了 AATTCAAAAA，与EcoR I酶切后形成的粘端互补。阴性对照选取系统自动匹配的scramble序列。将干扰RNA的序列送上海桑尼公司合成出对应的DNA片段。
[0043]2.2、PLK0.1 - SRSF6 - shRNA载体的构建及沉默效果检测
[0044]I)干扰载体的构建
[0045]a)取等量lOOmmol/L的DNA寡核苷酸单链片段混合，在退火缓冲液中加热到95度5分钟，缓慢降至室温，得到插入片段。
[0046]b)到Age1、EcoRI双酶切PLK0.1表达载体3h后，琼脂糖凝胶电泳切胶回收载体骨架，T4连接酶将插入片段和载体骨架连接。
[0047]c)连接体系转入大肠杆菌DH5 α。
[0048]d)挑取阳性克隆进行培养并提取质粒，送上海桑尼测序鉴定。留存菌种冻存于-80度。
[0049]e)将质粒鉴定成功菌种扩增培养100ml，大抽提质粒。就得到了大量的干扰片段表达载体。
[0050]2)重组慢病毒 PLK0.1 - SRSF6 - shRNA 的包装
[0051]a)第一天，HEK293T细胞培养于6cm培养皿中，24h后达到60% -80%融合时进行转染。
[0052]b)第二天，表达质粒 PLK0.1 - SRSF6 - shRNA、PMD2.G、PSPAX2 共转 HEK293 细胞:
[0053]一，将培养于6cm培养皿的HEK293细胞培养基换成新鲜的含10%胎牛血清DMEM
培养基；
[0054]二，配制 A 体系(PSPAX2、PMD2.G 和 PLK0.1 -SRSF6 -shRNA 三种质粒质量均取 2ug，溶于300ul DMEM中混匀);配制B体系(18ul lipoD293T转染试剂溶于300ul DMEM中混匀)；
[0055]三，将B体系加到A体系中混匀，静置1min后均匀加到6cm培养皿HEK293细胞中，轻轻摇匀，放入培养箱。
[0056]c)第三天，转染18h后将培养皿中液体换成5ml含10%胎牛血清DMEM培养基。
[0057]d)第四天，换液后36h后将培养皿中培养液收集，0.45um滤器过滤，分装，-80度冻存。于是得到了含有PLK0.1 - SRSF6 - shRNA重组慢病毒的培养液。
[0058]3)重组慢病毒PLK0.1 - SRSF6 - shRNA沉默效果验证和SRSF6 - shRNA稳转细胞系构建，以SW620细胞系为例。
[0059]a)第一天，将SW620细胞培养于六孔板中，每孔1*10~6个细胞，三个孔。
[0060]b)第二天，将六孔板中的前两个孔的培养基弃去，分别换成含有PLK0.1 - SRSF6 -shRNA、PLK0.1 - scramble的慢病毒的培养液。同时加polybreen使其终浓度为10ug/ml。
[0061]c)第三天，将培养板中细胞的培养液都换成2ml新鲜的含10%胎牛血清的1640培养基，同时加嘌呤霉素使其终浓度为4ug/ml。
[0062]d)第四天以后，加嘌呤霉素大约2 -3天后没有转染慢病毒的空白SW620细胞全部死亡。成功转染慢病毒PLK0.1 - SRSF6 - shRNA、PLK0.1 - scramble的两组细胞大部分存活下来。这样就得到了 SRSF6 - shRNA和阴性对照scramble的稳转细胞组。
[0063]e)将六孔板中存活下来的细胞用蛋白裂解液消化，Western Blot验证的到SRSF6 - shRNA细胞组的SRSF6表达明显低于阴性对照scramble细胞组的表达量，详见图1o
[0064]实施例2 SRSFR6 - shRNA对结直肠癌细胞增殖能力的抑制
[0065]材料和方法
[0066]1、材料
[0067]结直肠癌细胞系SW620、HT29、HCTl 16由中国科学院生物化学与细胞生物学研宄所提供。RPMI1640、DMEM、0.05% Trypsin，CCK8试剂购于博士德公司；胎牛血清购于四季青公司。嘌呤霉素购自Invitrogen。其他药品为国产分析纯。
[0068]2、方法
[0069]2.1将筛选好的稳转细胞系以SW620为例，分别计数5*10~5个铺于六孔板两个孔，此时培养基已经无嘌呤霉素
[0070]2.2约两天后，铺96孔板，进行CCK8增殖实验。
[0071]1)将SW620 - SRSF6 - shRNA组和SW620 - scramble组细胞用胰蛋白酶消化下来，收集细胞，计数，使其细胞终浓度为每lOOul含10%胎牛血清1640培养基含2000个细胞，总量为3ml ；2)将两组细胞终浓度稀释为每lOOul含10%胎牛血清1640培养基含2000个细胞的培养基，加到96孔板中，每组12个小孔(0h，24h，48h，72h共4个时间点，每个时间点需3个复孔，所以需12个小孔)，每个小孔lOOul培养基，含2000个细胞。同时向96孔板中加12个小孔不含细胞的10%胎牛血清的1640培养基作为空白对照BLK。其余空下的孔加上约lOOulPBS，防止培养基蒸发。
[0072]3) 3h 后，细胞贴壁，向 SW620 - SRSF6 - shRNA 组和 SW620 - scramble 组及 BLK 组加CCK8试剂，每一组加3个小孔，每个小孔加10ul。
[0073]4)加CCK8试剂3h后，将所有加药的孔按顺序一一对应转移到一张新的96孔板中，在酶标仪上选择检测CCK8的波长，进行吸光度检测。此时，为Oh数据。
[0074]5)Oh为基点，后续进行24h，48h，72h的检测试验。操作过程与Oh操作相同。
[0075]6)数据处理，每个时间点实验组3个复孔的0D减去BLK组三个复孔0D值的均值，即为实验组3个复孔的绝对0D值。然后再根据每个时间点的两组细胞的3个复孔的绝对0D值，得到了增殖曲线，见图2。
[0076]实施例3 SRSFR6 - shRNA对结直肠癌细胞迀移侵袭能力的抑制
[0077]材料和方法
[0078]1、材料
[0079]结直肠癌细胞系SW620、HT29、HCT116由中国科学院生物化学与细胞生物学研宄所提供。RPMI1640、DMEM.0.05% Trypsin，试剂购于博士德公司；胎牛血清购于四季青公司。嘌呤霉素购自Invitrogen。Transwell双层板购于COSTAR公司，Matrigel胶购于BD公司，结晶紫购于碧云天公司。其他药品为国产分析纯。
[0080]2、方法
[0081]2.1将筛选好的稳转细胞系以SW620为例，分别计数5*10~5个铺于六孔板两个孔，此时培养基已经无嘌呤霉素。
[0082]2.2约两天后，铺Transwell小室。
[0083]1)将含有50ug/ul的FN均匀涂在小室底部涂10ul。于生物安全柜内等其风干(侵袭实验要加Matrigel，原液用无血清1640稀释50倍，每小孔加50ul，置于细胞培养箱lh，待Matrigel凝固，余下培养基析出后，将其吸除)。
[0084]2)将SW620 - SRSF6 - shRNA组和SW620 - scramble组细胞用胰蛋白酶消化下来，收集细胞，计数，使其细胞终浓度为1*10~6个每lOOul无血清1640培养基，总量为400ul。
[0085]3)向容纳小室的下层24孔板内每孔加500ul含10%胎牛血清1640培养基。上层小室内加lOOul含1*10~6个细胞的无血清培养基。SRSF6 -shRNA组和scramble组每组设置三个复孔。
[0086]4)约1- 2天后，将SRSF6 - shRNA组和scramble组小室同时取出取出，吸掉室内培养基擦除室内细胞，用600ul 4%多聚甲醛固定15分钟；结晶紫染色10分钟；PBS洗三次，晾干后。显微镜下拍照。得到图3左侧照片。
[0087]5)350ul含有33%的醋酸溶解下小室内部细胞吸收的结晶紫，然后吸出10ul到96孔板中，SRSF6 - shRNA组和scramble组，每组三个复孔；另外有10ul的33%的醋酸三个复孔，作为空白对照。测吸光度，计算出绝对吸光度。得到图3右侧柱状图。
【主权项】
1.一种慢病毒质粒载体，其特征是该载体含有人的SRSF6的基因干扰片段。2.按照权利要求1所述的载体，其特征是该载体是大肠杆菌表达载体。3.按照权利要求2所述的载体，其特征是该载体为PLK0.l-SRSF6-shRNA。4.按照权利要求3所述的载体，其特征是该载体的shRNA序列是F:5’-CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG-3’R:5’-AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG-3’ 。5.按照权利要求4所述的载体，转染结直肠癌细胞后，能降低SRSF6蛋白的表达。6.按照权利要求4所述的载体，转染结直肠癌细胞后，结直肠癌细胞的增殖能力和迀移侵袭能力明显下降。7.权利要求1-6任一项所述的载体在制备治疗结直肠癌药物中的用途。
【专利摘要】本发明公开了抑制SRSF6基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法，所述的shRNA序列为F:5'‐CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG‐3'，R:5'‐AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG‐3'；所述慢病毒表达载体是将上述的shRNA插入载体质粒PLKO.1中,构建PLKO.1‐SRSF6‐shRNA；载体测序验证正确后将其和包装质粒PSPAX2和PMD2.G中转染HEK293T细胞获得慢病毒悬液；用此悬液去感染结直肠癌细胞,然后用嘌呤霉素筛选验证病毒包装是否成功；Western Blot验证其能明显降低SRSF6的表达水平；并能显著降低结直肠癌细胞的增殖能力和迁移侵袭能力；其中SRSF6对肿瘤细胞迁移侵袭能力的作用的研究尚数首次。
【IPC分类】A61K48/00, C12N15/867, A61P35/00
【公开号】CN104975044
【申请号】CN201510268810
【发明人】张红河, 孔建鲁, 来茂德
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年5月22日