RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种RNAi干扰片段、RNAi干扰载体、及RNAi 干扰载体的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 在自然条件下，几乎所有哺乳动物的性别比例都接近1: 1，从而实现了无间断地进 行稳定地繁衍后代，在自然的条件下达到生态平衡。对于畜牧生产实际而言，理想的性别比 例具有十分重要的意义。利用泌乳、产蛋性状进行生产的生产企业希望得到更多的雌性个 体，而产肉、产毛性状的在雄性个体上表现得优势性更加明显。一直W来，人类对控制动物 后代的性别就有着极大的兴趣。目前性别控制主要从受精前和受精后两个方面进行，前者 应用精子分离后再进行受精，使得在受精时就决定了后代的性别；后者采用早期胚胎性别 鉴定，进行胚胎的性别筛选的方法来控制后代的性别。
[0003] 哺乳动物性别决定理论认为，性染色体为"XX"的受精卵就能够发育成雌性个体， 而性染色体为"XY"的就会发育成雄性。那么从根本上讲，控制家畜性别最理想的方法是 先分离X、Y精子，然后再进行受精，就能人为地控制后代的性别，理论上运是在性别控制中 最简单、最经济的途径。自20世纪50年代后，关于精子分离的研究报告很多，运些研究都 试图利用X精子和Y精子不同的物理特性（体积、密度、电荷、运动性）），采用离屯、法、电泳 法、离子交换法、细胞表面抗原法等不同的方法来实现精子的分离，但是都有一个共同的问 题一一可重复性差。而且运些差异随着环境条件的不同而发生变化，因此，许多研究结果常 常不一致，甚至出现相反的结论，致使两类精子某些差异性研究存在争议。到目前为止，除 了Χ、Υ精子DNA含量具有差异可W肯定之外，其他方面的差异表现很小，甚至难W确定。但 是随着分子生物学技术的不断发展，W及研究工作的继续深入，新的研究成果将会不断涌 现。
[0004] 目前根据哺乳动物X、Υ精子DNA含量存在差异的原理，利用流动细胞检索仪进行 分离X、Υ精子，分离效果最好，纯度可达90%W上，但是由于设备昂贵，分离速度慢，用于 受精的精子数量少、活力差等原因，远远不能满足生产上对性控精液的大量需求。相比之 下，如果能够找到两种精子发育或受精过程中，甚至胚胎发育时关键性的X、Υ染色体特异 mRNA，结合当代新兴的分子生物学技术利用RNA干扰（RNAInterference,RNAi)的方法则 有望W较低的成本，简便、快速地实现对动物的性别控制。 阳0化]RNAi是一种转录后的基因沉默（Post-transcriptionalGeneSilencing,PTG巧 现象，通过体外人工合成或体内产生的双链RNA(DiAble-strandedRNA.dsRNA)在细胞内特 异性地降解其同源的mRNA，使得相应的基因干扰，实现阻止目标基因的表达。RNAi方法能 够快速、简便、有效、特异地下调细胞中的基因表达，它不但是研究基因功能的一种有力工 具，而且也为特异性基因治疗提供了新的技术手段，其应用前景十分广阔。
[0006] 在基因组、mRNA和蛋白水平的研究都证明，Χ、Υ精子基因表达的确存在差异。基因 表达检测研究表明，在精子形成的减数分裂粗线期，为防止一些酶类与性染色体发生作用， 两条性染色体高度浓缩形成性体。性体的形成保护了性染色体，性染色体上特殊基因的表 达被关闭。因此，哺乳动物成熟精子中没有mRNA的转录，然而哺乳动物成熟精子中却含有 mRNA，运种差异来自精子发生过程中的转录，其翻译远落后于转录。运些mRNA是精子成熟 后指导合成一些必须的蛋白，或者是受精后对卵母细胞mRNA库的补充，或作为RNAi对生育 和胎儿生长发育起着关键的作用。
[0007]Hen化化sen等对小鼠的研究发现，减数分裂过程中，除Xist基因表达外，几乎所 有的性染色体基因都没有表达，然而减数分裂后期，一些性染色体特异基因开始表达。减数 分裂后，检测到Y染色体上化ely和S巧基因具有较高的mRNA水平；在X精子中也检测到 化elx基因mRNA高水平表达，同时发现X染色体特异基因Μ虹6A的表达产物。另外还有人 发现X、Υ染色体其他特异基因的表达，如X染色体特异基因Akap82 (精子尾部的骨架蛋白） 及Nap-X(编码一种核相关蛋白），Y染色体特异基因Zfy-1、Zfy-2及Y353/B。
[0008] 其中Zfx/Zfy基因是染色体上编码锋指蛋白的一对等位基因，从减数分裂期开始 表达，在圆形精子细胞中的含量最高。Zfx基因是ZFY(zincfinger-Y)基因家族中的一 员，ZFY家族包括Zfx，Zfy和Z化基因，他们在分子结构上非常相似。一般哺乳动物有Zfx 和Zfy基因，Zfx基因位于X性染色体上，是雌、雄性哺乳动物X染色体必含的基因，Zfy 基因位于Y性染色体上，两个基因位于性染色体的末端，但并不位于同源区域。Zfx基因包 括一个酸性的转录激动区域，一个核定位序列和一个DNA连接区，具有13个C2肥[切S(2) His(2)]型锋指结构。在哺乳动物细胞中，C2肥锋指结构是最常见的蛋白质结构之一。目 前已发现800多种具有运种锋指结构的蛋白质，具有重要的生理功能。Zfx/Zfy编码的蛋 白作为转录因子，在精子形成过程中具有一些功能并与精子的发生有关。
【发明内容】
[0009] 有鉴于此，本发明实施例提供一种RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及应用。主 要目的是通过RNAi干扰载体对动物Y染色体上的Zfy基因进行干扰，使得Zfy基因表达量 下降，W此达到人为控制动物性别的目的。
[0010] 为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：
[0011] 一种RNAi干扰片段，用于干扰动物Y染色体上的Zfy基因，所述RNAi干扰片段序 列为沈QIDNO. 1或沈QIDNO. 2所示；
[0012] 所述Zfy基因负责编码的蛋白作为转录因子，与精子的发生有关。
[0013] 另一方面，上述的RNAi干扰片段作为制备干扰动物Y精子基因的药物的应用。
[0014] 另一方面，一种RNAi干扰载体，用于干扰动物Y精子基因，其特征在于，所述RNAi 干扰载体克隆有RNAi干扰片段，所述RNAi干扰片段的序列为SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2 所示。
[0015] 进一步的，所述RNAi干扰载体包括pLentiLox3. 7载体，所述pLentiLox3. 7载体 与所述RNAi干扰片段连接。
[0016] 另一方面，所述RNAi干扰载体在在动物受精前进行性别控制中应用。
[0017] 进一步的，所述RNAi干扰载体W睾丸直接注射的方式注射至动物体内，用于干扰 动物Y染色体上的Zfy基因。
[0018] 一种RNAi干扰载体的制备方法，包括如下步骤：
[0019] (1)酶切pLentiLox3. 7 载体；
[0020] (2)将所述RNAi干扰片段与酶切后的所述pLentiLox3. 7载体连接，得到连接产 物；
[0021] 其中，所述RNAi干扰片段序列为沈QIDNO. 1或沈QIDNO. 2所示；
[0022] (3)将所述连接产物转化至感受态细胞中，筛选并将得到的菌液进行测序鉴定，并 将测序结果与所述RNAi干扰片段序列完全一致的菌液进行扩增；
[0023] 所述酶切位点为化al和化oil;所述发夹结构序列为SEQIDNO. 3或SEQIDNO. 4 所示；
[0024] (4)从所述扩增的菌液中提取RNAi干扰载体。 阳0巧]进一步的，所述的感受态细胞为pLentiLox3. 7载体细胞。 阳0%] 进一步的，所述筛选为W含有pLentiLox3. 7载体、酶切位点和发夹结构来进行筛 选。与现有技术相比，本发明至少具有下列优点：
[0027] 本发明提供的的RNAi干扰片段，通过对雄性绵羊的生殖细胞Y精子中的Zfy基因 进行沉默，阻碍、损伤或者破坏Y精子的正常发育和功能。在与雌性绵羊交配时给予了X精 子更多的受精机会，在受精前有效的控制了绵羊的性别从而使子一代绵羊产生的母羊比率 大大升高。本方法对所需精子细胞不会造成损伤或者降低其活力，而且成本低廉。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及其应用中ZfymRNA在细胞中 的表达水平。
[0029] 图2为本发明RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及其应用中RNA干扰绵羊Zfy 子一代雌黑率。
[0030] 图中:各组跟对照组比较，无上标的为差异不显著；表示差异显著（P<0. 05)。 [00川图3为本发明RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及其应用中的载体构建示意图。
【具体实施方式】
[0032] 为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采用的技术手段及功效，结合较佳 实施例详细说明如下。 阳〇3引实施例1
[0034] 设计并合成用于干扰动物睾丸生精细胞中的Zfy基因的RNAi干扰片段。下面本 实施例W绵羊睾丸生精细胞中的Zfy基因的RNAi干扰片段为例，对本发明提供的技术方案 进行说明。具体如下：
[0035] 根据绵羊Zfy基因的mRNA序列设计8个siRNA片段模板并筛选出两个siRNA片 段，其中表1为用于siRNA的ZfycDNA模板；
[0036] 表 1用于siRNA的ZfycDNA模板
[0037]
[0039] 然后按照所述pLentiLox3. 7载体及所带启动子的要求，合成两对shRNAi的寡聚 核巧酸序列。该两对shRNAi干扰片段分别为shRNAA和shRNAG，如表2所示。 W40] 所使用的Zfy基因序列来自于NCBI基因库，根据RNAi设计原则和在NCBI上的