一种靶向srsf6的慢病毒干扰载体的构建及其在结直肠癌治疗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及一种shRNA的构建及应用。具体来说，本发明针对人SRSF6基因的mRNA序列设计合成shRNA，所述shRNA转入结直肠癌细胞后能抑制所述肿瘤细胞的增殖和迀移侵袭。
【背景技术】
[0002]RNA剪接(RNA splicing):从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。最终形成成熟的mRNA还包括5’末端的加帽(加上m7-Gppp),以及在3’末端多聚腺昔酸化。在真核生物中，平均每个细胞基因包含约8个内含子，前体mRNA的长度通常为成熟mRNA的4 -10倍，绝大多数部分在加工过程中被切除。
[0003]在RNA剪接过程中，SR蛋白家族成员发挥了至关重要的作用。SR蛋白家族成员都具有一个富含丝氨酸/精氨酸(S/R)重复序列的RS结构域，在RNA剪接体的组装和选择性剪接的调控过程中具有重要的作用。绝大多数SR蛋白是生存的必需因子，通过其RS结构域和特有的其他结构域，实现与前体mRNA的特异性序列或其他剪接因子的相互作用，协同完成剪接位点的正确选择或促进剪接体的形成。同时SR蛋白家族成员也在RNA的转运，RNA的降解等方面发挥着重要作用。
[0004]SRSF6属于SR蛋白家族一员，同样可以对RNA前体进行选择性剪接。在肿瘤领域内，SRSF6会促进皮肤癌的异常增生，是一个癌基因[Mads A Jensen，etal..Splicing factor SRSF6promotes hyperplasia of sensitized skin.naturestructural&molecular b1logy.VOLUME 21NUMBER 2.FEBRUARY 2014.]。在结肠癌和肺癌中，SRSF6同样可以促进肿瘤细胞的增殖[Jensen MA, etal..The splicing factorSRSF6is amplified and is an oncoprotein in lung and colon cancers.VOLUME229NUMBER 2.MARCH 2013.]。
[0005]发生转移是恶性肿瘤最普遍的生物学特征，也是影响患者生存和预后的关键因素，结直肠癌不仅发病率高且在中晚期极易发生转移，成为治疗失败的主要原因。肿瘤转移是由肿瘤细胞的迀移和侵袭能力决定的。而目前关于SRSF6在结直肠癌转移方面的研宄还是一片空白。本发明首次证实了 SRSF6对结直肠迀移和侵袭方面的作用，这也是SRSF6对所有肿瘤细胞迀移侵袭方面功能的首次验证。总之，本发明构建了针对SRSF6的shRNA，所述shRNA转入结直肠癌细胞后，发现有效抑制了结直肠癌细胞的增殖、迀移和侵袭，为恶性肿瘤的治疗提供了一条途径。
【发明内容】
[0006]本发明针对结直肠癌肿瘤细胞致病性最重要的两个因素增殖和转移，构建了一种shRNA。这种shRNA是基于PLKO系统设计包装完成的。其正义链和反义链的序列分别为:
[0007]F:5’ - CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG - 3’
[0008]R:5’ - AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG - 3’。所述shRNA能够降低结直肠癌肿瘤细胞中SRSF6的蛋白含量。而且能够抑制结直肠癌肿瘤细胞的增殖和迀移。
[0009]本发明是根据Public TRC Portal网站，针对人SRSF6基因设计出的一条shRNA。阴性对照选取系统自动匹配的scramble序列。
[0010]本发明shRNA模板中的loop结构选用了 TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止采用T5结构。正义链的5’端添加了 CCGG，与Age I酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5'端添加了 AATTCAAAAA，与EcoR I酶切后形成的粘端互补，序列如下；
[0011 ] F:5’ - CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG - 3’
[0012]R:5’ - AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG - 3’本发明将上述设计的SRSF6 - shRNA、scramble的寡核苷酸常规退火后合成双链，并连接到Agel, EcoRI双酶切后PLK0.1表达载体上，将连接产物转化大肠杆菌。
[0013]挑取单菌落进行测序鉴定，得到了阳性的克隆和质粒。
[0014]本发明将PLK0.1 - SRSF6 - shRNA, PLK0.1 - scramble表达载体分别进行重组慢病毒的包装，包装质粒为PSPAX2和PMD2.Go包装过程以PLK0.1 - SRSF6 - shRNA为例:
[0015]1.A 体系
[0016]PSPAX2、PMD2.G和 PLK0.1 -SRSF6 -shRNA 三种质粒质量均取 2ug，溶于 300ul DMEM中混匀；
[0017]2.B 体系
[0018]18ul Lipo2000 转染试剂溶于 300ul DMEM 中混匀；
[0019]3.将B体系加到A体系中混匀。静置lOmin ;
[0020]4.将步骤3中的混合物加到已更换3ml新鲜含10%胎牛血清DMEM培养基的6cm培养皿HEK293T细胞中；
[0021]5.18h后将培养皿中液体换成5ml含10%胎牛血清DMEM培养基；
[0022]6.36h后将培养皿中含有PLK0.1 - SRSF6 - shRNA的慢病毒培养液收集，0.45um滤器过滤，分装，-80度冻存。这样就得到了含有PLK0.1 - SRSF6 - shRNA的慢病毒培养液。
[0023]本发明将含有PLK0.1 - SRSF6 - shRNA、PLK0.1 - scramble的慢病毒的培养液感染结直肠癌肿瘤细胞，获得稳转细胞系；具体步骤以HT29细胞为例:
[0024]1.将HT29细胞培养于六孔板中，每孔10~6个细胞，三个孔；
[0025]2.第二天将六孔板中的前两个孔的培养基弃去，分别换成含有PLK0.1 - SRSF6 -shRNA、PLK0.1 - scramble的慢病毒的培养液；同时加polybreen使其终浓度为10ug/ml ；
[0026]3.第三天将培养板中细胞的培养液都换成2ml新鲜的含10%胎牛血清的1640培养基，同时加嘌呤霉素使其终浓度为4ug/ml ；
[0027]4.后每天观察，大约2 - 3天后没有转染慢病毒的空白HT29细胞全部死亡；成功转染PLK0.1 - SRSF6 - shRNA、PLK0.1 - scramble慢病毒的两组细胞大部分存活下来。
[0028]5.用Western Blot的方法验证PLK0.1 - SRSF6 - shRNA的干扰效果，发现转染SRSF6 - shRNA的HT29细胞的SRSF6的表达水平明显低于阴性对照scramble组；稳定干扰掉SRSF6的肠癌细胞系构建成功。
[0029]本发明通过CCK8细胞增殖实验和Transwell小室细胞迀移侵袭实验，检测了转染SRSF6 - shRNA的结直肠癌细胞组与阴性对照scramble的结直肠癌细胞组的增殖能力和迀移侵袭能力的差异。结果显示SRSF6干扰沉默后，结直肠癌肿瘤细胞的增殖能力和迀移侵袭能力相比于阴性对照组都明显下降。
【附图说明】
[0030]图1以本专利中的SRSF6 - shRNA的干扰序列，通过PLK0.1慢病毒包装系统，包装出的慢病毒感染结直肠癌细胞系SW620，HT29，HCTl 16后，Western Blot实验验证得出SRSF6 - shRNA干扰效果显著；本专利中的SRSF6 - shRNA干扰序列能明显将结直肠癌细胞系中SRSF6表达沉默下来。其中scramble组作为阴性对照，SRSF6 - shRNA组代表本专利所提及的干扰RNA序列的实验组。
[0031]图2以本专利中SRSF6 -shRNA将SRSF6沉默掉以后，结直肠癌细胞系SW620，HT29，HCTl 16增殖能力明显下降；本结果是通过CCK8实验得到。
[0032]图3以本专利中SRSF6 - shRNA将SRSF6沉默掉以后，结直肠癌细胞系SW620，HCTl 16的迀移侵袭能力受到明显抑制；该结果通过Transwell实验来完成；照片右面的柱状图是用33 %的醋酸溶解小室底部细胞吸收结晶紫后，检测吸光度值得到。
[0033]实施例1 SRSFR6 - shRNA干扰载体的构建及验证
[0034]材料和方法
[0035]1、材料
[0036]结直肠癌细胞系SW620、HT29、HCTl 16和慢病毒包装细胞系HEK293T由中国科学院生物化学与细胞生物学研宄所提供；RPMI1640、DMEM、0.05% Trypsin，购于博士德公司；胎牛血清购于四季青公司。SRSF6抗体购自SIGMA公司；ACTIN抗体购自CST ;Lipo2000转染试剂、嘌呤霉素购自Invitrogen ;Age 1.EcoR I核酸内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa。大肠杆菌DH5 a，PLK0.1、psPAX2、pMD2.G载体均由本实验室保存；引物委托上海桑尼有限公司合成；质粒提取试剂盒购于QIGEN公司；其他药品为国产分析纯。
[0037]2、方法
[0038]2.1、shRNA序列的设计
[0039]根据Public TRC Portal数据库，真对人SRSF6基因设计出的一条shRNA。shRNA的正反义寡核苷酸序列如下
[0040]F:5’ - CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG - 3’
[0041]R:5’ - AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG - 3’
[0042]本发明shRNA模板中的loop结构选用了 TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止采用T5结构。正义链的5’端添加了 CCGG，与Age I酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5'端添加