一种鉴别苹果蠹蛾细胞系的pcr引物及其鉴别方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物技术领域，具体设及一种鉴别苹果蠢蛾细胞系的PCR引物及 其鉴别方法。
【背景技术】 阳00引苹果蠢蛾（切diapomonella)属鱗翅目、小卷叶蛾科，原产于欧洲中南部。20世 纪50年代入侵我国新疆，目前已入侵新疆、甘肃、宁夏、内蒙古、黑龙江等地区，直接威胁我 国东部苹果产区，对我国苹果产业构成严重威胁，已成为我国一种重要的检疫性有害生物。 研究苹果蠢蛾的生物学和生理学特性对于该虫的综合治理具有重要的意义，但在国内非疫 区饲养苹果蠢蛾具有一定的难度和潜在风险，建立苹果蠢蛾细胞系不会造成苹果蠢蛾对保 护区的入侵，可W通过培养的苹果蠢蛾细胞来开展上述相关研究，细胞系的建立为相关研 究提供了一个便捷、快速的途径。
[0003] 细胞系的建立及培养过程中可能会被其他细胞污染而转变为其他昆虫种类的细 胞系或多种不同种类昆虫细胞共存的细胞系，运就会对后期研究苹果蠢蛾的昆虫生理学及 生物学特性造成很大的影响。而目前鉴定细胞系的方法，如细胞系DNA扩增产物指纹图谱 (DAF)、随机扩增多态性DNA(RAPD)等，其鉴定结果易受多种因素的影响，存在着重复性差 和灵敏度低等问题。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种鉴别苹果蠢蛾细胞系的PCR引物及其鉴别方法，从而弥补现有技 术的不足。 阳0化]本发明首先提供一种用于检测苹果蠢细胞系的PCR引物对，其引物序列信息如 下：
[0006] 正向引物LC01490 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'(SEQIDNO: 1)，
[0007] 反向引物肥02198 :5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'(SEQIDNO:2)。
[0008] 对上述的引物进行了优化，使优化后的引物扩增的灵敏性更高和重复性更好，优 化后的引物的序列信息如下：
[0009] 正向引物MU1 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATACTGG-3'(沈QIDNo:3)，
[0010] 反向引物MD2 :5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAATAATA-3'(沈QIDNo:4)。
[0011] 本发明还提供一种苹果蠢蛾细胞系的鉴别方法，其步骤如下： 阳〇1引1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得到DNA提取液；
[0013] 2)利用上述的引物对步骤1)中的DNA提取液进行PCR扩增；
[0014] 3)用限制性内切酶化nfI对步骤2)的PCR扩增产物进行酶切；
[0015] 4)将步骤3)酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样 品在320bp和380bp有条带时，则被测样品确定为苹果蠢蛾细胞系；
[0016] 所述步骤（2)的PCR扩增体系如下： 阳017] 基因组DM溶液1yL，10ymol/L的正向引物溶液1yL，10ymol/L的反向引物 溶液 1μL，5U/μLTaq酶 0. 5μL，10XTaq缓冲液 5μL，2. 5mmol/LdNTP4μL，灭菌纯水 37. 5μLo
[0018] 所述步骤2)的PCR扩增条件为：
[0019] 94°C预变性5分钟；94°C变性1分钟，54 °C退火1分钟，72 °C延伸2分钟，进行35 个循环；72 °C延伸5分钟。
[0020] 所述步骤3)中限制性内切酶化nfI酶切反应条件为：37°C酶切1小时。
[0021] 本发明所述的限制性内切酶为常用的限制性内切酶，为鉴别苹果蠢蛾细胞系提供 了简便、稳定的酶切鉴别方法。
[0022] 本发明从分子水平探索了苹果蠢蛾细胞系与其他几种昆虫（如暗黑觸金龟、甜菜 夜蛾和粉纹夜蛾）细胞系线粒体C0I基因片段序列的不同，建立了苹果蠢蛾与暗黑觸金龟、 甜菜夜蛾和粉纹夜蛾等细胞系的鉴别方法。
【附图说明】
[002引图1为苹果蠢蛾和其他几种昆虫细胞系C0I基因片段PCR扩增后的琼脂糖凝胶电 泳图；其中M，DL5000DNAMarker;1-5,苹果蠢蛾卵、苹果蠢蛾细胞系、暗黑觸金龟细胞系、 甜菜夜蛾细胞系和粉纹夜蛾细胞系。
[0024]图2为几株苹果蠢蛾细胞系C0I基因片段PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；其中M，DL5000DNAMarker; 1-7,苹果蠢蛾细胞系Cp-E-4、Cp-E-6、Cp-E-9、Cp-E-10、Cp-E-11、 Cp-E-12 和Cp-E-13。
[00巧]图3为几株苹果蠢蛾细胞系PCR扩增产物经化nfI酶切后的琼脂糖凝胶电泳 图；其中M，DL5000DNAMarker;1-7,苹果蠢蛾细胞系Cp-E-4、Cp-E-6、Cp-E-9、Cp-E-10、 Cp-E-ll、Cp-E_12 和Cp-E_13。 阳0%] 图4为苹果蠢蛾与暗黑觸金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾细胞系PCR扩增产物经化nf I酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；其中M，DL5000DMMarker; 1-4,苹果蠢蛾细胞系、暗黑觸 金龟细胞系、甜菜夜蛾细胞系和粉纹夜蛾细胞系。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0028] 实施例1:苹果蠢蛾细胞系与其他几种昆虫细胞系基因组C0I基因片段的扩增和 序列分析
[0029] 申请人分析了扩增获得的苹果蠢蛾细胞系C0I基因部分序列（SEQIDNo:5)与苹 果蠢蛾卵基因组扩增的C0I基因部分序列（SEQIDNo:6);在NCBI数据库中进行Blast比 对，利用DNASTAR软件对苹果蠢蛾和其他几种昆虫的C0I基因片段进行对比分析，发现苹果 蠢蛾与暗黑觸金龟的C0I基因核巧酸一致性为81. 6%，与甜菜夜蛾的C0I基因核巧酸一致 性为87. 9%，与粉纹夜蛾的C0I基因核巧酸一致性为83. 9%，结果表明苹果蠢蛾的C0I基 因核巧酸序列与其他几种昆虫的C0I基因核巧酸序列存在明显的差异。
[0030] 根据序列分析结果，申请人设计了如下的引物： 阳的1]正向引物LC01490 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'(沈QIDNO:1)，
[0032]反向引物肥02198 :5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'(沈QIDNO:2)。 阳03引利用上述的引物对，PRIMER5. 0软件对苹果蠢蛾和其他几种昆虫的C0I基因片段 序列进行分析，首先保证该引物不仅能够扩增苹果蠢蛾细胞系与苹果蠢蛾卵基因组DNA中 的线粒体C0I基因片段，还能扩增其他几种昆虫（如暗黑觸金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾）的 线粒体C0I基因片段；而且，扩增的产物中确保苹果蠢蛾C0I的扩增片段可被限制性内切酶 HinfI酶切（酶切位点为GANTC)，而其他昆虫（如暗黑觸金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾）的 C0I基因片段不能被限制性内切酶化nfI酶切。从而能够有效的区分苹果蠢蛾细胞系，并 确定苹果蠢蛾细胞系是否被其它遗传背景近似的细胞系污染。
[0034] 利用设计的引物对进行检测，具体步骤如下：
[0035] (1)苹果蠢蛾及暗黑觸金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾细胞系基因组DNA的提取
[0036] 对苹果蠢蛾细胞系Cp-E-10及暗黑觸金龟细胞系化-E-1、甜菜夜蛾细胞系Se-1和 粉纹夜蛾细胞系化9-4s的细胞悬液用Ma姐xtractor-Genome试剂盒进行基因组DNA的提 取，得到几种昆虫细胞系的基因组DNA溶液。
[0037] (2)苹果蠢蛾及暗黑觸金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾细胞系C0I基因片段的PCR扩增
[0038] 分别W苹果蠢蛾、暗黑觸金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾细胞系的基因组DNA溶液为 模板，W优化前的引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
[0039]PCR扩增体系为： W40] 细胞系的基因组DNA溶液：lyL，10ymol/L的正向引物：溶液lyL，10ymol/L 的反向引物溶液：1yL，5U/yLTaq酶：0. 5yL，10XTaq缓冲液：5yL，2. 5mmol/LdNTP: 4μL，灭菌纯水：37. 5μL。
[0041]PCR扩增条件为：
[0042] 94°C预变性5分钟；94°C变性1分钟，54 °C退火1分钟，72 °C延伸2分钟，进行35 个循环；72 °C延伸5分钟。
[0043] 用1. 0 %的琼脂糖凝胶电泳对步骤似制得的PCR扩增产物进行检测。