专利名称：用于控制果园中苹果蠹蛾的药剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于鉴定昆虫驱逐剂和引诱剂的方法，以及某些昆虫驱逐剂和引诱剂用于对果园中苹果蠹蛾的综合控制的用途。
背景技术：
苹果蠹蛾幼虫是破坏力非常大的害虫。苹果蠹蛾成虫很小，具有1/2到3/4英寸的翼展，大约为普通家蝇的大小。它们的灰色花斑装外观与树皮相似，使得它们难以被察觉。如果捕捉成虫，可以通过它们的暗褐色翼尖将苹果蠹蛾与其它和果树相关的蛾子相区别，所述翼尖具有光泽的紫铜色的斑纹。它们将卵逐一地产在果实、坚果或者附近的叶子上。在梨树中，卵还可以被产在叶簇的根部。在苹果和梨树上，幼虫穿透果实并钻入果核中，在果实中留下褐色的孔，其中充满蛀屑(幼虫粪便)。在李树中，偶尔在其它核果中，苹果蠹蛾钻入果实中一直到达果核。
苹果蠹蛾(CM)(Cydia pomonella(L.))在世界范围内是对苹果栽培而言的经济上最重要的昆虫。它与苹果以及其它一些植物具有密切的生态关联(Shel’deshova，1967)。Bengtsson等人观察了在风洞中苹果蠹蛾成虫对有或者没有绿色果实的苹果树枝的行为反应，并且发现仅仅苹果绿色果实和叶子都吸引雌性苹果蠹蛾(Bengtsson等人，2001)。已知这种关联很大程度上由宿主植物释放的一些挥发性引诱剂所介导(Bengtsson等人，2001；Sutherland和Hutchins，1972；Yan等人，1999；Knight和Light，2001；Light等人，2001)。(E，E)-α-金合欢烯(Sutherland和Hutchins，1972；Wearing和Hutchins，1973)，芳樟醇(linalool)，和β-石竹烯(Bengtsson等人，2001)已被鉴定为苹果蠹蛾或者新生幼虫的引诱剂(Knight和Light，2001；Light等人，2001)。然而，这些化合物的一些也存在于多种非宿主植物的挥发物谱中。因此，设想改变宿主植物的挥发物组成可以改变它们与苹果蠹蛾昆虫的关联是合情理的。
公知许多植物含有大量通过糖苷键结合的挥发物。通常，植物叶子显示出最高的糖苷配基挥发性，接着是花、茎干和根(Stahl-Biskup等人，1993)。已经分离和鉴定出了苹果叶和果实中的一些通过糖苷键结合的挥发性化合物(Schwab和Schreier，1988；Stingl等人，2002)。此外，已经展示通过外源应用β-糖苷酶成功地增强了果汁和酒的香味。
苹果蠹蛾非常难以控制，特别当允许它的种群积累了一季或者两季时。当种群非常高并且许多被侵袭的树在附近时，必须应用杀虫剂使种群下降到非常低的水平。然而，杀虫剂非常难以准确定时，并且可用的唯一高效的物质对天敌和蜜蜂有毒。因此，非化学方法是优选的。商业果园中苹果蠹蛾的控制可以依赖于非化学方法，包括定期检查树和果实(称作侦察(scouting))、信息素诱捕，和使用天气监视和度-日(degree-day)模型。人们非常希望发现可以用于抗果园中的苹果蠹蛾的天然非毒性化合物。
在The Merck Index(13thEdition，2001，#4415)中描述了在许多精油，如玫瑰油、玫瑰草油、香茅油和柠檬草油中发现的烯属萜醇香叶醇作为昆虫引诱剂。然而，一些出版物将香叶醇描述为挥发性驱虫剂。
US 4,774,081公开了香叶醇作为针对蟑螂和其它爬行昆虫的接触驱虫剂。Chem.Abstracts，Vol.105204742q公开来自月桂树(Laurusnobilis L.)的叶子的化合物是Tribolium castaneum(Herbst)的有用的驱虫剂，并且这些化合物包括以50ppm存在的香叶醇等。Chem.Abstracts，Vol.113110945w(JP 02/67202的摘要)公开当掺入多孔无机微胶囊时，芳樟醇、香叶醇、香茅醇和橙花醇等是针对蟑螂、蛞蝓、蚂蚁等等的驱虫剂。
US 5,227,406、US 5,346,922、US 5,648,398和US 5,621,013公开了用于人和动物的驱虫剂，用于驱逐携带Lyme氏疏螺旋体病的壁虱，以及叮人的蚊子和triatomes(Chagas bugs)，所述驱虫剂包含松油醇、香茅油和罗丁醇提取物(extra)和香叶醇作为运送介质中提供的活性物。活性物以少量使用，例如，少至0.01％，优选0.05％到0.08％，优选小于1％，但仍然是协同有效的，对于携带Lyme氏疏螺旋体病的壁虱尤其协同有效。
US 5,633,236公开了在限定的时间期限内驱逐家蝇(Muscadomestica L.(DipteraMuscidae)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、Culexnigripalpus、大西洋伊蚊(Aedes atlanticus)、盐水库蚊(Culexsalinarius)、刺扰伊蚊(Aedes vexans)、库蚊(Culex spp.)、蚋(Simuliumspp.)、Psoroferia ferox、Aedes infirmatus、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、Coccinellidae、Anopheles crucians、Psoroferiacolumbiae、库蠓(Culicoides spp.)、和伊蚊(Aedes spp.)的方法，其基本上由下述步骤构成将三维空间暴露于有效的驱逐浓度和量的香叶醇或者含有香叶醇前体的组合物，该组合物基本上由50-100％香叶醇或者香叶醇前体(例如，香叶氧基-1，3，2-dioxaborinane、二香叶氧基二甲基甲硅烷和香叶基糖苷，例如，香叶基6-O-(α-L-吡喃鼠李糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)构成，该组合物的剩余物(如果组合物实际上不是100％香叶醇)为选自香茅醇和橙花醇构成的组的化合物。上面所述的驱虫剂被描述为照这样使用或者包含在下述聚合物中时是有用的，该聚合物可以是生物可降解的聚合物，如含有大部分聚(ε己内酯)均聚物的组合物。US 5,401,500、US 6,143,288、US 5,635,173和US 5,665,781描述了此类驱逐家蝇(DipteraMuscidae)和/或埃及伊蚊的方法，所述方法包括暴露于含有香叶醇的组合物，所述组合物基本上由50-100％的香叶醇组成，该组合物的剩余物为选自香茅醇和橙花醇构成的组的化合物。
US 5,753,686描述了从(i)扰血蝇Haematobia irritans(Linnaeus)(通常称作角蝇)；和(ii)Solenopsis invicta Buren(通常称作“红色外来火蚁”)的至少一种昆虫物种栖息的表面或者大块(volume)驱逐至少一种昆虫物种的方法，该方法由对所述表面或者所述体积应用“红色外来火蚁”和/或角蝇驱逐量和浓度的含有香叶醇的混合物的步骤组成，该混合物包含(i)按重量计0到高达约20％的橙花醇；(ii)按重量计约20到高达约40％的香茅醇；和(iii)按重量计约50到高达约70％的香叶醇，该香叶醇混合物根据附图中给出的特定GLC谱和所述专利的说明书中给出的折射率和密度定义。
含有香叶醇的产品可以以用作带、药巾和泵式喷雾瓶形式的驱虫剂商购得到。通过直接将液体喷雾在布或者皮肤上，香叶醇蒸发形成保护屏障制止吸血昆虫叮咬。已经证明这些产品有效抗蚊子、跳蚤、壁虱、黑蝇、蚋、恙螨、蠓和许多其它昆虫。
就本发明人所知，文献中还没有描述香叶醇作为苹果蠹蛾的驱虫剂。
发明内容
一方面，本发明涉及一种方法，用于鉴定通过β-葡糖苷酶对植物组织提取物的作用从它们的非挥发性糖苷释放的挥发性昆虫驱逐剂(repellent)和/或引诱剂。
通过在苹果叶子提取物中应用该方法，鉴定香叶醇为苹果蠹蛾(codling moth)驱虫剂，并鉴定水杨酸甲酯、(2R，5R)-和(2S，5R)-aspirane异构体、芳樟醇和苯甲醇为苹果蠹蛾引诱剂。
从而，在另一方面，本发明涉及用作苹果蠹蛾驱虫剂的包含香叶醇的组合物，以及通过用所述香叶醇驱虫剂组合物处理果园来驱逐果园中的苹果蠹蛾的方法。
在又一方面，本发明涉及包含水杨酸甲酯、aspirane异构体、芳樟醇、苯甲醇或者其组合的组合物，用作苹果蠹蛾引诱剂，还涉及通过用所述引诱剂组合物处理果园来引诱果园中苹果蠹蛾的方法。
在再一方面，本发明涉及通过用所述香叶醇驱虫剂和引诱剂组合物两者处理果园来综合控制果园中苹果蠹蛾的方法。
附图简述
图1显示了用重组β-葡糖苷酶(BGL1)和葡糖咪唑(glucoimidazole)(β-葡糖苷酶抑制剂)处理的苹果叶提取物的引诱。叶BGL1——使用β-葡糖苷酶处理的叶子提取物的陷阱；叶Inhi——使用葡糖咪唑处理的叶子提取物的陷阱；叶子——使用叶子提取物的使用；水——使用水的陷阱。相同的小写和大写字母分别表示在不同陷阱和陷阱周围捕获的昆虫数目没有显著差异，p＝0.05，多重Turkey检验。
图2A-2B显示了加入外部β-葡糖苷酶从苹果(cv.Anna)叶提取物释放的化合物的增加的水平。(2A)加入β-葡糖苷酶(BGL1)、葡糖咪唑(抑制剂)或者不加任何物质的苹果叶提取物的GC色谱。峰1，苯甲醇；2，芳樟醇；3，水杨酸甲酯；4，香叶醇；5，(2R，5R)-茶螺烷；6，(2S，5R)-茶螺烷。相同的字母表示在不同陷阱中捕获的昆虫数目没有显著差异，p＝0.05，多重Turkey检验。
图3显示了β-葡糖苷酶增强的化合物对苹果蠹蛾昆虫的引诱/驱逐效果。在具有成对陷阱和60只成虫的筛选笼中进行诱捕试验。记录陷阱中捕获的昆虫数目并通过t-检验(p＜0.05)分析。+G加入浓度为39.4ng ml-1的香叶醇；混合的在叶提取物中检测浓度下的所有引诱剂混合物。
发明详述一方面，本发明涉及一种方法，其用于鉴定通过β-葡糖苷酶对植物组织提取物的作用从非挥发性糖苷释放的挥发性昆虫驱逐剂和/或引诱剂，其包括(i)匀浆植物组织，并用提取缓冲液对植物组织匀浆物进行处理；(ii)用β-葡糖苷酶或者用β-葡糖苷酶抑制剂处理植物提取物；(iii)通过GC-MS鉴定步骤(ii)中释放的特定挥发物，相对于用β-葡糖苷酶抑制剂处理的提取物，在用β-葡糖苷酶处理的提取物中所述挥发物的水平提高；和(iv)测试步骤(iii)中鉴定的每种挥发物对昆虫行为的影响，从而，鉴定出是每种测试的昆虫的驱逐剂或者引诱剂的挥发物。
任何β-葡糖苷酶都可以用于本发明的方法中，优选重组的β-葡糖苷酶，可以使用任何β-葡糖苷酶抑制剂，其例如但不限于，葡糖咪唑。
在本申请中，用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中产生的重组黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡糖苷酶(下文中称作BGL1)来水解苹果树(Malus domestica，cv.Anna)叶子中存在的挥发物的糖苷。评估酶促释放的挥发性化合物对苹果蠹蛾成虫的行为的影响，与用葡糖咪唑处理的叶子提取物相比，用BGL1处理的叶子提取物中所述化合物的水平更高。
根据本发明，通过SPME-GC-MS分析从苹果树叶提取物(cv.Anna)释放的糖苷结合的挥发物，并在笼子生物测定中评价它们对苹果蠹蛾(CM)的行为影响。与含有葡糖咪唑的提取物相比，在含有黑曲霉β-葡糖苷酶(BGL1)的叶子提取物中，1-辛醇、芳樟醇、香叶醇、苯甲醇、水杨酸甲酯、(2R，5R)-茶螺烷和(2S，5R)-茶螺烷的水平显著提高。发现各化合物对CM成虫的吸引力遵循下面的递减顺序水杨酸甲酯和两种茶螺烷异构体的混合物，接着是芳樟醇和苯甲醇。发现香叶醇是CM成虫的驱逐剂。向各挥发物或者向这些引诱剂的混合物中加入香叶醇(39.4ng ml-1)消除了它们的引诱力。我们的数据表明可能应用香叶醇作为驱虫剂和水杨酸甲酯或者茶螺烷作为引诱剂用于苹果园中CM的综合控制。
本发明的一些实验的目的是通过宽特异性黑曲霉BGL1确定苹果叶中释放植物挥发物的潜力，和确定释放的挥发物和苹果的最重要昆虫苹果蠹蛾之间的潜在的相互作用。
从而，根据本发明，已经发现香叶醇是苹果蠹蛾的驱逐剂。
从而本发明涉及包含香叶醇的组合物，其用作苹果蠹蛾驱逐剂。
该组合物可以仅含有天然或者合成的香叶醇，或者它可以包含其它成分，如橙花醇和香茅醇，优选按重量计约50到高达(up to)约70％的香叶醇，按重量计0到约20％的橙花醇和按重量计约20到约40％的香茅醇。
根据本发明，还发现水杨酸甲酯、(2R，5R)和(2S，5R)茶螺烷异构体、芳樟醇和苯甲醇是苹果蠹蛾的引诱剂。
从而，本发明还涉及用作苹果蠹蛾的引诱剂的组合物，其包含选自水杨酸甲酯、茶螺烷(theaspirane)异构体、芳樟醇、苯甲醇和其组合的活性剂。这些引诱剂单独或者组合，可以用作诱饵增强剂用于剧毒毒素和/或诱捕装置。在优选实施方案中，引诱剂是甲基水杨酸酯、(2R，5R)茶螺烷、(2S，5R)茶螺烷，或者其组合。
如本文定义的挥发性昆虫驱除剂和引诱剂由于它们的快速蒸发和/或被所处理的基质吸收而具有相对短的保护期的缺点。吸收和蒸发这两种因素导致需要频繁应用，其是烦人的和耗时的。本领域已知的多种物质可以用于延长根据本发明的挥发性昆虫驱除剂和引诱剂的残留活性，并且它们都被本发明包括。
如本文定义的包含香叶醇或者苹果蠹蛾引诱剂的组合物可以与天然或者合成的相容聚合物组合，所述聚合物可以是或不是生物可降解的。聚合物可以是纤维素衍生物，其包括但不限于，纤维素醚，例如，甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素；纤维素酯，例如，乙酰基纤维素。聚合物还可以是基于明胶和其它材料的包衣材料，以制造携带或者包衣玉米淀粉的微型胶囊。聚合物还可以是高密度聚乙烯或者低密度聚乙烯，或者生物可降解的聚合物，如生物可降解的热塑性聚氨基甲酸酯、在主链中具有酯键的生物可降解的乙烯聚合物以及如美国专利号4,496,467；4,469,613和4,548,764(通过引用将它们并入本文)中公开的聚(ε-己内酯)均聚物。
本发明的组合物可以是可喷雾的，在该情况中，它还包含水性稀释剂，或者它可以是浓缩物，需要在水中稀释、分散或者溶解以提供可喷雾的组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的组合物包含含有香叶醇或者本发明的一种或多种引诱剂的微胶囊。这些微胶囊提供了一些优点，包括香叶醇或者引诱剂的缓释。此外，这些微胶囊可以足够小而可以合适地用于喷雾组合物，而不堵塞喷嘴。此外，香叶醇或者引诱剂将例如以小滴的形式“胶粘”或者有效保留在植物的叶子(例如，叶子或者其它光合器官)上或者树皮上。
在本发明的另一实施方案中，还可以将香叶醇或者引诱剂组合物掺入颗粒中，其能够缓慢并且以可控的方式释放。像上述微胶囊一样，颗粒存在于基质中并且以小滴或者小滴样单位分布。颗粒可以由小颗粒的无机载体或者有机聚合物，如本领域技术人员已知的那些组成。
本发明还提供了驱逐苹果蠹蛾的方法，其包括用包含香叶醇的苹果蠹蛾驱逐组合物处理所述苹果蠹蛾侵袭或者即将要被侵袭的环境。
本发明还涉及在限定的时间内驱逐苹果蠹蛾可居住的果园中苹果蠹蛾的方法，所述方法包括用香叶醇驱逐组合物处理果园。
另一方面，本发明涉及引诱果园中的苹果蠹蛾的方法，所述方法包括用选自水杨酸甲酯、茶螺烷异构体、芳樟醇、苯甲醇和其组合构成的组的引诱剂处理果园。
在一个实施方案中，本发明提供了将苹果园中的苹果蠹蛾引诱到昆虫陷阱的方法，其包括将所述陷阱周围的环境暴露于含有昆虫引诱剂的聚合物的步骤，所述聚合物由聚合物和所述聚合物的重量的至少1％的引诱剂的混合物组成，该引诱剂选自水杨酸甲酯、茶螺烷异构体、芳樟醇、苯甲醇和其组合构成的组。
本发明还涉及在限定的时间内综合控制苹果蠹蛾可居住的果园中苹果蠹蛾的方法，所述方法包括用香叶醇驱逐组合物和包含选自水杨酸甲酯、茶螺烷异构体、芳樟醇、苯甲醇和其组合构成的组的苹果蠹蛾引诱剂的组合物处理果园。
可以用香叶醇驱逐组合物和本发明的引诱组合物处理的果园是被苹果蠹蛾害虫攻击的果园，其包括苹果、梨、柑橘(quince)、核桃、山楂和海棠(crab apple)果园。在最优选的实施方案中，本发明的方法应用于苹果园，并且在结果季节对树进行喷雾。
现在将通过下面的非限定性实施例阐明本发明。
实施例材料和方法(i)昆虫-将CM Cydia pomonella L.的卵在培养皿中于室温下孵化。对幼虫喂饲人工食物(Manduca Premix-Heliothis Premix，StoneflyInc.，Bryan，TX)，在25±0.5℃、60±1％的相对湿度和16:8h(L:D)的光周期下保持直到第五龄幼虫，将其转移到波状纸条(corrugatedpaper strip)(2cm2)。当出现时，混合性别和年龄(2天内)的成年昆虫，用于笼子生物测定法。
(ii)苹果叶提取处理-2004年6月在以色列Rehovot的郊区中的商业果园切除具有叶子和果实的苹果(cv.Anna)树枝。从树枝切下叶子，用双蒸水(DDW)洗涤，然后用滤纸干燥。在液氮中匀浆干燥的叶子。向叶子匀浆物(每次处理4-5g)加入三倍重量的含有50mM柠檬酸盐缓冲液中的10mM EDTA和4mM DTT的冰预冷的提取缓冲液。然后将混合物在4℃旋转1h并在6,000g离心5分钟。收集上清液(每次处理10ml)。在一种处理中，加入巴斯德毕赤酵母中产生的1单位重组黑曲霉BGL1产物(Dan等人，2000)并将溶液在37℃保持4h。在另一处理中，加入提取缓冲液后立即向叶子匀浆物中加入2μM葡糖咪唑(β-葡糖苷酶抑制剂)，以便阻断任何内源β-葡糖苷酶活性。按照Shoseyov等人(1990)所述，使用对-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)作为底物，测定定量β-葡糖苷酶活性。
(iii)挥发物收集和GC-MS(气相色谱(GC)和质谱法(MS))分析-用包衣有100μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)的固相微萃取(SPME)纤维收集从叶子提取物和果汁释放的顶空挥发物。将纤维暴露于顶空挥发物30分钟。在SPME期间，瓶内的叶子提取温度为60℃，没有搅拌。然后在装备30m，0.25mm ID DB-5毛细管柱(J&W，Folson，CA)的Varian-3 GC-MS系统的注射口中用装载的SPME纤维解吸3分钟。通过Varian 8200自动采样器(Varian，Palo Alto，CA)精确控制采样和解吸时间。向每个样品加入3-辛醇(0.1ppm)作为内部标准。以独立的一式三份分析每个样品。根据Shalit等人(2003)设置GM-CS参数。注射器温度是250°，设置用于无分流注射。设置柱子为50℃1分钟，然后以4℃min-1的速率将温度升高到200℃。从45到450质荷比，用70eV的电子能记录质量范围。
通过将它们的质谱和保留数据与真实化合物的比较来鉴定多数挥发性化合物，所述真实化合物补充有Wiley质谱库(McLafferty，1994)和文献数据(Adams，1995)。通过相对于内部标准计算浓度来鉴定挥发物。通过内部标准峰的面积归一化挥发性组分峰的面积。
(iv)化学药品-多数合成的标准都从Sigma/Aldrich(St.Louis，MO)购买。纯度为98到99.5％。(2R，5R)-茶螺烷和(2S，5R)-茶螺烷的混合物来自Fluka(Buchs SG，Switzerland)。
(v)笼子生物测定法-基于Zhu等人(2003)的方法，在实验室中室温下(23℃±3℃)在筛选笼子(96×68×45cm)中进行诱捕测试。将混合性别和年龄(蛹出现后2天)的60只苹果蠹蛾成虫释放到笼子中，笼子含有使用不同处理的陷阱。从在中心具有孔(直径5mm)的白纸盖覆盖的100ml烧杯构造陷阱。Whatman纸芯(10cm长)用作分配器。为了检查向叶子提取物加入重组BGL1的效果，构造四个陷阱并放入相同的笼子中。第一个陷阱含有加入重组BGL1的10ml叶子提取物。第二个陷阱含有相同量的叶子提取物，其加入葡糖咪唑。第三个陷阱仅含有叶子提取物并且第四个陷阱含有水。在它们释放后12小时计数陷阱中或者陷阱周围捕获的昆虫。陷阱周围的昆虫如下定义将筛选笼子的空间等分成四部分。每个陷阱放入每个部分的中央。在实验中得到每个特定空间中存在的昆虫数目(不包括陷阱中的昆虫)。为了测试合成化合物的吸引力，首先用各化合物制备陷阱，首先将所述化合物溶解在乙醇中，通过用BGL1处理的叶提取物中的SPME-GC-MS分析确定化合物的浓度。乙醇的终浓度为0.01％。每个陷阱保持在笼中，其具有仅仅包括0.01％乙醇的对照水陷阱。过夜进行实验(从下午9点到上午9点)以覆盖在早晨黎明前它们的活动时间。每个实验重复5次，只是对照1-辛醇除外，其在初步实验中不显示出对苹果蠹蛾的行为活性。该实验重复3次。将陷阱随机安排在重复实验中以避免陷阱的可能的位置效应。因为昆虫信息素的复杂牵涉，跳过对捕获的昆虫的性别比例的研究。
实施例1. β-葡糖苷酶活性对苹果叶提取物对苹果蠹蛾成虫的吸引力/排斥的影响使用对-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)作为底物进行的定量β-葡糖苷酶活性测定证实了苹果叶提取物中内源β-葡糖苷酶的残留活性(0.24单位g-1鲜重.min-1)。用葡糖咪唑(Heightman和Vasella，1999)处理导致叶提取物中检测不到β-葡糖苷酶活性的水平。
含有苹果叶提取物和2μM葡糖咪唑的陷阱比含有叶提取物、叶提取物处理的BGL1或水的陷阱捕获了明显更多的成年苹果蠹蛾。此外，在叶加上抑制剂陷阱周围，比任何其它陷阱捕获明显更多的昆虫(
图1)。这些相当一致的结果提示β-葡糖苷酶活性释放的糖苷配基对苹果蠹蛾昆虫具有驱逐效果。此外，葡糖咪唑对β-葡糖苷酶活性的完全抑制和用该β-葡糖苷酶抑制剂处理的叶子提取物的显著吸引表明这些糖苷和β-糖苷酶位于完整叶子中不同的区间。
食植物昆虫对宿主食物香味的吸引或者定向反应可以通过损伤植物来增强或者增加。已经报导了苹果蠹蛾幼虫和成虫对其它苹果蠹蛾幼虫侵袭的苹果果实的增加的反应(Landolt等人，2000；Reed和Landolt，2002)。在该研究中，我们证明具有葡糖咪唑的粉碎的苹果叶保留它们对苹果蠹蛾成虫的吸引力。
实施例2.对用BGL1或者β-葡糖苷酶抑制剂处理的苹果叶提取物的GC-MS分析用SPME纤维收集用BGL1、β-葡糖苷酶抑制剂处理或者不处理的叶提取物的顶空挥发物并通过GC-MS分析。通过比较它们的质谱和保留指数与真实的合成标准品，对所检测的挥发物进行鉴定和定量。相对于用β-葡糖苷酶抑制剂处理的叶子提取物，用BGL1处理的叶子提取物中1-辛醇(CV，变异系数，32.6％)、芳樟醇(28.6％)、香叶醇(22.4％)、苯甲醇(32.1％)、水杨酸甲酯(41.9％)、(2R，5R)-茶螺烷(38.7％)和(2S，5R)-茶螺烷(32.4％)的水平显著增加(图2)，表明这些化合物主要作为糖苷存在于苹果树叶中。
与不存在外源β-葡糖苷酶或者β-葡糖苷酶抑制剂时的叶子提取物相比，黑曲霉BGL1从叶子提取物释放明显更多的糖苷配基。这可以反映黑曲霉BGL1和苹果β-葡糖苷酶之间的底物特异性的差异或者简单地反映了反应瓶中黑曲霉BGL1的更高的活性。
人们认为所鉴定的挥发物中的大部分是许多植物物种中的常见糖苷配基(Stahl-Biskup等人，1993)。关于苹果糖苷配基的数据相当有限。已经发现大量C13-noriprenoids作为糖苷键结合的芳族化合物存在于苹果果实和叶子中(Schwab和Schreier，1988；Stingl等人，2003)。然而，以前还没有关于香叶醇、水杨酸甲酯和茶螺烷异构体作为苹果糖苷配基的报导。
一些糖苷配基的存在也可以在苹果栽培种之间不同。在自然界中发现了非对映异构体茶螺烷(Schmidt等人，1992)。将它们中的两种鉴定为紫色西番莲(purple passion fruit)(Passiflora edulis Sims)中的糖苷配基(Winterhalter，1990)。Schmidt等人(1992)合成了在其感官性质明显不同的茶螺烷的四种异构体。发现(2R，5R)-茶螺烷具有弱的樟脑样标记，而(2S，5R)-茶螺烷显示出强的樟脑样，几乎萘样的标记。在该研究中，鉴定基于这两种合成的茶螺烷异构体标准品。根据我们的知识，这是首次报导茶螺烷异构体作为糖苷配基存在于苹果叶中。
仅在黑曲霉BGL1存在下检测到1-辛醇、苯甲醇和水杨酸甲酯。这可能是由于BGL1和内源苹果β-葡糖苷酶的底物特异性的不同或者对内源β-葡糖苷酶的无效提取。已知一些植物葡糖苷酶，如葡萄浆果葡糖苷酶是膜结合的酶(Günata等人，1998)。它们的提取需要特定条件。据详细记载，β-葡糖苷酶的糖苷配基部分特异性随着酶的来源而显著不同(Hsel和Conn，1982；Günata等人，1990；Babcock and Esen，1994)。在该研究中，在用葡糖咪唑处理的叶子提取物中检测到低水平的芳樟醇和茶螺烷，葡糖咪唑完全抑制测试条件中的β-葡糖苷酶活性，暗示在苹果叶中存在这些化合物的游离形式。Bengtsson等人(2001)还在“Jonathan”苹果叶的顶空检测到少量游离芳樟醇，但是他们没有提到茶螺烷。
应该知道，除了上面提到的化合物，从苹果叶提取物还释放了许多其它挥发物。因为GC-MS的有限的灵敏度，在苹果叶顶空中可能存在一些其他昆虫引诱剂或者驱逐剂。
实施例3.β-葡糖苷酶增强的化合物对苹果蠹蛾昆虫的引诱/驱逐效果在笼子生物测定中，将具有在叶提取物中检测的浓度的各自化合物的陷阱与仅含有水和乙醇的对照陷阱配对。化合物对成虫的吸引力遵循下降的顺序水杨酸甲酯和两种茶螺烷异构体的混合物，接着是芳樟醇，然后是苯甲醇。所有这些化合物都比作为空白的水更有吸引力(图3)。有趣的是，具有所有这些化合物的混合物的陷阱并不捕获最多的昆虫。根据我们的知识，这是首次报导将茶螺烷异构体作为苹果蠹蛾引诱剂。除了广泛接受的昆虫交配破坏技术(Calkins和Faust，2003)外，这些化合物可以用作成虫的大量捕获中的诱饵。
具有70ng ml-11-辛醇的陷阱不捕获任何昆虫，并且向其它化合物加入相同量的1-辛醇与仅仅这些化合物相比，不显著影响捕获的昆虫的数目(数据未示出)。这表明1-辛醇对于苹果蠹蛾成虫的行为没有显著影响。
显著地，39.4ng ml-1香叶醇对苹果蠹蛾成虫显示出驱逐效果。具有任一种前述引诱剂化合物加上相同量的香叶醇的陷阱不能捕获任何昆虫，这表明，该浓度的香叶醇消除了用于实验的这些化合物的吸引力。已经报导香叶醇作为一些商业驱蚊产品中的关键成分(Xue等人，2003)，并且作为柑橘植物的天然精油的主要成分(Matsuda等人，1996)，它已经作为生物驱蚊剂上市。
昆虫控制集中在对作物和动物的保护和维持公众健康。一个重要的领域涉及开发和生产环境安全的和无毒的驱虫剂。我们的结果表明在苹果蠹蛾的苹果植物宿主中，香叶醇作为失活的糖苷/苹果蠹蛾驱逐剂存在。仅当叶子损伤时，发生糖苷和β-葡糖苷酶的去隔室化，导致释放香叶醇。最近，我们已经证明在转基因烟草中表达黑曲霉β-葡糖苷酶基因(BGL1)导致完整和压碎的叶子中挥发物的显著改变(Wei等人，2004)。
实施例4.包含香叶醇的微胶囊通过首先将液体香叶醇吸收到磷酸三钙(TCP)中，然后用表1的第1-3和5行中，或如表1的第4行中所述的物质包衣来制备包含香叶醇的微胶囊表1.包含香叶醇的微胶囊
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权利要求
1.包含香叶醇的组合物，其用作苹果蠹蛾驱逐剂。
2.根据权利要求1的组合物，其中将香叶醇与其它成分如橙花醇和香茅醇混合。
3.根据权利要求2的组合物，其包含按重量计约50到高达约70％的香叶醇、按重量计0到高达约20％的橙花醇和按重量计约20到高达约40％的香茅醇。
4.根据权利要求1到3任一项的组合物，其中香叶醇或者香叶醇混合物包含在聚合物基质中。
5.根据权利要求1到4任一项的组合物，其为可喷雾的形式。
6.根据权利要求1到4任一项的组合物，其作为浓缩物提供，用于在水中稀释、分散或者溶解，以提供可喷雾的组合物。
7.根据权利要求1到6任一项的组合物，其包含含有香叶醇或者香叶醇混合物的微胶囊。
8.根据权利要求7的组合物，其用于香叶醇或者香叶醇混合物的缓慢释放。
9.驱逐苹果蠹蛾的方法，其包括用包含香叶醇的苹果蠹蛾驱逐组合物处理受到所述苹果蠹蛾侵袭或者即将能够被所述苹果蠹蛾侵袭的环境。
10.根据权利要求9的方法，其中所述组合物包含与其它成分如橙花醇和香茅醇形成的香叶醇混合物。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述组合物是可喷雾的组合物，其包含含有香叶醇或者香叶醇混合物的微胶囊。
12.根据权利要求9到11任一项的方法，其中所述环境是果园，包括梨、苹果、柑橘、核桃、山楂和海棠果园。
13.根据权利要求12的方法，其中所述果园是苹果园。
14.根据权利要求12或13的方法，其中所述组合物在所述果园中喷雾。
15.驱逐苹果园中的苹果蠹蛾的方法，所述方法包括用香叶醇驱逐剂组合物处理苹果园。
16.用作苹果蠹蛾引诱剂的组合物，其包含选自由水杨酸甲酯、茶螺烷异构体、芳樟醇、苯甲醇和其组合构成的组的活性剂。
17.根据权利要求16的组合物，其中所述活性剂是水杨酸甲酯、(2R，5R)茶螺烷、(2S，5R)茶螺烷或者其组合。
18.根据权利要求16或17的组合物，其中所述引诱剂或者其组合包含在聚合物基质中。
19.根据权利要求16到18任一项的组合物，其为可喷雾的形式。
20.根据权利要求16到18任一项的组合物，其作为浓缩物提供，用于在水中稀释、分散或者溶解以提供可喷雾的组合物。
21.根据权利要求16到20任一项的组合物，其为微胶囊的形式。
22.根据权利要求21的组合物，其用于缓慢释放苹果蠹蛾引诱剂或者引诱剂组合。
23.将苹果蠹蛾吸引到昆虫陷阱的方法，其包括用选自由水杨酸甲酯、茶螺烷异构体、芳樟醇、苯甲醇和其组合构成的组的苹果蠹蛾引诱剂处理所述陷阱周围受到苹果蠹蛾侵袭或者即将能够被苹果蠹蛾侵袭的环境。
24.根据权利要求23的方法，其中所述环境是果园，包括梨、苹果、柑橘、核桃、山楂和海棠果园。
25.根据权利要求24的方法，其中所述果园是苹果园。
26.综合控制果园中苹果蠹蛾的方法，其包括用包含香叶醇的苹果蠹蛾驱逐剂组合物和包含选自由水杨酸甲酯、茶螺烷异构体、芳樟醇、苯甲醇和其组合组成的组的引诱剂的苹果蠹蛾引诱剂组合物处理受到苹果蠹蛾侵袭或者即将能够被苹果蠹蛾侵袭的果园环境。
27.一种用于鉴定挥发性昆虫驱逐剂和/或引诱剂的方法，所述昆虫驱逐剂和/或引诱剂是通过β-葡糖苷酶对植物组织提取物的作用，从它们的非挥发性葡糖苷释放的，该方法包括(i)匀浆植物组织并用提取缓冲液对植物组织匀浆物进行处理；(ii)用β-葡糖苷酶或者用β-葡糖苷酶抑制剂处理植物提取物；(iii)通过GC-MS鉴定步骤(ii)中释放的特定挥发物，相对于用β-葡糖苷酶抑制剂处理的提取物，在用β-葡糖苷酶处理的提取物中所述挥发物的水平提高；和(iv)测试步骤(iii)中鉴定的每种挥发物对昆虫行为的影响，从而，鉴定出是每种测试的昆虫的驱逐剂或者引诱剂的挥发物。
28.根据权利要求27的方法，其中所述β-葡糖苷酶是重组β-葡糖苷酶，所述β-葡糖苷酶抑制剂是葡糖咪唑。
全文摘要
本发明涉及一种用于鉴定挥发性昆虫驱逐剂和/或引诱剂的方法，所述昆虫驱逐剂和/或引诱剂是通过β－葡糖苷酶对植物组织提取物的作用，从它们的非挥发性葡糖苷释放的。通过该方法，将香叶醇鉴定为苹果蠹蛾驱除剂，将水杨酸甲酯、(2R，5R)－茶螺烷和(2S，5R)－茶螺烷，以及在较低的程度上，将芳樟醇和苯甲醇鉴定为苹果蠹蛾引诱剂。本发明提供了包含所述驱逐剂和引诱剂的组合物和控制果园，优选苹果园中苹果蠹蛾的方法。
文档编号A01N31/02GK101072501SQ200580034693
公开日2007年11月14日 申请日期2005年10月11日 优先权日2004年10月13日
发明者O·索塞约夫, S·韦, I·弗卢克斯曼 申请人:Efal化学工业有限公司, 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司