一种慢病毒干扰载体的构建及鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明涉及针对小鼠STAT3基因，构建抑制效率最佳的STAT3shRNA慢病毒干扰载体。针对STAT3基因设计4对shRNA，克隆到慢病毒干扰载体pLenti中，构建出干扰载体PLKO.1-STAT3-shRNA-a1、a2、a3或a4，与包装外壳蛋白质粒 (pVSV-g) 和包膜质粒(Pax-2)共转染293T细胞，上清培养液过滤后到病毒悬液，测定病毒滴度后以一定MOI病毒量感染大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞，筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体。PLKO.1-STAT3-shRNA-a1、a2、a3或a4经限制性酶切和测序证明基因插入正确，Westernblot法证实PLKO.1-STAT3-shRNA明显降低细胞内STAT3蛋白的表达。
【专利说明】一种慢病毒干扰载体的构建及鉴定
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，尤其是一种靶向小鼠基因STAT3的慢病毒干扰载体的构建及鉴定构建及鉴定。
【背景技术】
[0002]信号转导是细胞生命活动的一种最基本和最重要的方式，细胞因子受体介导的JAK-STAT (janus kinase /signal transducer and activator of transcript1n)信号传导途径是目前心血管分子生物学研究领域的热点，它把细胞膜上感受的信号直接传递到核内一启动基因转录，环节少而简洁；近来研究表明，JAK-STAT途径是人体内生理和病理反应的共同通路之一，与多种疾病发病及防治密切相关，广泛参与细胞应激、生长、增殖、分化和凋亡等多种生物学效应，是多种细胞因子和生长因子信号转导的重要途径。国内目前有文献对正常及低氧等损害情况下血管平滑肌细胞(VSMC)及微血管内皮细胞中全部JAK和STAT的基因和蛋白表达和变化情况进行了初步的研究。显然深入研究JAK-STAT及其它信号转导系统对探讨疾病发病机制和防治具有重要意义。
[0003]近年来，RNA干扰(RNA interference, RNAi)这一新兴的生物工程技术在疾病的发生、发展及治疗研究领域发挥越来越重要的作用，为人们针对某种基因突变或过表达所引起的疾病治疗提供了新的策略。本研究通过构建靶向TLR2的shRNA干扰载体PLK0.1-TLR2-shRNA,并筛选出最佳抑制效率的干扰载体，为进一步研究JAK-STAT信号通路参与调控血管再狭窄过程中细胞增殖迁移的分子机制及为血管桥再狭窄的分子靶向治疗奠定了基础。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种小鼠基因STAT3的慢病毒干扰载体的构建及鉴定构建及鉴定方法。
[0005]基因STAT3的慢病毒干扰载体的构建及鉴定，其步骤为:
I)根据Gene Bank中STAT3的cDNA序列，参考shRNA设计原则，选择cDNA序列上的四个部位作为目标序列，同时将选中的shRNA中的碱基序列随机打乱设计为阴性对照，对照序列经BLAST检测证实与STAT3 mRNA及其他基因编码序列无同源性。
[0006]2) shRNA模板中的loop结构选用了 TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5'端添加了 CCGG，与I酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5'端添加了 AATTCAAAAA，与及酶切后形成的粘端互补。以下序列由上海生工生物技术有限公司合成。
[0007]3)靶向STAT3的shRNA干扰载体PLK0.l_STAT3_shRNA构建及鉴定，用限制性内切酶Age 1、EcoR I酶切PLK0.1，连接退火片断和载体，转化，涂板，挑克隆，小抽质粒，并将克隆送上海英骏生物技术有限公司测序鉴定；
4)将干扰效果最好的PLK0.1_stat3(al)，进行慢病毒包装，_70°C冰柜保存。
[0008]本发明的优点:
OSTAT3是近年来研究异常活跃的转录因子，在细胞因子和生长因子的作用下，通过JAK或丝氨酸激酶诱导，STAT3激活并形成P-STAT3，两个分子p_STAT3相互作用形成二聚体进入细胞核，与目的基因的启动子区域结合，调节靶基因转录。研究表明在多种肿瘤组织和细胞中存在STAT3的异常活化和过表达，并上调与细胞增殖、迁移、细胞凋亡和血管生成等相关基因的表达，在细胞增殖性疾病中起重要作用，STAT3信号通路已成为调控细胞增殖、凋亡新的研究热点。
[0009]2)为进一步研究JAK-STAT3信号通路对血管平滑肌细胞增殖的作用，本研究构建了靶向STAT3的shRNA重组慢病毒表达载体，特异性阻断JAK-STAT3信号通路中的关键分子STAT3蛋白的表达。针对目的基因我们设计三对shRNA序列，构建了三个重组慢病毒表达载体，并将这些重组载体包装病毒后感染大鼠血管平滑肌细胞，采用Western blot法验证重组慢病毒对靶基因的抑制效率。
[0010]3)我们选择抑制效率高的shRNA-3进行后续研究，为进一步研究JAK-STAT3信号通路在血管平滑肌细胞增殖、凋亡等作用奠定了基础，为抑制血管平滑肌细胞增殖的基因治疗提供了新的思路。
【具体实施方式】
[0011]下面结合具体实施实例，对本发明进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。
[0012]雄性小鼠，由南京医科大学实验动物中心提供。U6启动子质粒(如PavU6+27)由北京本元正阳基因技术公司构建，克隆用大肠杆菌DH5ci株(Gibco/BRL公司)，限制性内切酶办^ I ,EcoR I，T4 DNA连接酶，RT-PCR试剂盒均为大连Ta Kara生物公司产品；RNA提取试剂Tripure、DEPC购自美国Roche公司；DMEM培养基、胰蛋白酶、Trizol试剂(Gibcobrl公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Roche公司)；0mniscript RT Kit (Qiagen公司)，反转录随机引物(Toyobo公司)，SYBR Premix Ex Taq (大连Takara公司)。试验中所用的核酸标准分子量Marker以及蛋白预染Marker均为美国Fermentas MBI公司产品。去内毒素质粒大量提取试剂盒为德国Qiagen公司产品。质粒转染试剂LipofectamineTM 2000购置美国invitrogen公司。兔抗鼠STAT3单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自美国Santa Cruz公司。用于Western blot检测的增强化学发光试剂ECL为美国CellSignal 公司产品。PVDF 转印膜购自美国 Schleicher & Schuell B1science 公司。
[0013]I)靶向 STAT3 的 shRNA 设计
根据Gene Bank中STAT3的cDNA序列，参考shRNA设计原则，选择cDNA序列上的四个部位作为目标序列，同时将选中的shRNA中的碱基序列随机打乱设计为阴性对照，对照序列经BLAST检测证实与STAT3 mRNA及其他基因编码序列无同源性。shRNA模板中的loop结构选用了 TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5'端添加了 CCGG，与I酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5'端添加了AATTCAAAAA，与EcoRl酶切后形成的粘端互补，序列如下。
[0014]PLK0.1_stat3 (al)
STAT-F
5’ CCGGAACGACCTGCAGCAATACCATCTCGAGATGGTATTGCTGCAGGTCGTTTTTTTG 3’
STAT-R
SjAattcaaaaaaacgacctgcagcaataccatctcgagatggtattgctgcaggtcgttS'
PLK0.1_stat3 (a2)
STAT-F
5’ CCGG AACCTGCGAAGAATCAAGCAGCTCGAGCTGCTTGATTCTTCGCAGGTT TTTTTG 3’
STAT-R
5’AATTCAAAAA AACCTGCGAAGAATCAAGCAGCTCGAGCTGCTTGATTCTTCGCAGGTT3’
PLK0.1_stat3 (a3)
STAT-F
5’ CCGG AAGATTGGGCATATGCAGCCACTCGAGTGGCTGCATATGCCCAATCTT TTTTTG 3’
STAT-R
5’ AATTCAAAAA AAGATTGGGCATATGCAGCCACTCGAGTGGCTGCATATGCCCAATCTT 3’
PLK0.1_stat3 (a4)
STAT-F
5’ CCGG AACAGCATCTTCAGGATGTCCCTCGAGGGACATCCTGAAGATGCTGTTTTTTTG 3’
STAT-R
5’ AATTCAAAAAAACAGCATCTTCAGGATGTCCCTCGAGGGACATCCTGAAGATGCTG 3’
2)靶向的shRNA干扰载体PLK0.l_STAT3_shRNA构建及鉴定
退火buffer溶解引物成25ul/10D，将上下游引物1:1混合，在94度水浴5min，熄火自然冷却到室温，4度lh。用限制性内切酶Age I ,EcoR I酶切PLK0.1，连接退火片断和载体，转化，涂板，挑克隆，小抽质粒，并将克隆送上海英骏生物技术有限公司测序鉴定。
[0015]3)重组慢病毒 PLK0.l-STAT3-shRNA 的包装
HEK293细胞培养于10 cm平皿中，达50%?70%融合时进行转染。利用脂质体将重组慢病毒质粒PLK0.l-STAT3-shRNA,包装质粒和包膜质粒共转染HEK293细胞。HEK293细胞用无血清的DMEM培养基洗涤后，加入2 ml完全培养基和DNA-脂质体混合物，37°C，5% CO2细胞培养箱培养，12小时后全量换液。继续培养24小时后半量收集细胞上清，48小时后全量收集细胞上清。用0.22 μ m滤器滤过后分装，_70°C冰柜保存。
[0016]4)重组慢病毒滴度测定
接种HEK293细胞于24孔板，按不同稀释倍数稀释病毒液，每一稀释倍数设3个复孔，分别取100 μ I病毒液加入HEK293细胞中。37°C，CO2孵箱中孵育60 min后，弃旧培养基，加入新鲜的DMEM完全培养基，继续培养24 h后于荧光显微镜下计数绿色荧光细胞。I个发光的细胞即为I个表达单位(express1n-forming units, efu)按下列公式计算病毒滴度:病毒滴度(efu/ml)=(绿色荧光细胞数/视野)X (视野数/孔数)X病毒稀释倍数+病毒体积。
[0017]5 )重组慢病毒感染大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞
以6孔板为例，感染当天大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞按每孔500 μ I培养液接种6Χ105个细胞。重组慢病毒PLK0.l-STAT3-shRNA病毒液以I感染复数(multiplicity ofinfect1n，MOI)加入，37°C，5% CO2细胞培养箱继续培养。12 h后在荧光显微镜下观察GFP表达情况。同时用空载体病毒PLenti感染血管平滑肌细胞作对照。
[0018]6)重组慢病毒shRNA对STAT3基因的抑制作用
重组慢病毒PLK0.l-STAT3-shRNA病毒液以MOI=I感染复数加入，48h后收取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，电泳后湿转至PVDF膜，含5%脱脂奶粉的TBS-T(含0.05% Tween-20的TBS)37 °C封闭60 min，加1: 1000稀释的抗STAT3蛋白的单克隆抗体4 °C孵育过夜，TBS-T漂洗5 minX 3次，加入I: 4 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 37 V孵育45 min, TBS-T漂洗5 minX 3次，ECL化学发光试剂检测。
[0019]7)重组慢病毒干扰载体的鉴定
每个连接反应挑取6个菌落，接种到含50 μ g/ml Amp的LB培养基中。
[0020]使用碱裂解法抽提质粒，并将质粒送出测序，经测序，干扰序列正确插入载体且无突变。
[0021]8)重组慢病毒的包装和扩增
重组慢病毒质粒PLK0.l-STAT3-shRNA,穿梭质粒和包装质粒共同转染293T细胞48 h后在荧光显微镜下可以观察到GFP表达。经荧光计数法测得重组慢病毒Ientivirus-Vif滴度为3X 107 efu/ml，作为阴性对照的空载体病毒Ientivirus-Vec滴度为4X 107 efu/ml ο
[0022]9)重组慢病毒感染后对STAT3蛋白表达的影响
获得的重组慢病毒重新感染小鼠胸主动脉血管平滑肌细胞48 h后观察到绿色荧光蛋白的表达。Western blot结果显示重组慢病毒质粒PLK0.1_stat3 (al)、a2、a3、a4均能够抑制小鼠胸主动脉血管平滑肌细胞中STAT3蛋白表达，其中以PLK0.l-stat3(al)最为明显，达到90%以上。
【权利要求】
1.一种重组慢病毒质粒载体，其特征是该载体含有小鼠的STAT3的基因干扰片段。
2.按照权利要求1所述的载体，其特征是该载体为大肠杆菌表达载体。
3.按照权利要求2所述的载体，其特征是该载体为PLK0.l-STAT3-al。
4.按照权利要求3所述的载体，其特征是该载体的al序列为al-F:5’ CCGGAACGACCTGCAGCAATACCATCTCGAGATGGTATTGCTGCAGGTCGTTTTTTTG 3’a2_R:5’AATTCAAAAAAACGACCTGCAGCAATACCATCTCGAGATGGTATTGCTGCAGGTCGTT3’ 。
5.按照权利要求4所述的载体，转染到小鼠体内后，降低STAT3蛋白表达。
【文档编号】C12N15/66GK104419731SQ201310370286
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】施佳萍, 杨艳菊 申请人:上海同科生物科技有限公司