有的诱导型shRNA表达载体相比，本发明的表达载体的优点包括:1、用单个载体即可迅速地在多种细胞株里建立诱导性shRNA表达来沉默基因；2、不需要细胞的克隆选择；3、可在细胞的体外培养和体内研究中使用。除非另有说明，本文中使用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。用在本文时“ RNAi ”指由RNA介导的基因沉默现象，更具体地，指由双链RNA(dsRNA)介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。长度为21 23nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称之为小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)。在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与双链RNA结合，并将其剪切成21 23nt及3’端突出的小分子RNA片断，即siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复合体(RNA-1nduced silencing complex, RISC)结合,解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。用在本文时，“shRNA”指小单链RNA，其5’段和3’端的RNA序列互补，可形成茎环结构(含19 29nt的茎和3 9nt的环)，在细胞内经Dicer处理也形成21 23nt的siRNA。该siRNA的一条链(正义链)的序列与待抑制目的基因序列或其mRNA的一部分相同，序列特异地发挥RNA干扰作用。
用在本文时，“shRNA编码序列”指编码该shRNA的DNA序列，在其两末端一般具有限制性位点，用于插入本发明的表达载体中。用在本文时，“慢病毒载体(Lentiviral vector) ”主要指在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞质中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA,回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生RNA干扰。慢病毒载体介导的基因表达或RNA干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。用在本文时，“shRNA目的基因”指本发明表达载体shRNA表达后所抑制的基因。一般根据shRNA目的基因序列或其mRMA来设计适合的shRNA编码序列，这在本领域为技术人员所公知，或者一些公司可为研究人员提供适合的shRNA编码序列。用在本文时,“表达框(expression cassette) ”指表达载体上一段相对独立的可表达序列，一般由一个或多个待表达基因和控制其表达的序列构成。通常，表达框包括三个部分:启动子、开放阅读框和3’端不翻译区，在真核细胞中，该3’端不翻译区一般为多聚腺苷酸位点。
图1为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体技术示意原理图。图2为按照本发·明诱导型shRNA慢病毒表达载体shRNA表达被抑制图示。图3为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体shRNA表达恢复图示。图4为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体体外沉默癌基因PIK3CA实验结
果O图5为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体体内沉默癌基因PIK3CA实验结
果O图6为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体在体外抑制HCTl 16结肠癌细胞的生长抑制图。图7为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体在体内抑制HCT116结肠癌细胞的生长抑制图。图8为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体用于药物研发的功能性shRNA沉默效率图不。图9为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体用于药靶基因组shRNA在多组人类癌症细胞的致死分数的热图显示。
具体实施例
如图1所示的本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体技术示意原理图:shRNA表达框包含RNA聚合酶III启动子H7或U6启动子、能与四环素阻遏蛋白结合的四环素应答元件TRE、TATA盒和shRNA编码序列；其中当四环素应答元件未与四环素阻遏蛋白(tetR)结合时，Hl或U6启动子能够驱动所述shRNA编码序列的表达。四环素阻遏蛋白表达框包含组成型PGK启动子、四环素阻遏蛋白TetR表达基因、内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列和标记基因PURO或Neo。组成型启动子PGK在细胞中可起始四环素阻遏蛋白TetR编码序列的转录，从而在细胞内稳定生成四环素阻遏蛋白，并维持一定水平的四环素阻遏蛋白。在不存在四环素或其衍生物如强力霉素(Dox)时TetR与shRNA表达框中的TetR结合元件结合，阻止了 RNA聚合酶III启动子Hl或U6起始shRNA编码序列的转录，抑制了 shRNA的生成(如图2)。因此，这种情况下，细胞内该shRNA目的基因的表达不被抑制。当向细胞培养基中加入四环素或其衍生物如强力霉素(Dox)时，这些脂溶性小分子可进入细胞核中与TetR结合，改变其构象，使其脱离shRNA表达框中的TetR结合元件，解除了对RNA聚合酶III启动子Hl或U6的抑制作用，使Hl或U6启动子得以起始shRNA编码序列的转录，生成shRNA (如图3)。该shRNA经细胞内Dicer处理后，形成siRNA，最终抑制了其目的基因的表达。为了更好的理解本发明，以下通过具体实施例进一步阐述本发明；实施例只是对本发明作示例性作用，而不具有任何限制性作用，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。实施例1
诱导型shRNA慢病毒表达载体特异性抑制癌基因PIK3CA，其需经过以下步骤:
1.诱导型shRNA慢病毒表达载体的构建: 本发明提供的shRNA表达载体可通过多步亚克隆改造含有NEO选择基因的慢病毒载体PLKO (来自Sigma)来获得。首先，通过限制性内切酶通ol和Afoil从慢病毒载体切除组成型U6启动聚合酶III启动子。由此产生的载体骨架用琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶萃取试剂盒(Qiagen)纯化回收。四环素(Tet)诱导性聚合酶III启动子U6/TRE由化学合成(SEQ ID 2)，以此为模版用聚合酶链反应(PCR)技术扩增并引入并引入四环素应答元件TRE序列、TATA盒序列和限制性内切酶通ol和Afoi I酶切位点。产物经ZAol和Afoi I消化，凝胶纯化U6/TRE启动子，然后与上述纯化的载体骨架连接，得到含有U6/TRE启动子的表达载体骨架。EcoRl/Xhol限制消化通过切下含有U6/TRE启动子的表达载体骨架352bp片断，来验证U6/TRE启动子与载体骨架连接的正确方向。接下来，TetR融合蛋白的DNA序列(SEQ ID 3)由化学合成并用PCR扩增引入BglU和油al酶切位点。所得到的产物经汝"/II和油al消化，然后紧接PGK启动子的下游插入到经同样消化的表达载体骨架中，将得到的产物称为pKG-3xTetR。克隆的TetR序列由C/al/ikal确定正确方向。最后，内部核糖体进入位点(IRES) DNA序列由化学合成(SEQ ID
4)并由聚合酶链反应扩增并引入编码及丽的酶切位点。然后插入pKG-3xTetR中3xTetR与Puro选择基因序列之间的相应BamHl酶切位点。DNA测序证实了该表达载体的正确序列。最后，将编码序列引入表达载体。化学合成的带有及限制性位点的shRNA编码序列(SEQ ID 6)。以及和通oIDNA限制酶消化该shRNA编码序列并纯化。同样以及和通ο IDNA限制酶消化以上得到的表达载体，纯化的片段通过连接酶与shRNA编码序列的纯化片段连接，得到本发明的诱导型shRNA慢病毒表达载体。所有阳性克隆由DNA测序证实了 shRNA的存在及正确序列。所有试剂按厂商建议条件操作。2.生成慢病毒
通过以本发明提供的shRNA慢病毒表达载体、pVSV-G质粒(来自Sigma)和pCMV-VPR-8-7 质粒(Sigma)共转染 HEK293T 细胞(HIGH GLUCOSE DMEM+10%FBS,Invitrogen)来制备慢病毒；用通过多步亚克隆改造含有NEO标记基因的慢病毒载体pLKO(来自 Sigma)，与 pVSV-G 质粒(来自 Sigma)和 pCMV_VPR-8_7 质粒(Sigma)共转染 HEK293T细胞(HIGH GLUCOSE DMEM+10%FBS, Invitrogen)作对照试验。下述实验过程进行同样处理。使用的转染试剂为Lipofectamine2000 (Invitrogen),按常规方法转染。12小时后替换细胞培养液。含有慢病毒的上清液于48小时后收获。经过滤及高速离心后纯化并于-80° C保存。所有试剂按厂商建议条件操作。3.感染并建立稳定表达的靶细胞株
将慢病毒液与聚凝胺(polybrene终浓度8 μ g/ml)在细胞培养液中混合并培养5分钟。加入培养中的细胞株后(MOI=I,贴壁或悬浮皆可)，离心感染(spinfection, 2500rpmX60分钟)靶细胞株，然后替换入新鲜的细胞培养液。在培养箱内24小时后，视靶细胞株而定，加入 0.5-1.5 μ g/ml Puromycin 筛选 3-4 天或 0.25-1.5 mg/ml G418 筛选 5-10天。然后培养稳定整合了本发明表达载体的靶细胞株至足够量，可立刻为实验用或冻存后供以后实验用。所有试剂按厂商建议条件操作。采用这种方式，我们已测试了 40多个人类和小鼠细胞系，其中绝大多数为肿瘤细胞株，实验结果证明了我们的载体系统具有建立稳定的诱导型shRNA细胞株的普遍能力。下表为一个成功诱导shRNA表 达细胞株的名单:
权利要求
1.一种诱导型shRNA慢病毒表达载体,包含 a)shRNA表达框；所述shRNA表达框包含第一启动子、能与四环素阻遏蛋白结合的四环素应答元件TRE、TATA盒和shRNA编码序列； b)四环素阻遏蛋白表达框，所述四环素阻遏蛋白表达框包含第二启动子、四环素阻遏蛋白表达基因(SEQ ID 3)、内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列(SEQ ID 4)和标记基因。
2.如权利要求I所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体，其特征在于，所述第一启动子为RNA聚合酶III启动子。
3.如权利要求2所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体，其特征在于，所述RNA聚合酶III启动子为Hl启动子(SEQ ID I)或U6启动子(SEQ ID 2)。
4.如权利要求I所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体，其特征在于，所述第二启动子为组成型启动子。
5.如权利要求4所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体，其特征在于，所述组成型启动子为PGK启动子。
6.如权利要求I所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体，其特征在于，所述标记基因为PURO(SEQ ID 5)或 ΝΕ0。
7.一种诱导型shRNA慢病毒表达载体的构建方法，步骤如下 I).通过限制性内切酶从慢病毒载体中切除聚合酶III启动子，切除启动子后的载体骨架经纯化回收； 2).化学合成第一启动子，以合成的启动子为模板进行扩增，并引入限制性内切酶酶切位点，产物经限制性内切酶消化后，进行纯化； 3).将步骤I)中的载体骨架与步骤2)中的纯化后的第一启动子进行连接，得到载体骨架PKG ； 4).化学合成TetR融合蛋白的DNA序列(SEQID 3)，扩增引入酶切位点，即产生TetR的二联体； 5).将步骤4)中所得TetR的三联体和步骤3)中所得载体骨架pKG 分别经酶切消化，将酶切消化后的TetR的三联体插入到经酶切消化后的表达载体骨架pKG 中，即可得到pKG -3xTetR ； 6).内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列(SEQ ID 4)由化学合成并由聚合酶链反应扩增并引入酶切位点； 7).将步骤6)所得内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列和步骤5)中所得pKG -3xTetR分别经酶切消化，然后，将酶切消化后的内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列插入到经酶切消化后的pKG -3xTetR载体中； 8).化学合成带有酶切位点的shRNA编码序列； 9).将步骤8)中所得shRNA编码序列和步骤7)中所得表达载体分别经酶切消化后，分别进行纯化，然后，将纯化后的shRNA编码序列通过链接酶与纯化后的表达载体进行链接，得到诱导性shRNA慢病毒表达载体。
8.如权利要求I所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体在细胞里做基因功能缺失的研究方面的应用。
9.如权利要求I所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体在构建shRNA文库方面的应用。
10.如权利要求I所述的诱导型ShRNA慢病毒表达载体在肿瘤基因治疗药物方面的应 用。
全文摘要
本发明提供一种诱导型shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用。所述诱导型shRNA慢病毒表达载体包含shRNA表达框和四环素阻遏蛋白表达框；shRNA表达框包含第一启动子、能与四环素阻遏蛋白结合的四环素应答元件、TATA盒和shRNA编码序列；四环素阻遏蛋白表达框包含第二启动子、四环素阻遏蛋白表达基因、内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列和标记基因。与现有的诱导型shRNA表达载体相比，本发明的表达载体的优点包括用单个载体即可迅速地在多种细胞株里建立诱导性shRNA表达来沉默基因；不需要细胞的克隆选择；可在细胞的体外培养和体内研究中使用。
文档编号A61P35/00GK103255172SQ20131013140
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月16日 优先权日2013年4月3日
发明者朱平 申请人:傅开屏, 朱平